MASARYKOVA UNIVERZITA Lékařská fakulta BAKALÁŘSKÁ PRÁCE Anna Kadlecová

Transkript

1 MASARYKOVA UNIVERZITA Lékařská fakulta BAKALÁŘSKÁ PRÁCE 2016 Anna Kadlecová

2 MASARYKOVA UNIVERZITA LÉKAŘSKÁ FAKULTA OXYCHOLESTEROL Bakalářská práce v oboru Nutriční terapeut Vedoucí bakalářské práce: RNDr. Ondřej Zvěřina, Ph.D. Autor: Anna Kadlecová Brno, květen 2016

3 Jméno a příjmení autora: Anna Kadlecová Studijní obor: Nutriční terapeut Název bakalářské práce: Oxycholesterol Pracoviště: Masarykova univerzita, Lékařská fakulta, Ústav ochrany a podpory zdraví Vedoucí bakalářské práce: RNDr. Ondřej Zvěřina, Ph.D. Rok obhajoby bakalářské práce: 2016 Počet stran: 78 Anotace: Tato bakalářská práce shrnuje současné informace o oxycholesterolech. V teoretické části je popsána struktura oxycholesterolů, jejich vznik, výskyt a účinek na lidský organismus. V praktické části je porovnán průměrný denní přívod oxycholesterolů ve stravě vegetariánů a běžně se stravujících jedinců. Klíčová slova: Oxycholesterol, oxidační produkty cholesterolu, COPs Annotation: This bachelor s thesis summarizes the actual information about oxycholesterols. The theoretical part describes structure of oxycholesterols, how they are formed, their occurence and their effect on the human health. In the practical part the average daily intake of oxycholesterols of vegetarians and non-vegetarians is estimated. Key words: Oxycholesterol, cholesterol oxidation products, COPs

4 Prohlášení Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci vypracovala samostatně pod vedením RNDr. Ondřeje Zvěřiny, Ph.D. a v seznamu literatury jsem uvedla všechny použité literární a odborné zdroje. Souhlasím s tím, aby práce byla půjčována ke studijním účelům a byla citována dle platných norem. V Brně dne Anna Kadlecová

5 Poděkování Tímto bych ráda poděkovala vedoucímu mé práce RNDr. Ondřeji Zvěřinovi, Ph.D. za pomoc, cenné rady a zpětnou vazbu při vypracovávání této práce. Dále bych chtěla poděkovat Mgr. Janě Stávkové za poskytnutou pomoc při zpracovávání kazuistik a všem, kteří mi poskytli informace pro vypracování praktické části této bakalářské práce.

6 Obsah 1 Úvod Oxycholesterol Definice a struktura Vznik oxycholesterolů Endogenní zdroje oxycholesterolů Exogenní zdroje oxycholesterolů Oxycholesteroly v potravinách Vejce a vaječné výrobky Mléko a mléčné výrobky Maso, masné výrobky Ryby, ostatní vodní živočichové a výrobky z nich Oxycholesterol v lidském těle Absorpce a distribuce Metabolismus a eliminace Účinky oxycholesterolů v lidském organismu Cytotoxicita a proapoptický efekt oxycholesterolů Prozánětlivý efekt oxycholesterolů Oxycholesteroly a ateroskleróza Oxycholesteroly a diabetes mellitus Oxycholesteroly a proces karcinogeneze Oxycholesteroly a Alzheimerova choroba Prevence a minimalizace negativních účinků oxycholesterolů Praktická část Cíl a metodika Kazuistiky Diskuze Závěr Seznam použité literatury Seznam obrázků Seznam tabulek Seznam příloh Přílohy... 74

7 Seznam zkratek ACAT acyl-coacholesterolacyltransferáza BMI body mass index CO alkoxylový radikál COO peroxylový radikál COPs oxidační produkty cholesterolu COX-2 cyklooxygenáza-2 CYP27A1 sterol 27-hydroxyláza CYP46A1 cholesterol 24-hydroxyláza DACH seskupení německy mluvících států (Německo, Rakousko, Švýcarsko) DNA deoxyribonukleová kyselina EPIC European Prospective Investigation into Cancer and Nutrition HDL lipoprotein s vysokou hustotou ICAM-1 intercelulární adhezní molekula-1 LCAT lecitin-cholesterolacyltransferáza LDL lipoprotein s nízkou hustotou LXR jaterní X receptor MCP-1 monocytární chemotaktický protein-1 MUFA mononenasycené mastné kyseliny NADPH nikotinamidadenindinukleotidfosfát NPC1-L1 Nieman-Pick C1-like protein POPs oxidační produkty fytosterolů PUFA polynenasycené mastné kyseliny SAFA nasycené mastné kyseliny SREBPs proteiny vázající se na sterol-regulující element UHT ultravysoká teplota VCAM-1 vaskulární adhezivní molekula-1 VLDL lipoprotein s velmi nízkou hustotou

8 1 Úvod Oxycholesteroly představují širokou skupinu oxidačních produktů cholesterolu, které vznikají přímo v lidském těle nebo v potravinách živočišného původu. Ve velkém množství vznikají například při vystavení potraviny obsahující cholesterol vysoké teplotě, přítomnosti kyslíku, světlu a dalším prooxidačním faktorům. Oxycholesteroly jsou spojovány s iniciací a progresí závažných chronických onemocnění. Mezi nejvýznamnější patří ateroskleróza, dále se podílí například na rozvoji nádorových onemocnění, diabetu mellitu 2. typu a Alzheimerovy choroby. Zdroje oxycholesterolů, jejich vznik a působení v organismu doposud nejsou dostatečně popsány. Zatímco zahraniční odborná literatura se oxidačním produktům cholesterolu věnuje téměř třicet let, do širšího českého povědomí se tato problematika dostává až v posledních letech. Teoretická část bakalářské práce shrnuje současné poznatky o oxychlesterolech, popisuje jejich vznik a hlavní faktory, které jejich tvorbu ovlivňují. Dále se práce zaměřuje na výskyt a množství oxycholesterolů v různých potravinách. Významná část textu je věnována působení oxycholesterolů na lidský organismus a jejich spojení s chronickými onemocněními. Cílem praktické části bakalářské práce je zjistit a porovnat dietární přívod oxycholesterolů u jedinců s různým způsobem stravování. 6

9 2 Oxycholesterol 2.1 Definice a struktura Oxycholesteroly jsou oxidační produkty cholesterolu (COPs) a společně s oxidačními produkty fytosterolů (POPs) se řadí mezi oxysteroly (Otaegui-Arrazola et al. 2010). Cholesterol je hlavním steroidem savců a v těle se vyskytuje volně nebo jako ester nasycených a nenasycených mastných kyselin. Je vytvářen přímo v těle z acetyl-koenzymu A nebo je vstřebáván z živočišných potravin. Cholesterol je výchozí látkou pro syntézu dalších steroidů, mezi nejvýznamnější patří hormony (glukokortikoidy, mineralokortikoidy, androgeny, gestageny a estrogeny), vitamin D3 a žlučové kyseliny (Belitz et al. 2009; Silbernagl a Lang 2012). Oxycholesteroly vznikají oxidací cholesterolu na postranním řetězci nebo ve sterolovém kruhu. Názvy jednotlivých oxycholesterolů jsou zkracovány podle čísla uhlíku cholesterolu, na kterém proběhla oxidace (viz Obr. 1 a Příloha 1). Nejvýznamnější oxidační produkty cholesterolu jsou 7α-hydroxycholesterol, 7β-hydroxycholesterol, 7-ketocholesterol, 20-hydroxycholesterol, 24-hydroxycholesterol, 25-hydroxycholesterol, 27-hydroxycholesterol, 5α,6α-epoxycholesterol, 5β,6β-epoxycholesterol a 3β,5α,6β-cholestantriol (Otaegui-Arrazola et al. 2010). Obr. 1: Struktura a číslování uhlíků cholesterolu a příklad struktury oxycholesterolů, upraveno podle Gill et al. (2008) 7

