Psychrotrofní a psychrofilní mikroorganismy v chladicích zařízeních

Transkript

1 Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav agrochemie, půdoznalství, mikrobiologie a výživy rostlin Psychrotrofní a psychrofilní mikroorganismy v chladicích zařízeních Diplomová práce Vedoucí práce: Ing. Libor Kalhotka, Ph.D. Vypracovala: Bc. Marcela Budíková Brno 2011

2 PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma Psychrotrofní a psychrofilní mikroorganismy v chladicích zařízeních vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Souhlasím, aby práce byla uložena v knihovně Mendelovy univerzity v Brně a zpřístupněna ke studijním účelům. V Brně dne. Podpis autora.

3 PODĚKOVÁNÍ Děkuji vedoucímu své diplomové práce, Ing. Liborovi Kalhotkovi, Ph.D., za vstřícný přístup a poskytnutí části odborné literatury pro vypracování této práce.

4 ABSTRAKT Téma mé diplomové práce je Psychrotrofní a psychrofilní mikroorganismy v chladicích zařízeních. Úvodní kapitola pojednává o historii chladicích zařízení a jejich významu v potravinářství. Dále práce popisuje metody konzervace potravin využívající nízké teploty. Následuje rozdělení mikroorganismů dle teploty prostředí a podrobnější charakteristika psychrofilních a psychrotrofních mikroorganismů. Poslední kapitola literárního přehledu uvádí způsoby boje a prevence proti mikroorganismům ohrožujících zdraví konzumenta. Experimentální část je zaměřena na stanovení počtu významných skupin mikroorganismů ze vzorků chladniček z domácností a chladniček z kolejí. Výsledné hodnoty byly porovnány a bylo zjištěno, že nejvíce kontaminovanou částí chladničky je box na ovoce a zeleninu. Celkově vyšší počet všech stanovovaných mikroorganismů vykazovaly chladničky z domácností. Klíčová slova: potraviny, psychrotrofní mikroorganismy, chladicí zařízení, nízká teplota ABSTRACT The topic of my diploma thesis is Psychrotrophic and psychrophilic microorganisms in cooling systems. The first chapter deals with the history of cooling systems and their importance in food industry. Furthemore, the methods of food canning using low temperatures are described. It is followed by devision of microorganisms according to the environment s temperature and more detailed characteristic of psychrophilic and psychrotrophic microorganisms. The last chapter of literary overview introduces different approaches of fight and prevention against microorganisms which are dangerous for consumer s health. The experimental part is focused on defining a number of significant groups related to the microorganisms coming from household cooling systems samples and dormitory s refrigerators. Resulting values were confronted. It was found out that the most contaminated part of a refrigerator is a fruit and vegetable box. The household refrigerators generally demonstrate a higher number of all specified microorganisms. Key words: food, psychotrophic microorganisms, cooling system, low temperature

5 OBSAH: 1 ÚVOD 8 2 CÍL PRÁCE 9 3 LITERÁRNÍ PŘEHLED Chladicí zařízení a jeho historie Počátky chlazení a mrazení Chladicí zařízení Definice Druhy chladniček v domácnosti Metody konzervace využitím nízkých teplot Druhy uchovávaných potravin Princip uchovatelnosti nízkými teplotami Nejběžnější metody konzervace potravin Chlazení Mrazení Mikroorganismy a teplota Základní pojmy Dělení mikroorganismů dle teploty prostředí Mezofilní mikroorganismy Termofilní mikroorganismy Psychrofiní a psychrotrofní mikroorganismy Rostou při nízkých teplotách i plísně a kvasinky? Plísně Kvasinky Psychrofilní mikroorganismy Charakteristika Výskyt Adaptace na chlad Změny ve struktuře proteinů 22

6 Změny v lipidové membráně Zástupci Význam v potravinářství Biotechnologické aplikace Význam při kažení potravin Psychrotrofní mikroorganismy Charakteristika Dělení psychrotrofních mikrobů a zástupci Výskyt Význam v potravinářství Kažení základních druhů potravin psychrotrofy Kažení masa Kažení mléka Kažení nativních vajec Psychrotrofní mikroorganismy a alimentární onemocnění Alimentární onemocnění Bacillus cereus Charakteristika a výskyt Onemocnění konzumenta Prevence a léčba Listeria monocytogenes Charakteristika Výskyt Druhy kontaminovaných potravin Onemocnění a prevence Metody boje proti nežádoucím mikroorganismům Správné dodržování hygieny a výrobní praxe Mléko Maso 37

7 3.7.2 Rady pro správné uchovávání potravin v chladničce Tipy pro správné zmrazování Tipy pro bezpečné rozmrazování Zabránění křížové kontaminaci 40 4 MATERIÁL A METODIKA Charakteristika vzorků Použitý materiál Laboratorní pomůcky a přístroje Metodika Složení a příprava kultivačních půd Stanovované mikroorganismy Vyhodnocení výsledků 45 5 VÝSLEDKY A DISKUZE Chladničky z domácností Chladničky z kolejí Srovnání průměrného počtu psychrotrofních MO 59 6 ZÁVĚR 61 7 PŘEHLED LITERATURY 62 8 SEZNAM GRAFŮ 67 9 SEZNAM TABULEK SEZNAM PŘÍLOH PŘÍLOHY 70

8 1 ÚVOD Jak je všeobecně známo, nejběžnější a dennodenně používaný nástroj k uchovávání potravin a potravinářských surovin je chladicí zařízení. Většina lidí si už nedokáže bez chladničky svůj zaběhlý život představit a považuje ji za nejbezpečnější skrýš pro zakoupené potraviny, či uvařené pokrmy. Mohlo by se totiž zdát, že potraviny, které do chladničky ukládáme, se zde již nemohou kazit, a jsou v ní díky nízké teplotě plně chráněny proti ataku mikroorganismů. Opak je však pravdou. Tento fakt potvrzuje skupina tzv. psychrofilních a psychrotrofních mikroorganismů. Tyto na chlad přizpůsobené organismy jsou popisovány několika různými definicemi, avšak jedno mají společné. Díky svým specifickým mechanismům, které obsahují, jsou adaptovány i na tak nízké teploty, které jsou již člověkem vnímány jako extrémní, a jsou v nich schopny přežít. Nízká teplota v chladničce pro ně tedy nepředstavuje žádnou překážku. Mezi tyto chladnomilné mikroby naneštěstí patří i patogenní druhy, které mohou vyvolat alimentární onemocnění, a to Bacillus cereus či Listeria monocytogenes. Tyto bakterie mohou u oslabených jedinců způsobit nejen zažívací potíže, ale v horším případě i potrat, nebo smrt. K zabránění těchto situací existuje několik jednoduchých pravidel, která je nutno dodržovat. Spotřebitel by měl chladničku pravidelně čistit a odmrazovat, udržovat v ní správnou teplotu atd. Pokud tyto rady nebudeme brát na lehkou váhu a budeme se je snažit dodržovat, snížíme tím v chladničce nejen počet mikroorganismů, ale na minimum tím poklesne i riziko závažných zdravotních potíží, které by přítomné patogenní druhy mohly vyvolat. 8

9 2 CÍL PRÁCE Cílem této diplomové práce je zpracovat literární rešerši, v níž budou shrnuty informace o psychrotrofních a psychrofilních mikroorganismech, vyskytujících se v chladicích zařízeních, a zaměřit se na patogenní mikroby a na ty, kteří způsobují kažení potravin. Tím tedy mohou negativně ovlivnit lidské zdraví. Tyto mikroorganismy charakterizovat a stanovit nápravná opatření proti jejich výskytu. Dále pak experimentálně stanovit danou mikrobiální kontaminaci ve zvolených chladicích zařízeních a výsledná data zpracovat a shrnout v závěru. 9