10 2.2 Vznik oxycholesterolů Přítomnost oxycholesterolů v plazmě můžeme vysvětlit více způsoby. Oxycholesteroly mohou vznikat endogenně, přímo v lidském těle, různými oxidačními procesy v buňkách, krvi a v játrech. Zároveň se oxidační produkty cholesterolu mohou dostat do těla exogenně vstřebáním z potravin, kde vznikají při oxidaci lipidů např. během tepelné úpravy, uchovávání při přístupu kyslíku nebo vystavení slunečnímu záření (Otaegui-Arrazola et al. 2010) Endogenní zdroje oxycholesterolů Cholesterol vytvořený v těle nebo vstřebaný ze stravy podstupuje různé metabolické procesy v buňkách. Oxidační produkty cholesterolu mohou vznikat neenzymatickými reakcemi vyvolanými volnými radikály nebo enzymaticky (viz Obr. 2). Oxidace sterolového kruhu probíhá neenzymaticky, zatímco oxidace postranního řetězce je reakcí enzymatickou. Existují i výjimky, 7α- a 25-hydroxycholesterol mohou vznikat oběma metabolickými cestami (Gill et al. 2008; Otaegui-Arrazola et al. 2010). Obr. 2: Enzymatická a neenzymatická tvorba oxycholesterolů (Otaegui-Arrazola et al. 2010) 8

11 Neenzymatická oxidace Neenzymatická oxidace probíhá narušením struktury cholesterolu reaktivními formami kyslíku, z uhlíku C-7 sterolového kruhu se odštěpí vodík. Takto vytvořený radikál může reagovat s kyslíkem a vytvořit cholesterolový peroxylový radikál (COO ), který později přijme vodík a stane se relativně stabilní sloučeninou 7α- nebo 7β-hydroperoxycholesterolem. 7α- a 7β-hydroperoxycholesterol jsou hlavními oxycholesteroly, které jsou vytvořeny během prvních fází neenzymatických reakcí cholesterolu. Oproti ostatním oxidačním produktům jsou málo zastoupeny v tkáních, pravděpodobně díky dalším procesům na hydroxyperoxidové skupině (neenzymatická oxidace nebo enzymatická redukce). Za přítomnosti přechodných kovů, jsou hydroperoxidy cholesterolu dále rozloženy na cholesterol 7α- nebo 7β-alkoxy radikály (CO ), které podstupují další reakce. Vzniká 7α- nebo 7β-hydroxycholesterol a jejich dehydratací vzniká 7-ketocholesterol, tyto oxycholesteroly jsou nejvíce zastoupené v tkáních (Brown a Jessup 1999, 2009). Enzymatická oxidace 24-, 25-, 27- a 7α-hydroxycholesterol jsou oxycholesteroly, které vznikají převážně enzymatickými reakcemi. Každý z těchto oxycholesterolů je tvořen speciálním enzymem (viz Obr. 3) (Russell 2000; Rozner a Garti 2006). Enzymy sterol 27-hydroxyláza, cholesterol 25-hydroxyláza a cholesterol 24-hydroxyláza jsou umístěny v membránách buněk a pro syntézu oxycholesterolů využívají kofaktor NADPH. Enzymy se od sebe liší v aminokyselinové sekvenci, v tkáňové distribuci a v subcelulární lokalizaci (Russell 2000). Obr. 3: Enzymatická tvorba oxycholesterolů (Russell 2000) 9

12 Sterol 27-hydroxyláza (CYP27A1) je mitochondriální enzym řazený mezi cytochromy P450 exprimovaný v mnoha tkáních, hlavně v játrech a makrofázích. CYP27A1 katalyzuje přidání hydroxylové skupiny na boční řetězec cholesterolu za vzniku 27-hydroxycholesterolu a také dalších 27-hydroxylovaných sterolů. Tento enzym katalyzuje první krok v alternativní cestě syntézy žlučových kyselin. Sterol 27-hydroxyláza zajišťuje homeostázu cholesterolu odstraňováním cholesterolu z extrahepatálních tkání a udržuje hladinu vitaminu D v krvi. Genetický deficit tohoto enzymu způsobuje onemocnění cerebrotendinózní xantomatózu (Rosen et al. 1998; Brown a Jessup 2009). Cerebrotendinózní xantomatóza je vzácné autozomálně recesivní onemocnění. Mutace genu pro sterol 27-hydroxylázu vede ke snížení syntézy žlučových kyselin a k nadměrné produkci cholestanolu, který se společně s cholesterolem hromadí v tkáních. Hromadí se zvláště v nervovém systému, aterosklerotických placích a šlachových xantomech. Onemocnění se vyznačuje různými klinickými projevy: motorickou dysfunkcí (spastická paréza, ataxie, expresivní dysfázie), šlachovými xantomy, kataraktou, předčasnou aterosklerózou nebo neurologickými onemocněními (demence, epilepsie, psychiatrické poruchy) (Fernandes 2008; Nie et al. 2014). Prevalence tohoto onemocnění se odhaduje na 3 5 případů na jedinců populace (Lorincz et al. 2005). Cholesterol 24-hydroxyláza (CYP46A1) také patří do rodiny enzymů cytochromu P450 a má dva hlavní úkoly v metabolismu lipidů. Podílí se na transportu cholesterolu z mozku a syntetizuje ligand, který aktivuje LXR jaderné receptory (jaterní X receptor). Cholesterol 24-hydroxyláza se vyskytuje v endoplazmatickém retikulu neuronů, kde přeměňuje přebytek cholesterolu na 24-hydroxycholesterol. 24-hydroxycholesterol je snadno vylučován z centrálního nervového systému, neboť prochází přes hematoencefalickou bariéru, do plazmy. Cholesterol 24-hydroxyláza tak zajišťuje homeostázu cholesterolu v mozku. 24-hydroxycholesterol se poté metabolizuje na žlučové kyseliny. Exprese enzymu probíhá pouze v neuronech mozkové kůry, hypotalamu, gyrus dentatus (součást limbického systému) a v Purkyňových buňkách mozečku. Mozek je hlavním zdrojem cirkulujícího 24-hydroxycholesterolu v plazmě. Cholesterol 24-hydroxyláza není překvapivě detekována v buňkách, které produkují na cholesterol bohatý myelin (gliové buňky a oligodendrocyty), ani v dalších typech podpůrných buněk (např. v astrocytech) (Lund et al. 1999; Björkhem et al. 1999). Velké množství cholesterol 24-hydroxylázy bylo detekováno v neuronech sítnice. 24-hydroxycholesterolu bylo v neuronech sítnice naměřeno 3,4 ng/μg cholesterolu a v mozku pouze 0,68 2,19 ng/μg cholesterolu (Lütjohann et al. 1996; Bretillon et al. 2007). 10

13 24-hydroxycholesterol je významným ligandem receptoru LXR. LXR je jaderný receptor, který po navázání ligandu slouží jako transkripční faktor, který reguluje metabolismus lipidů. LXR regulují genovou expresi vazbou na DNA sekvence cílových genů. Když se zvýší množství oxycholesterolů v důsledku vyšší koncentrace cholesterolu, LXR indukuje transkripci genů, které chrání buňky před přetížením cholesterolem. LXR udržuje homeostázu cholesterolu prostřednictvím syntézy, metabolismu a vylučování žlučových kyselin, ovlivněním biosyntézy, absorpce a vylučování cholesterolu (Janowski et al. 1996; Zhao a Dahlman-Wright 2010). 25-hydroxycholesterol je tvořený z cholesterolu enzymem cholesterol 25-hydroxylázou. Cholesterol 25-hydroxyláza je enzym, který obsahuje nehemové železo. V buňkách je tento enzym lokalizován v endoplazmatickém retikulu a Golgiho aparátu. Cholesterol 25-hydroxyláza má důležitou regulační úlohu v metabolismu cholesterolu syntézou 25-hydroxycholesterolu, který je inhibitorem na SREBPs (proteiny vázající se na sterol-regulující element) (Lund 1998; Russell 2000). Tyto proteiny jsou syntetizovány jako neaktivní prekurzory v membránových oblastech buňky. Při poklesu intracelulární hladiny cholesterolu se SREBPs aktivují odštěpením koncové části řetězce, migrují do jádra a aktivují transkripci genů, které se podílejí na syntéze a přívodu cholesterolu (Brown a Goldstein 1997). První krok klasické tvorby žlučových kyselin je vznik 7α-hydroxycholesterolu za pomoci enzymu 7α-hydroxylázy CYP7A1 (Gill et al. 2008) Exogenní zdroje oxycholesterolů Oxidační produkty cholesterolu vznikají i v potravinách a do organismu se mohou dostat vstřebáním ze stravy. Všechny potraviny obsahující cholesterol jsou potenciálním zdrojem oxycholesterolů. Zdroji cholesterolu a tedy i oxycholesterolů jsou potraviny živočišného původu: vejce a vaječné výrobky, mléko a mléčné výrobky, maso a výrobky z masa (Otaegui-Arrazola et al. 2010). Americká kardiologická asociace (American Heart Association) stanovila maximální bezpečný denní přívod cholesterolu na 300 mg pro zdravé jedince (Otaegui-Arrazola et al. 2010). Podle studie EPIC (European Prospective Investigation into Cancer and Nutrition) na obyvatelích kraje Norfolk v Anglii je průměrný přívod cholesterolu 260 mg (Andersson et al. 2004). Podle Ministerstva zdravotnictví České republiky byl v roce 2014 u žen a dětí přívod cholesterolu v normě, u mužů vyšší mg/den (Antošová et al. 2014). Oxycholesteroly byly měřeny v mnoha potravinách. Jejich výskyt je vysoký hlavně v sušeném vaječném žloutku, másle a pečeném mase (viz kapitola 2.3). Kvantifikace oxidačních produktů je velice obtížná, obsah jednotlivých oxycholesterolů je ve stejných typech potravin velice různorodý. Existuje mnoho faktorů, které tvorbu oxidačních produktů cholesterolu 11

14 ovlivňují. Proto je třeba brát kvantitativní hodnoty nalezené v literatuře s jistým nadhledem (Belitz et al. 2009; Otaegui-Arrazola et al. 2010). Potraviny obsahující cholesterol jsou náchylné k oxidaci ještě před vstupem do organismu v závislosti na různých faktorech, které na potraviny působí během úpravy a skladování. Faktory, které vedou ke zvýšené produkci oxycholesterolů v potravinách, jsou vysoká teplota, světlo, přítomnost kyslíku, aktivita vody, nízké ph a některé další prooxidační faktory. Procesy úpravy potravin, jako je například vaření, sušení, mražení, dehydratace a ozařování, mají za následek zvýšenou produkci oxidačních produktů cholesterolu v potravinách (Savage et al. 2002). Za všech těchto podmínek jsou potraviny vystaveny reaktivním kyslíkovým radikálům, jako je například singletový kyslík ( 1 O2), peroxid vodíku (H2O2) a hydroxyskupina (HO - ) (Addis 1986). Množství vzniklých oxidačních produktů v potravině je ovlivněno způsobem uchovávání, balení potravin, aktivitou vody v potravině a dobou, po kterou byla potravina vystavena faktoru. Množství oxidačních produktů cholesterolu v potravinách většinou dosahuje hodnoty 1 % z celkového množství cholesterolu, ale v některých případech i více než 10 % (Hur et al. 2007; Sieber 2005). Z mnoha známých oxycholesterolů se v potravinách nejčastěji vyskytují 7α-, 7β-, 20α-, 25-hydroxycholesterol, 7-ketocholesterol, 5α,6α-, 5β,6β-epoxycholesterol a 3β,5α,6β-cholestantriol (Savage et al. 2002). Při vzniku oxidačních produktů cholesterolu v potravinách dochází ke stejným reakcím jako při endogenní syntéze. Mechanismus oxidace cholesterolu je podobný oxidaci lipidů (Maerker 1987). Cholesterol je molekula s nenasycenou dvojnou vazbou, a proto je náchylný k oxidaci. Kromě reaktivních forem kyslíku se na oxidaci exogenního cholesterolu podílejí peroxylové (COO ) nebo alkoxylové (CO ) radikály, které vznikají při peroxidaci lipidů, hlavně nenasycených mastných kyselin (Leonarduzzi et al. 2002). Oxidace cholesterolu může být iniciována odnětím vodíku (převážně v poloze C-7), následnou adicí atomu kyslíku vzniká 7α- nebo 7β-hydroperoxycholesterol. Tyto hydroperoxidy se rychle rozkládají na 7α- a 7β-hydroxycholesterol a jejich dehydratací vzniká 7-ketocholesterol. Tyto relativně stabilní oxycholesteroly se již běžně vyskytují v potravinách (Smith 1996). 5α,6α- a 5β,6β-epoxycholesterol jsou produkty oxidace cholesterolu, kdy je dvojná vazba cholesterolu mezi uhlíky 5 a 6 oxidována 7-hydroperoxycholesterolem (Maerker 1987). Jejich dalším zdrojem je přímá reakce volných kyslíkových radikálů s dvojnou vazbou cholesterolu. Dehydratací může z epoxidu vzniknout 3β,5α,6β-cholestantriol. Oxidací na bočním řetězci 12

15 cholesterolu vznikají 20- a 25-hydroxycholesterolové deriváty. Zatímco superoxidový radikál je neefektivní v iniciaci oxidačních reakcí, přítomnost volných radikálů a peroxidu vodíku má silný prooxidační efekt (Lee et al. 1997; Valenzuela et al. 2003). Faktory ovlivňující vznik oxycholesterolů v potravinách V řadě potravin se zjišťovalo množství oxycholesterolů po vystavení podmínkám, které podporují oxidaci cholesterolu. Mezi podmínky, které ovlivňují vznik oxycholesterolů, patří tepelná úprava potravin, vystavení světlu, doba skladování a přítomnost prooxidačních nebo antioxidačních faktorů (Hur et al. 2007; Otaegui-Arrazola et al. 2010). Tepelná úprava pokrmů Tepelné zpracování potravin má na rychlost oxidace lipidů velký vliv. Zvýšení teploty urychluje propagaci (napadání substrátu a tvorbu radikálů) reakce a také rozklad lipidů, což zvyšuje koncentraci volných radikálů pro iniciaci a propagaci oxidace lipidů (Soupas et al. 2004). Vliv teploty a doby vystavení této teplotě na oxidaci cholesterolu byl zjišťován v mnoha studiích. Ve studii Xu et al. (2009) porovnávali koncentrace oxycholesterolů ve vzorcích cholesterolu, které byly vystaveny teplotě 180 C (teplota typická pro smažení), po 30, 60, 90 a 120 minutách záhřevu. Po 120 minutách bylo zoxidováno až 75 % cholesterolu ve vzorku. Vznik oxycholesterolů nevykazoval konzistentní nárůst v čase a po 90. minutě dokonce obsah mírně klesal. Po 30 minutách při teplotě 125 C byl obsah oxycholesterolů 27% z celkové koncentrace cholesterolu ve vzorku, při 150 C byl obsah oxycholesterolů více než 70%, při 175 C více než 90%. Při teptotě 200 C byl po 10 minutách obsah oxycholesterolů 90% z počáteční koncentrace cholesterolu ve vzorku (Xu et al. 2005). Tyto výsledky odpovídají i studii Chien et al. (1998), ve kterém bylo degradováno 64,8 % cholesterolu po 30 minutách zahřívání při teplotě 150 C a 88 % při teplotě 175 C. Pouze 11 % původního cholesterolu bylo zachováno po zahřívání při teplotě 200 C po dobu 10 minut. Tyto výsledky ukazují, že ztráta cholesterolu ohřevem je extrémně rychlá při teplotě nad 175 C (Xu et al. 2005). Degradace cholesterolu při zahřívání vzorku o koncentraci cholesterolu 10 mg/ml po dobu 60 minut při teplotě 100 C téměř vůbec neprobíhala. Tato studie poukázala na vysokou tepelnou stabilitu cholesterolu. Při teplotě 150 C byla ztráta cholesterolu ve vzorku 46% (Yen et al. 2010). Mnoho studií zjišťovalo, jaký vliv mají různá tepelná zpracování pokrmů na tvorbu oxidačních produktů cholesterolu v konkrétních potravinách. Tyto studie s konkrétními vzorky potravin, poukazují na přímý vliv tepelné úpravy pokrmů (teploty a doby působení dané teploty) 13