10 3 LITERÁRNÍ PŘEHLED 3.1 Chladicí zařízení a jeho historie Počátky chlazení a mrazení Dříve byl k dosažení nízkých teplot používán hlavně princip s odpařováním vody a využíval se také sníh a led. Nejen ze starověké Persie jsou známé chladírny, tedy místnosti, které se stavěly pod zemí blízko jezer a byly plněny sněhem a ledem. Tato metoda se udržela poměrně dlouho, ještě v padesátých letech minulého století bylo v zimě běžné vidět řezání ledových kvádrů a jistě i dnes se v některých oblastech světa tato metoda používá. Jelikož však není moc pohodlné spoléhat na rozmary počasí, začal člověk vymýšlet jiné způsoby chlazení. První předchůdci ledničky měli plechové obložení a do mezistěn se vkládaly kostky ledu. S novým způsobem chlazení přišel v 18. století William Cullen, který zkoumal využití vypařování par ve vakuu. Většího úspěchu pak dosáhl Jacob Perkins, který v roce 1834 obdržel patent na chladící systém, který používal odpařování těkavých látek. Největší obrat v historii domácího chlazení přinesl ovšem objev německého inženýra Carla von Lindeho (Kubálková, 2008), který studoval strojírenství v Curychu. Roku 1872 se stal profesorem na univerzitě v Mnichově a zřídil zde inženýrské laboratoře ( Jeho výzkum, založený na teorii tepla, vedl roku 1875 k vynálezu první spolehlivé a účinné ledničky se stlačeným čpavkem. Jeho vynález byl mezinárodním úspěchem a chlazení rychle vytlačilo ze zacházení s potravinami užívání ledu. Chladicí proces byl zaveden do mnoha průmyslových procesů, nabízel velké výhody např. pro pivovary, jatky a užíval se v mrazírnách po celé Evropě ( Chladničky do roku 1929 používaly čpavek či oxid siřičitý. Protože však došlo k několika fatálním nehodám v souvislosti s únikem těchto jedovatých plynů, hledala se jiná látka a objevil se freon. Masově se začaly chladničky používat až po druhé světové válce. Ochránci přírody se v 80. až 90. letech dvacátého století zasloužili o omezení výroby chladniček s freonem, který oslabuje ozónovou vrstvu. V současnosti vývoj směřuje ke zdokonalování funkcí chladniček a snížení spotřeby elektřiny na co nejnižší (Kubálková, 2008). 10

11 3.1.2 Chladicí zařízení Definice Chladicím zařízením se pro účely nařízení 179/2001, kterým se stanoví technické požadavky na chladicí zařízení, rozumí chladničky, konzervátory zmrazených potravin, mrazničky na potraviny a jejich kombinace určené pro domácnost, napájené z elektrické sítě. Toto nařízení se nevztahuje na chladicí zařízení, která mohou využívat i jiný druh energie, zvláště akumulátory, chladicí zařízení pro domácnost pracující na absorpčním principu a chladicí zařízení vyrobená podle zvláštních individuálních požadavků (předpis 179/2001 Sb.) Druhy chladniček v domácnosti Lednička (též lednice, chladnička, mraznička, mrazák) je skříň obsahující chladicí stroj a sloužící k uchovávání potravin při nízké teplotě (v chladničce asi 5 C, v mrazicím boxu až 20 C). Povrch volně stojících ledniček bývá zpravidla bílý nebo kovově lesklý, aby se snížil přívod tepla z okolí, oproti jiné barvě se tím zvýší odrazivost povrchu. Existují tři odlišné principy chlazení ledniček: kompresorové, absorpční a adsorpční. Chladnička bývá obvykle elektrická a nejčastějším typem je typ kompresorový. Základem kompresorové chladničky je okruh s chladicím médiem a kompresor. Kompresor vtlačuje chladicí médium v plynném stavu do výměníku, kde se plyn ochladí a změní na kapalinu. Přebytečné teplo odevzdává kapalina okolí. Pak se kapalina dostává do výparníku. Zde dojde k prudkému snížení teploty a přeměně z kapalné fáze na plynnou. Tím vzniká chlad. Z výparníku se vrací plynné chladivo ke kompresoru a cyklus se opakuje ( 3.2 Metody konzervace využitím nízkých teplot Druhy uchovávaných potravin Při nízkých teplotách se mohou uchovávat brambory, ovoce, zelenina a potravinářské výrobky z nich; maso hovězí, vepřové a drůbeží, tzv. na kosti i bez kosti; masné výrobky a řada dalších potravin, resp. potravinářských komodit (Los, 2007). 11