16 na tvorbou oxycholesterolů. Vznik oxycholesterolů při zpracovávání potravin ovlivňuje i složení samotné potraviny, použitý olej nebo další suroviny užívané v receptuře pokrmu (ph pokrmu, obsah antioxidantů) a i tyto faktory byly při tepelné úpravě pokrmů sledovány (Otaegui-Arrazola et al. 2010). Vliv způsobu tepelné úpravy na vznik oxycholesterolů byl zjišťován například tak, že plátky lososa silné 1,5 cm byly zpracovány různým způsobem. Dva vzorky byly smažené při teplotě 180 C po dobu 4 minut v pánvi, první na 30 ml olivového oleje a druhý vzorek na 30 ml sójového oleje. Třetí vzorek se pekl v troubě s 45 ml olivového oleje při teplotě 200 C po dobu 30 minut. Po tepelné úpravě se analyzoval obsah oxycholesterolů a porovnával se syrovým vzorkem. Celkem se obsah oxidačních produktů cholesterolu zvýšil z 0,74 ng/g tuku v syrovém vzorku lososa na 2,98 ng/g tuku ve vzorku lososa smažené na olivovém oleji, na 3,35 ng/g ve vzorku smaženém na sójovém oleji a na 7,38 ng/g tuku v pečeném vzorku lososa. Celkové hodnoty oxychlesterolu představovali 0,01 %, 0,08 %, 0,09 % a 0,15 % z obsahu cholesterolu v syrovém, smaženém na olivovém oleji, smaženém na sójovém oleji a pečeném vzorku lososa. Nejvyšší obsah oxycholesterolů v pečeném vzorku odpovídal i nejvyššímu indexu kyselosti tohoto vzorku. Index kyselosti je parametr, který vyjadřuje obsah volných mastných kyselin produkovaných během lipolýzy. Pečený vzorek vykázal nejvyšší index kyselosti pravděpodobně v důsledku vystavení vyšší teplotě na delší dobu (200 C, 30 min). Celkový obsah oxycholesterolů významně koleroval s hodnotami indexu kyselosti v analyzovaných vzorcích (Echarte et al. 2001). Echarte et al. (2003) analyzovali oxycholesteroly ve dvou typech komerčně vyráběných karbanátcích (kuřecích a hovězích) a porovnávali účinky dvou metod tepelného zpracování (mikrovlnného ohřevu a osmažení na olivovém oleji) na složení lipidů a na proces oxidace cholesterolu v karbanátcích. Mikrovlnná úprava probíhala po dobu 3 minut při výkonu 900 W. Vnitřní teplota vzorků byla na konci procesu 100 C. Smažení se provádělo v pánvi s 10 ml olivového oleje po dobu 3 minut na obou stranách. Teplota oleje při zahájení tohoto procesu byla 180 C. Konečná vnitřní teplota karbanátků byla C. Obsah oxycholesterolů v karbanátcích z hovězího masa byl 2,31 µg/g tuku v syrovém, 3,41 µg/g tuku ve smaženém a 12,26 µg/g tuku v mikrovlnné troubě zpracovaném vzorku. V karbanátcích z kuřecího masa byl obsah oxycholesterolů 4,01 µg/g tuku v syrovém, 10,75 µg/g tuku ve smaženém a 24,63 µg/g tuku v mikrovlnné troubě zpracovaném vzorku. Kuřecí karbanátky, syrové i tepelně opracované, mají obsah oxycholesterolů až dvakrát vyšší než odpovídající karbanátky z hovězího masa. Vyšší oxidační potenciál lipidů v kuřecím mase ve srovnání s hovězím a vepřovým masem se vysvětluje vyšším obsahem polynenasycených mastných kyselin v mase kuřecím (Rhee et al. 14

17 1996). Celkový přírůstek oxidačních produktů cholesterolu byl tedy 5,3 6,1 násobný oproti původnímu obsahu oxycholesterolů ve vzorku při ohřevu v mikrovlnné troubě a 1,5 2,6 násobný při smažení na olivovém oleji. Z toho vyplývá, že mikrovlnný ohřev způsobuje vyšší tvorbu oxidačním produktů cholesterolu v potravinách (Echarte et al. 2003). Vaječné těstoviny obsahují cholesterol a během zpracování vznikají i jeho oxidační produkty. V syrových čerstvých vaječných těstovinách byl obsah oxycholesterolů 66,44 µg/g cholesterolu. Obsah oxycholesterolů v tepelně neopracovaných těstovinách je vysvětlován používáním pasterizovaných vajec při výrobě těstovin. Celkový obsah oxycholesterolů se ve vaječných těstovinách zvyšuje tepelným zpracováním, v závislosti na teplotě a době ohřevu. Při pasteraci v teplotě 96 C po dobu 1,5 minuty byl obsah oxycholesterolů 71,70 µg/g cholesterolu. Dále byly vzorky baleny v ochranné atmosféře dusíku a vystaveny teplotě 100 C na dobu 45, 85, 140 minut, obsah oxycholesterol byl 78,12 µg/g, 103,7 µg/g a 117,9 µg/g cholesterolu. V čerstvých vaječných těstovinách je obsah oxidačních produktů cholesterolu mnohem nižší než v sušených vaječných těstovinách (Zardetto et al. 2014). Tři způsoby ohřevu byly použity k přípravě různých masných výrobků s cílem zjistit vliv vaření, skladování a ohřívání na celkový obsah oxidačních produktů cholesterolu. Uvařené vzorky byly skladovány při 4 C a znovu se ohřály po 3 a 6 dnech skladování stejným způsobem vaření nebo v mikrovlnné troubě. Nejvyšší obsah oxycholesterolů způsobila ve všech masných výrobcích tepelná úprava grilováním v troubě, skladování 6 dnů a následné ohřátí v mikrovlnné troubě (viz Příloha 2) (Khan et al. 2015). Způsob balení a skladování potravin Vliv různých druhů balení potravin na oxidaci cholesterolů v nich obsažených byl široce studován, protože světlo, pokojová teplota a přítomnost kyslíku jsou kritickými faktory v tvorbě oxycholesterolů (Otaegui-Arrazola et al. 2010). Například vakuové balení fermentovaných uzenin typu Milano způsobilo větší tvorbu oxycholesterolů než balení v ochranné atmosféře (100% dusík). Uzeniny byly skladovány 2 měsíce ve vitríně osvětleny zářivkou (12 hodin/den, intenzita světla 1000 lux) při teplotě 4 C. Tyto faktory napodobovaly podmínky skladování uzenin v obchodech. Hodnoty celkového množství oxycholesterolů byly měřeny v průběhu skladování (viz Tab. 1), v 60. den byl obsah oxycholesterolů 1,90 μg/g cholesterolu u vakuově balených a 1,37 μg/g cholesterolu u balených v ochranné atmosféře. Vakuové balení a balení v ochranné atmosféře dusíku prodlužuje trvanlivost krájených uzenin eliminací molekulárního kyslíku, vyšší vznik oxycholesterolů ve vakuově balených uzeninách je vysvětlován vyšší koncentrací kyslíku v obalu (Zanardi et al. 2002). 15

18 Tab. 1: Vliv doby skladování (teplota 4 C a intenzita osvětlení 1000 lux) a způsobu balení na obsah oxycholesterolů ve fermentovaných uzeninách typu Milano (Zanardi et al. 2002) Doba skladování a způsob balení Obsah oxycholesterolů % oxidovaného (μg/g cholesterol) cholesterolu Před skladováním 0,52 ± 0,25 0,06 ± 0,03 14 dnů, vakuové balení 0,66 ± 0,13 0,07 ± 0,01 42 dnů, vakuové balení 1,67 ± 0,22 0,18 ± 0,02 62 dnů, vakuové balení 1,90 ± 0,28 0,21 ± 0,03 14 dnů, balení v ochranné atmosféře 0,53 ± 0,16 0,06 ± 0,02 42 dnů, balení v ochranné atmosféře 1,08 ± 0,59 0,12 ± 0,07 62 dnů, balení v ochranné atmosféře 1,37 ± 0,58 0,15 ± 0,06 Conchillo et al. (2005) prokázal, že vakuové balení je vhodný způsob skladování, který vede ke snížené tvorbě oxycholesterolů v syrovém a zejména vařeném kuřecím mase oproti skladování v přítomnosti kyslíku. Syrová a vařená kuřecí prsa byla skladována při teplotě 18 C po dobu 3 měsíců za aerobních podmínek a ve vakuovém balení. U vzorků byla sledována intenzita oxidace lipidů a vzniku oxidačních produktů cholesterolu. Syrové vzorky obsahovaly nízké hladiny oxycholesterolů (4,60 a 7,40 µg/g tuku) při vakuovém a aerobním způsobu skladování. Vařené vzorky (grilované a pečené) obsahovaly vyšší množství oxycholesterolů (28,91 a 39,34 µg/g tuku) při aerobním skladování než vzorky skladované ve vakuu (4,90 a 20,24 μg/g tuku). Množství oxycholesterolů bylo 1,6krát vyšší u syrových, 5,9krát u grilovaných a 1,94krát u pečených vzorků kuřecího masa při skladování v přítomnosti kyslíku oproti skladování ve vakuu. Vakuové balení bylo obzvláště účinné při zpomalení procesu oxidace v průběhu skladování mražených vařených vzorků. V potravinách vystavených záření dochází k oxidaci cholesterolu a množství oxidačních produktů se zvyšuje s časem působení daného záření. Oxycholesteroly jsou v potravině koncentrovanější na povrchu než uvnitř potraviny (Hur et al. 2007). Studie Boselli et al. (2005) zjišťovala míru fotooxidace cholesterolu a lipidů v krůtím mase zabaleném v nádobách pod průhlednou smršťovací fólií v průběhu skladování při teplotě 4 C za podmínek, které jsou běžné v obchodech. Chlazené krůtí maso uložené v temnu při teplotě 4 C dosáhlo maximálního obsahu oxycholesterolů po 7 dnech skladování. Když bylo krůtí maso vystaveno světlu zářivky, maximální obsah oxycholesterolů byl už po 12 hodinách expozice. Osvětlení lampou s nízkými emisemi záření modrého spektra vedlo k podobné oxidaci cholesterolu jako skladování ve tmě. Toto osvětlení by mohlo být preventivním faktorem proti oxidaci lipidů například v obchodech a skladech. Obalový materiál značně ovlivňuje množství světla, které projde k potravině a může tak zajišťovat oxidační stabilitu cholesterolu. V másle vystaveném zářivkovému osvětlení hliníková 16

19 fólie bránila oxidaci cholesterolu i po 15 dnech expozice. Ostatní obalové materiály (polyethylenová fólie, různé papírové obaly) nezabránili oxidaci cholesterolu. Denní světlo vyvolalo vyšší oxidaci cholesterolu v másle při teplotě 22 C než osvětlení zářivkou (Luby et al. 1986). Další studie například zjišťovala vliv různých faktorů na množství oxycholesterolů v sušeném vejci, porovnávala teplotu sušení, přítomnost antioxidantů, dobu a podmínky skladování. Bylo potvrzeno, že množství oxycholesterolů se zvyšuje s teplotou sušení a během skladování, je vyšší při skladování za přístupu kyslíku a světla. Balení ve vakuu a zároveň skladování ve tmě je dobrou prevencí oxidace cholesterolu (Guardiola et al. 1997). Složení potravin Chemické složení potravin je dalším klíčovým faktorem, který ovlivňuje oxidaci cholesterolu. Zejména stupeň nenasycenosti lipidů a obsah antioxidantů hraje důležitou roli v tvorbě oxycholesterolů (Hur et al. 2007; Ansorena et al. 2013). Vliv stupně nenasycenosti různých triacylglycerolů (kyseliny stearové, olejové, linolové, linolenové) na oxidaci cholesterolu při 180 C byl hodnocen v porovnání s oxidací vzorku čistého cholesterolu. Vzorek čistého cholesterolu degradoval rychleji než v přítomnosti triacylglycerolů. Vyšší stupeň nenasycenosti mastných kyselin v triacylglycerolu zpomalil degradaci cholesterolu. Nenasycené triacylglyceroly podléhají oxidaci dříve než cholesterol zatímco nasycené triacylglyceroly jsou stabilnější, a proto nenasycené mastné kyseliny zabránily oxidaci cholesterolu (Ansorena et al. 2013). Tyto výsledky potvrdilo i použití volných mastných kyselin stearové, olejové, linolové a α-linolenové. Celkový obsah oxycholesterolů byl také vyšší v přítomnosti kyseliny stearové (o 20 %) než v přítomnosti nenasycených mastných kyselin (Xu et al. 2009). Podobně cholesterol zahřívaný s různými koncentracemi konjugované linolové kyseliny podléhal oxidaci méně než v její nepřítomnosti. Konjugovaná linolová tak může sloužit jako preventivní faktor degradace cholesterolu (Yen et al. 2010). Mastné kyseliny urychlily počáteční degradaci cholesterolu při teplotě 180 C, ale více oxycholesterolů vzniklo v přítomnosti nenasycených mastných kyselin (prvních 30 minut). Poté se rychlost degradace snížila a po 120 minutách ohřevu byly vzorky, které obsahovaly mastné kyseliny, méně oxidované než kontrola bez obsahu mastných kyselin. Mastné kyseliny ovlivňují oxidaci cholesterolu v závislosti na čase a stupni jejich nenasycenosti (Xu et al. 2011). Studie provedené přímo v potravinách poskytují rozmanité výsledky. Obecně platí, že přítomnost tuku při přípravě pokrmů snižuje množství vytvořených oxycholesterolů. Například smažením masa na olivovém oleji vzniklo menší množství oxycholesterolů než 17