12 Ačkoli by se mohlo zdát, že je žádoucí uchovávat všechny typy potravin při chladničkových teplotách, nebo nižších, není to pro udržení požadované kvality daného produktu vždy to nejlepší. Např. banány je lepší skladovat při 13 C až 17 C než při 5 C až 7 C. Mnoho druhů zeleniny zase tíhne k teplotám okolo 10 C, a toto se týká brambor, celeru, zelí atd. V každém případě je úspěšnost skladování závislá na relativní vlhkosti skladovacího prostředí a na přítomnosti či nepřítomnosti plynů, jako je např. CO 2 (Jay et al., 2005). Tento fakt je popsán v kapitole Princip uchovatelnosti nízkými teplotami Užití nízkých teplot k uchovávání potravin je založeno na skutečnosti, že aktivita mikroorganismů se může zpomalit až zastavit teplotami pod bodem mrazu. Příčinou je, že všechny metabolické procesy mikroorganismů jsou katalyzovány enzymy, a proto je rychlost těchto reakcí závislá na teplotě. Se stoupající teplotou stoupá i rychlost reakce a naopak (Jay et al., 2005). Toto pravidlo však platí pouze v rozmezí biologických teplot (Arpai, Bartl, 1977). Teplotní koeficient (Q) pro většinu biologických systémů je 1,5 až 2,5. Každé zvýšení o 10 C znamená dvojnásobné zvýšení rychlosti reakce a při snížení teploty o 10 C je tomu naopak a rychlost reakce se sníží (Jay et al., 2005) Nejběžnější metody konzervace potravin Chlazení a mrazení jsou nejběžnější metody, jejichž účelem je dlouhodobé uchovávání celé řady potravinářských surovin a potravin rostlinného i živočišného původu (Los, 2007) Chlazení Skladování v chladu obvykle znamená takový způsob, kdy se teploty pohybují nad bodem mrazu. Z asi 16 C klesá při chlazení teplota až k 2 C. Zatímco čistá voda mrzne při 0 C, většina potravin nepočne mrznout, dokud teplota nepoklesne na 2 C a nižší. Mnoho druhů čerstvého ovoce a zeleniny může být chlazením porušeno, pokud jsou skladovány pod kritickou teplotou od 4 C do 12 C (Doyle et al., 2001). Nejdůležitějším principem uchovatelnosti chlazených potravin je transpirace produktu do vnějšího prostředí, která za nedodržení podmínek uvedených níže vede až k dehydrataci produktu. 12

13 Potravina (např. ovoce) má při jakékoliv teplotě vlastní napětí páry, tj. přesně vymezenou tendenci k vylučování vody obsažené ve formě páry do vnějšího prostředí. Pokud je toto prostředí téměř nasyceno vlhkostí, je tomuto jevu zabráněno a dehydratace produktu, tzn. úbytek jeho hmotnosti, nenastane. Pro skladování širokého rozsahu potravin je tedy nutné mít k dispozici skladovací prostředí téměř nasyceno vlhkostí a parciální tlak vodní páry ve skladovacím prostředí má být vyšší nebo alespoň stejný jako tlak vodní páry v potravině, která má být skladována (Los, 2007). Konzervační účinek chlazení je založen na tom, že snížením teploty se zpomalí rychlosti chemických reakcí, a tím je i růst mikroorganismů snížen. Správná teplota pro skladování v chladu je obvykle nižší než minimální růstová teplota většiny mikrobů přenášených potravou (Doyle et al., 2001). Pro mnohé potraviny postačí k potřebnému prodloužení skladovatelnosti uložení při teplotách kolem 0 C. V závislosti na podmínkách skladování syrových potravin se může délka uložení v chladu lišit od několika dní až po několik týdnů, jak je uvedeno v tabulce č. 1. Tab. 1 Uchovatelnost syrových potravin při chladírenském skladování (Doyle at al., 2001) Průměrná doba skladování ve dnech při: Potravina 0 C 22 C Maso Ryby Drůbež Ovoce Listová zelenina Okopaniny Existuje však řada dalších choulostivých potravin, které nelze v chladničkách uchovávat déle než několik dní. Toto se týká především potravin s velkým obsahem vody, jako jsou např. ryby, jemné druhy ovoce (jahody, maliny) a letní druhy zeleniny (špenát, hrách apod.). Aby bylo možno prodloužit uchovatelnost takovýchto potravin na potřebnou dobu několika měsíců, je nutno snížit skladovací teploty hluboko pod bod mrazu (Los, 2007). 13