20 přípravou masa v mikrovlnné troubě. Smažením lososa na olivovém nebo sójovém oleji došlo k menší oxidaci cholesterolu než při pečení lososa (Echarte et al. 2001, 2003). Polynenasycené mastné kyseliny velice snadno podléhají oxidaci a jejich hydroperoxy radikály mohou být nezbytné k zahájení oxidace cholesterolu. Proto vyšší množství nenasycených mastných kyselin a stupeň jejich nenasycenosti zvyšuje náchylnost produktů k oxidačnímu poškození. Obsah polynenasycených mastných kyselin a náchylnost k oxidaci je nejvyšší u ryb a dále klesá drůbež, vepřové, hovězí a jehněčí maso (Hur et al. 2007). Pravděpodobně proto měli například kuřecí karbanátky obsah oxycholesterolů až dvakrát vyšší než odpovídající karbanátky z hovězího masa (Echarte et al. 2003). Mezi další faktory ovlivňující tvorbu oxycholesterolů patří přítomnost iontů železa. Při tepelném zpracování potravin dochází k denaturaci bílkovin, což může vést ke ztrátě jejich antioxidační aktivity nebo k uvolnění železa z metaloproteinů (zejména z myoglobinu) a iniciovat tak oxidaci cholesterolu (Love a Pearson 1974; Grau et al. 2001; Hur et al. 2007). Sůl ovlivnila tvorbu oxycholesterolů při zahřívání másla na 110 C. Nárůst množství oxycholesterolů byl v nesoleném másle 2 až 3 krát větší než v soleném. Autoři tento jev připisují snížení aktivity vody. Máslo je však v tomto ohledu specifickou potravinou, jelikož vody obsahuje relativně málo. V jiných potravinách může mít naopak změna aktivity vody zcela opačný vliv (Sander et al. 1989). Hodnota ph Kim a Nawar (1993) zkoumali například vliv ph na oxidaci cholesterolu ve vzorku pufru při 75 C. Procento zbylého cholesterolu po jednom dni bylo 90, 55, a 43 % při ph 6,3, 6,9 a 7,4. Po delším zahřívání (2 6 dnů) byl ve vzorcích podobný obsah cholesterolu (40 50 %) nezávisle na hodnotě ph. Hodnota ph významně ovlivňovala druh vzniklých oxycholesterolů. Tlak Vliv ošetření vysokým tlakem (600 a 900 MPa) na vznik oxidačních produktů cholesterolu byl zkoumán ve vakuově balené krájené sušené šunce. Při tlaku 600 MPa neprobíhaly žádné změny v obsahu oxycholesterolů. Působením tlaku 900 MPa se významně zvýšil obsah 5α,6α-, 5β,6β-epoxycholesterolu, 7a-, 7β-hydroxycholesterolu, 25-hydroxycholesterolu a 7-ketocholesterolu (Clariana a García-Regueiro 2011). Ionizující γ-záření Oxidace cholesterolu v sušené vaječné směsi vlivem ionizujícího γ-záření je podobná jako v průběhu autooxidace. Tvorbu 7α/β-hydroxycholesterolu bylo možné pozorovat při 1 a 2 kgy. Dávky 4 a 6 kgy zvyšovaly tvorbu těchto derivátů a vedly ke vzniku 5α,6α-epoxycholesterolu a 7-ketocholesterolu (Lebovics et al. 1992). Ozáření kuřecího masa γ-zářením dávkou 10 kgy se 18

21 zvýšila koncentrace sledovaného 7-ketocholesterolu čtyřnásobně v porovnání s neozářeným vzorkem (Hwang a Maerker 1993). Aktivita vody V sušených potravinách je nízká aktivita vody a mnoho sušených potravin živočišného původu se vyznačuje poměrně velkým obsahem oxidačních produktů cholesterolu. S cílem zjistit vliv aktivity vody na oxidaci cholesterolu se porovnával obsah oxycholesterolů ve vaječném žloutku a celých vejcích usušených různým způsobem (lyofilizace, stříkání) v průběhu skladování 3 měsíce, při pokojové teplotě, v plastovém obalu, bez přístupu vzduchu a ve tmě. Jednotlivé vzorky byly hydratovány na 8% nebo 12% obsah vody. Jeden vzorek byl zcela dehydratován. Obsah oxycholesterolů před skladováním a po 3 měsících se zvýšil, nejvíce ve vzorku s nejnižší aktivitou vody. Obsah oxycholesterolů byl vyšší v sušených celých vejcích než v sušených žloutcích. Oxycholesteroly ve vejcích sušených rozprašováním byly v mírně vyšším množství než v lyofilizovaných. Při sušení vajec dochází k oxidaci cholesterolu, lyofilizovaná vejce nejsou vystavena tak vysoké teplotě a obsah oxycholesterolů je tak nižší. Nízká aktivita vody zapříčiňuje větší nárůst obsahu oxycholesterolů v sušených vejcích během skladování (Obara et al. 2006). Prevence vzniku oxycholesterolů v potravinách Postupy, které brání oxidaci cholesterolu, jsou podobné postupům zamezujícím oxidaci lipidů. Tvorba oxycholesterolů v živočišných produktech může být minimalizována použitím nízkých teplot při zpracování, balením potravin bez kyslíku a v ochranné atmosféře, vhodným skladováním při nízkých teplotách a bez přístupu světla. Důležité je zkrátit dobu tepelné úpravy pokrmů a skladování, nejvýhodnější z hlediska obsahu oxycholesterolů jsou čerstvé potraviny. Další možností je přídavek antioxidantů při výrobě potravin nebo už jako doplněk do krmiva pro zvířata (Thurner et al. 2007). Řada studií zjišťuje vliv přidání antioxidantu do potraviny na oxidaci cholesterolu. Xu et al. (2009) zjišťoval účinek antioxidantů v koncentraci 200 mg/kg ve vzorcích cholesterolu při teplotě 180 C. Butylhydroxytoulen (E 321), katechiny ze zeleného čaje, α-tokoferol a quercetin částečně zabránili oxidaci cholesterolu. Přírodní antioxidanty byly účinnější než syntetické aditivum butylhydroxytoulen. Polak et al. (2011) zjišťoval, zda přídavek koenzymu Q10 (0,2 g/kg), kyseliny askorbové (2 g/kg) nebo α-tokoferolu (0,2 g/kg) může zabránit oxidaci cholesterolu v kuřecí játrové paštice. Výrobky byly po přidání různých kombinací antioxidantů pasterizované (82 C) nebo sterilizované (121 C). Nejúčinněji inhiboval tvorbu oxycholesterolů koenzym Q10 s kyselinou askorbovou, který snížil množství oxycholesterolů u pasterizované paštiky pod mez detekce, 19

22 a koenzym Q10 s α-tokoferolem. Přídavek antioxidantů pouze mírně ovlivnil vůni, chuť a texturu výrobku a proto by se mohly antioxidanty používat jako prevence vzniku oxycholesterolů. Z nutričního hlediska by byla zajímavá právě fortifikace koenzymem Q10. Inhibiční účinek přidaného butylhydroxyanisolu (E 320) na oxidaci cholesterolu v průběhu zpracování a skladování uvařených sušených ančoviček za přístupu vzduchu byl vyšší než přidání α-tokoferolu. Vakuové skladování ančoviček s absorbátorem kyslíku, bylo z hlediska množství vzniklých oxycholesterolů účinnější. Z toho vyplývá, že účinnou metodou prevence oxidace cholesterolu, by mohlo být přidání antioxidantu (např. butylhydroxyanisolu) do suroviny před zpracování a následné vakuové balení s absorbérem kyslíku (Shozen et al. 1997). Účinek některých flavonoidů (quercetinu, katechinu, morinu a rutinu) na tepelnou oxidaci cholesterolu zkoumali ve studii Valenzuela et al. (2004) a prokázali, že quercetin byl nejúčinnější v prevenci vzniku oxycholesterolů a rutin nezabránil oxidaci cholesterolu. Vliv přidaného antioxidantu do krmiva zvířat byl zkoumán například přidáním vitaminu E volům do krmiva na 135 dnů před porážkou. Krmivo obsahovalo 20 nebo 3000 mg α-tokoferol acetátu na den. Po porážce byla koncentrace α-tokoferolu vyšší ve svalovině zvířat krmených 3000 mg α-tokoferolu/den. Uvařené vakuově balené hovězí maso volů krmených vysokými dávkami vitaminu E mělo nižší obsah oxycholesterolů v průběhu skladování mražením i chlazením 1. a 2. týden, 3. týden pouze při skladování chlazením. Výsledky ukazují, že vitamin E v krmivu zvyšuje oxidační stabilitu masa a brání oxidaci cholesterolu v hovězích mase během skladování (Galvin et al. 2000). Podobný účinek přidání α-tokoferol acetátu do krmiva byl potvrzen i u kuřat. Celkem byl obsah oxycholesterolů snížen (po 12 dnech skladování uvařeného masa při 4 C) při dávkách α-tokoferol acetátu 200 a 800 mg/kg krmiva o 42 a 75% v kuřecím prsu, o 50 a 72% v kuřecím stehně oproti běžné dávce α-tokoferol acetátu 20 mg/kg krmiva (Galvin et al. 1998). Jako další preventivní faktor by mohlo sloužit přidávání různých bylinných extraktů do krmiva zvířat. 500 mg extraktu rozmarýnu a šalvěje nebo 200 mg α- tokoferol acetátu bylo přidáno na kilogram krmiva brojlerů. Obsah oxycholesterolů při obohacení krmiva extrakty rozmarýnu a šalvěje byl menší než u kontrolní skupiny, ale obohacení krmiva α-tokoferol acetátem obsah oxycholesterolů v mase ještě snížilo (Lopez-Bote et al. 1998). Podobně snížilo tvorbu oxycholesterolů v uvařených a dva dny při teplotě 4 C skladovaných vzorků pstruha duhového přidání α-tokoferol acetátu do krmiva (100 a 500 mg/kg). Aplikace výtažku z rozmarýnu (oleoresin rozmarýnu) na povrch ryby inhibici tvorby oxycholesterolů ještě podpořila (Akhtar et al. 1998). 20

23 2.3 Oxycholesteroly v potravinách Živočišné potraviny jako jsou mléko, mléčné výrobky, vejce, výrobky z vajec, maso a masné výrobky jsou hlavním zdrojem cholesterolu a mohou být tedy i zdroji oxycholesterolů. Čerstvé potraviny oxycholesteroly neobsahují vůbec, obsahují pouze nedekovatelná nebo malá množství (Hur et al. 2007). Velké množství oxycholesterolů bylo detekováno až v potravinách vystavených vysoké teplotě, záření nebo po dlouhém skladování (Hur et al. 2007; Orczewska- Dudek et al. 2012). Oxycholesteroly se extrahují ze vzorků pomocí organických rozpouštědel. Jelikož jejich koncentrace bývá velmi nízká, je možné jejich zkoncentrování extrakcí na pevnou fázi. Pro stanovení jednotlivých oxycholesterolů se využívají analytické separační metody: dříve tenkovrstvá chromatografie, v současnosti zejména plynová a kapalinová chromatografie, často kombinované s hmotnostně-spektrometrickým detektorem (C.-Y. Tai et al. 1999) Vejce a vaječné výrobky Slepičí vejce patří mezi výživově hodnotné potraviny. Celé vejce obsahuje 10,5 % lipidů, 12,1 % bílkovin a 0,9 % sacharidů, sušina je 34,4 %. Žloutek, který tvoří asi % vejce, obsahuje 32,6 % lipidů a sušina žloutku je 51,3 %. Střední vejce (velikost M) váží g, energetická hodnota jednoho vejce je kj (Dostálová et al. 2014). Vaječný žloutek obsahuje nejvyšší množství cholesterolu, střední vejce obsahuje mg cholesterolu (350 mg/100g čerstvých vajec). Největším zdrojem oxycholesterolů jsou sušená vejce, dále pasterovaná vaječná melanž, které se používají v průmyslové výrobě různých potravin (těstoviny, sušenky). Syrová vejce obsahují minimální množství oxycholesterolů, po tepelné úpravě se toto množství zvýší. Vejce obsahují různá množství oxycholesterolů v závislosti na složení vajec, metodě zpracování (teplota, doba ohřevu) a skladování (doba, přístup vzduchu, světla, teplota) (Galobart et al. 2002; Valenzuela et al. 2003). Oxidace cholesterolu je podporována obsahem železa a polynenasycených mastných kyselin ve vejcích (Orczewska-Dudek et al. 2012). Čerstvý žloutek obsahoval pouze nepatrné množství oxycholesterolů (7α-, 7β-hydroxycholesterol a 7-ketocholesterol) a sušené vejce obsahovalo oxycholesterolů více (5α,6α- a 5β,6β-epoxycholesterol) (Mazalli et al. 2006). Množství oxycholesterolů bylo zjišťováno například v čerstvých žloutcích omega-3 vajec. Omega-3 vejce jsou vejce slepic, které byly krmeny krmivem obohaceným o nenasycené omega-3 mastné kyseliny, které jsou pro člověka esenciální a zdraví prospěšné. V těchto vejcích skladovaných 45 dní při teplotě 25 C bylo 11 µg/g sušiny žloutku, ve vařených vejcích (97 C, 5 minut) 0,16 µg/g a po 45 dnech skladování 14 µg/g. Nejvyšší množství oxycholesterolů vzniklo při smažení vajec (190 C, 4 minuty na sójovém oleji) 0,44 µg/g a po 45 dnech 21

24 skladování bylo množství 34 µg/g sušiny žloutku. Tato studie poukázala na důležitost uchovávání vajec v lednici a na vhodnost konzumace vajec hned po tepelné úpravě (Mazalli a Bragagnolo 2009). Sušení vajec lyofilizací je šetrnější z hlediska oxidace cholesterolu než rozprašovací metoda. Lyofilizace je drahá metoda a proto se při výrobě sušených vajec používá jen zřídka a výrobky připravené ze sušených vajec jsou většinou významným zdrojem oxycholesterolů ve stravě (Obara et al. 2006). Mezi typické výrobky z vajec patří vaječné těstoviny. Ve studii Zardetto et al. (2014) zjišťovali míru oxidace cholesterolu v různě upravených čerstvých těstovinách. Množství oxycholesterolů se v čerstvých těstovinách pohybuje v rozmezí 0,2 0,32 µg/g těstovin. V sušených vaječných těstovinách jsou hodnoty oxycholesterolů 0,9 6,5 µg/g těstovin, průměrně 12 vzorků sušených těstovin obsahovalo 2,2 µg/g (Boselli et al. 2004). Množství oxycholesterolů v těstovinách po uvaření se mění, absorpce vody (obvykle 30%) koncentraci oxycholesterolů sníží (Zardetto et al. 2014). Oxycholesteroly vznikají v těstovinách i během skladování. Uložením ve tmě a pouze po krátkou dobu lze jejich množství omezit. Nevhodným skladováním za světla se obsah oxycholesterolů může zvýšit až 2krát (Verardo et al. 2010). Majonézy, typické výrobky z vajec, měly ve studii Morales-Aizpurúa a Tenuta-Filho (2005) obsah oxycholesterolů 1,99 μg/g v nejčerstvějším vzorku (15 dnů) a až 20,3 a 30,2 μg/g ve vzorku po skladování 165 dní při teplotě 4 C a 25 C. Tab. 2: Množství oxycholesterolů ve vejcích a výrobcích z vajec (upraveno podle Paniangvait et al. (1995), Boselli et al. (2004), Morales-Aizpurúa a Tenuta-Filho (2005), C.-T. Tai et al. (1999) a Mazalli a Bragagnolo (2009)) Vejce a vaječný výrobek Obsah oxycholesterolů (μg/g) Průměrný obsah oxycholesterolů (μg/g) Pasterovaná tekutá melanž 3,3 3,8 3,55 Sušená vejce rozprašování ,5 Sušené žloutky lyofilizované 28,8 43,5 μg/g tuku 36,15 μg/g tuku Sušené žloutky ,5 Sušené vaječné těstoviny 0,9 6,5 3,7 Čerstvé těstoviny 0,2 0,32 0,26 Vaječná omeleta Smažená vejce (omega-3) 0,41 μg/g sušiny žloutku 0,41 μg/g sušiny žloutku Vařená vejce (omega-3) 0,16 μg/ g sušiny žloutku 0,16 μg/ g sušiny žloutku Majonéza 1,99 20,3 11,145 22

25 2.3.2 Mléko a mléčné výrobky Mléko je velice významná potravina, obsahuje velké množství minerálních látek a vitaminů. Mléčný tuk je dobře stravitelný, neboť je složen hlavně z krátkých a středně dlouhých mastných kyselin, obsahuje vitaminy rozpustné v tucích a cholesterol. Množství polynenasycených mastných kyselin je v mléčném tuku nízké (Dostálová et al. 2014). Obsah cholesterolu v mléce je přibližně 3 mg/g tuku. Obsah oxycholesterolů v mléčných výrobcích byl zkoumán v mnoha studiích, jejich výsledky shrnuje Sieber (2005) v přehledovém článku. Mléko a mléčné výrobky obsahují podle nedávno publikovaných výsledků velmi malá množství oxycholesterolů. Významné koncentrace oxidovaného cholesterolu obsahují pouze výrobky, které byly skladovány za nevhodných podmínek v přítomnosti světla a kyslíku nebo potraviny s nízkou aktivitou vody skladované v přítomnosti kyslíku (Sieber 2005; Hur et al. 2007). V čerstvých, tepelně neupravených a chlazených mléčných výrobcích byl obsah oxycholesterolů minimální (viz Tab. 3). Proces pasterace a UHT (ultravysokou teplotou) významně neovlivnil množství oxycholesterolů v mléku, tyto metody úpravy mléka a mléčných výrobků jsou považovány za bezpečné (Sieber 2005). Pasterizované plnotučné mléko, UHT ošetřené mléko, konzervované kondenzované mléko a odtučněné mléko podle studie Cleveland a Harris (1987) neobsahovaly žádné oxycholesteroly. Tab. 3: Množství oxycholesterolů v čerstvých mléčných výrobcích (upraveno podle Sieber (2005) a Paniangvait et al. (1995)) Mléko, mléčný výrobek Obsah oxycholesterolů Průměrný obsah (μg/g) oxycholesterolů (μg/g) Mléko nd* nd* Zahuštěné mléko < 0,8 Vanilkový jogurt Vanilková zmrzlina 7 7 Zakysaná smetana 3 3 Mléčný tuk 7 7 Smetana nd nd Máslo 0 9 4,5 Mléčná pomazánka 2,59 2,59 Cottage sýr nd nd Smetanový sýr Parmezán 8,7 μg/g tuku 8,7 μg/g tuku Sýr s modrou plísní < 0,4 Parmezán strouhaný 1,73 9 5,365 Sýr feta 2,9 23,4 μg/g tuku 13,15 μg/g tuku Sýr na fondue 0,57 0,57 *pod mezí detekce 23

26 Doba a podmínky skladování mléka a mléčných výrobků ovlivňují oxidaci cholesterolu. Čerstvé máslo obsahovalo pouze stopy oxycholesterolů, ale skladování másla při teplotě 4 C po dobu 4 měsíců způsobilo výskyt 5,6-epoxycholesterolu, 7-, 20α-hydroxycholesterolu a 7-ketocholesterolu (Nourooz-Zadeh a Appelqvist 1988). Přestože se kvantitativní hodnoty různých studií lišili, bylo potvrzeno, že tepelná úprava mléčných výrobků zvyšuje obsah oxycholesterolů (viz Tab. 4). Například ohřev másla po dobu 10 minut při teplotě C, podobně jako při smažení na pánvi, zvýšil celkové množství oxidů cholesterolu (Nourooz-Zadeh a Appelqvist 1988; Pie et al. 1990). Právě máslo použité při výrobě sušenek, koláčů a croiassantů způsobilo, že obsahují poměrně významné množství oxycholesterolů (Pie et al. 1990). Byla detekována velmi vysoká množství oxycholesterolů v ghee, přepuštěném a přečištěném másle, a jejich obsah se ještě zvýšil další tepelnou úpravou. Jacobson (1987) vyslovil hypotézu, že právě velký obsah oxycholesterolů v ghee může vysvětlovat vysoký výskyt srdečních onemocnění způsobených aterosklerózou u imigrantů indické populace. Tab. 4: Množství oxycholesterolů v tepelně upravených mléčných výrobcích (upraveno podle Sieber (2005)a Paniangvait et al. (1995)) Mléko, Obsah Průměrný obsah Tepelná úprava mléčný výrobek oxycholesterolů (μg/g) oxycholesterolů (μg/g) Mléko pasterizované/uht nd nd 85 C, 12 hodin nd nd Máslo 180 C, 5 67,2 67,2 180 C, 10 14,6 83,1 48, C, 10 nd nd Koláč (25 % másla) neuvedeno 3,09 4,06 3,575 Sušenky (30 % másla) neuvedeno 1,8 1,8 Máslový croissant neuvedeno 1,1 1,1 Ghee čerstvě vyrobený ,5 tepelné poškození; 225 C, 30 minut 630; 209,2 630; 209,2 Raclette 134 C, 5 < 0,19 < 0,19 Sýrové fondue 98 C, 4.5 0,41 0,41 Sušené mléko a mléčné produkty obsahují oxycholesteroly hlavně v důsledku dlouhého a nevhodného skladování. V čerstvě usušených produktech je obsah oxycholesterolů menší (viz Tab. 5) něž v případě dlouhodobě skladovaných (Sieber 2005). 24

27 Tab. 5: Množství oxycholesterolů v sušených mléčných výrobcích (upraveno podle Sieber (2005), Paniangvait et al. (1995) a C.- Y. Tai et al. (2000)) Sušené mléko, mléčný Průměrný obsah Obsah oxycholesterolů (μg/g) výrobek oxycholesterolů (μg/g) Sušené mléko 0,005 22,415 11,228 Odtučněné mléko stopy 2,6 1,3 Polotučné mléko < 0,1 < 0,1 Plnotučné mléko stopy 17 8,5 Kojenecká výživa Sýr čedar ,5 Parmezán Maso, masné výrobky Maso je definováno jako poživatelná část živočichů určená k výživě člověka. Slouží jako významný zdroj plnohodnotných bílkovin, minerálních látek (železa, zinku) a vitaminů (skupiny B). Tuky v mase se liší ve složení v závislosti na živočišném druhu, umístění tuku v těle i na klimatu, krmivu a způsobu chovu. Přestože v tuku zvířat převládají nasycené mastné kyseliny, poměrně vysoký je podíl nenasycených mastných kyselin v mase kuřecím a vepřovém. Obsah tuku v jednotlivých částech těla jatečných zvířat je velice rozdílný. Hovězí libové maso obsahuje 5 13 %, tučné až 25 %, vepřové libové %, tučné až 60 % tuku, kuře obsahuje 7 15 % tuku a kuřecí prsní řízek pouze do 4 %. Cholesterol je obsažen v libové i tučné části masa a rozdíly v obsahu mezi jednotlivými druhy živočichů nejsou velké. Množství cholesterolu v libovém hovězím mase je mg/kg, v tučném mg/kg, ve vepřovém mg/kg, v kuřeti mg/kg a v kuřecím prsním řízku mg/kg (Dostálová et al. 2014; Kolářová 2009). Syrové maso obvykle obsahuje pouze stopy nebo nedetekovatelná množství oxycholesterolů. Po vystavení nevhodným podmínkám během skladování a tepelné úpravě se množství oxycholesterolů v mase zvyšuje. Skladování již uvařeného masa významně ovlivňuje množství vznikajících oxycholesterolů (Hur et al. 2007). Například v syrových vepřových kotletách nebyly zjištěny oxidační produkty cholesterolu. Po 8 dnech skladování v chladu byly detekovány pouze v některých vzorcích. Po uvaření již vepřové maso oxycholesteroly obsahovalo. Skladováním v ledničce se obsah oxycholesterolů zvýšil, po 4 dnech byl nárůst až dvojnásobný oproti dvoudennímu skladování. Přídavek α-tokoferolu do krmiva prasat významně snížil míru oxidace cholesterolu při zpracování jejich masa (Monahan et al. 1992). 25