14 Mrazení Mrazené potraviny získávají u spotřebitelů stále větší oblibu a množství mrazených výrobků rok od roku stoupá. Mrazením je možné uchovat potraviny v čerstvém stavu několik měsíců a výrobky má spotřebitel ihned k dispozici, popřípadě je může přímo konzumovat (Arpai, Bartl, 1977). Pod pojmem mrazené potraviny se rozumějí ty, které jsou hluboko zmrazené a skladované při mrazírenských teplotách, to je v intervalu mezi jejich bodem mrazu a teplotou 18 C (Görner,Valík, 2004). Způsoby mrazení K dosažení zmrazení potravin jsou dostupné 2 základní postupy, a to rychlé, nebo pomalé mrazení: - Rychlý postup zmrazení: proces, při kterém je teplota potraviny snížena na teplotu kolem 20 C za 30 minut. Tohoto může být dosaženo přímým ponořením či nepřímým kontaktem potraviny s chladivem a užitím proudu studeného vzduchu proudícího přes potravinu, která se tímto ochlazuje, až zmrazí (Jay et al., 2005). Tímto postupem se značně zmenší hromadění vody v mezibuněčných prostorách a ztráta šťávy a živin po rozmrazení (Los, 2007). - Pomalý postup zmrazení: proces, pomocí kterého je požadované teploty dosaženo za 3 až 72 hodin. Toto je v podstatě typ mrazení, používaný v domácích mrazničkách (Jay et al., 2005). Podle Jay et al. (2005) má rychlé zmrazení z hlediska celkové kvality produktu více výhod. Technologie rychle zmrazených potravin si získala popularitu, protože se pomocí ní docílí vysoce kvalitní konečný produkt. Pokud se jedná o rychlý proces mrazení, zůstávají rostlinné buňky prakticky neporušené, zatímco pomalé mrazení může zapříčinit zničení těchto buněk, a následné zkažení výrobku (Heredia et al., 2009). Negativní změny po zmrazení Většina mrazených produktů je pobytem v mrazničce poznamenána (Jay et al., 2005). Voda ve tkáních rostlinného i živočišného původu je v podobě značně složitých roztoků a vyskytuje se jako voda volná, voda vázaná biochemicky a vázaná koloidně. Pro jakost zmrazených potravin rostlinného i živočišného původu je velmi důležité, aby 14

15 rozdělení vody v jednotlivých místech tkáně zůstalo co nejpodobnější rozdělení v čerstvém, nezmrazeném stavu (Los, 2007). U rychlého způsobu zmrazení vznikají malé ledové krystalky uvnitř buňky, zatímco pomalým mrazením velké extracelulární, což je méně žádoucí. Růst krystalů je jedním z faktorů, které nejvíce ovlivňují kvalitu dané potraviny (Jay et al., 2005). Hustá síť drobných krystalů poškozuje tkáň mechanicky méně než velké krystaly (Los, 2007). Ledové krystaly totiž rostou co do velikosti a zapříčiňují tak zničení buňky porušením membrány a vnitřních struktur, což se projeví u rozmrazených výrobků tím, že mají od toho původního zcela jinou strukturu a chuť. Tedy, čím rychlejší zmrazení, tím menší krystalky se utvoří a tím je pak kvalita potravin po rozmrazení lepší. Produkty, které byly zamrazeny pomalým způsobem, mají po rozmrazení tendenci ztrácet více vody (šťávy), než ty rychle zmrazené (Jay et al., 2005). Jay et al. (2005) také uvádějí, že během zmrazování se voda z potravin ztrácí z roztoku a přeměňuje se do ledových krystalů o vysokém stupni čistoty. Navíc je mrazení doprovázeno změnami v takových vlastnostech potravin, jako je např. jeho ph, celková acidita, viskozita, osmotický tlak a oxidačně redukční potenciál. Potraviny, které jsou během mrazírenského skladování nesprávně či nedokonale zabaleny, mohou prodělat tzv. spálení mrazem. Toto je charakteristické u světle zbarvených produktů a takto postižená místa se projeví hnědým zabarvením, které je způsobeno ztrátou vlhkosti na povrchu dané potraviny. Je to stav nevratný, známý převážně u ovoce, drůbeže, masa a ryb, a to jak v syrovém stavu, tak i ve stavu po uvaření (Jay et al., 2005). Běžným způsobem, jak prodloužit skladovací dobu čerstvých, nebo částečně konzervovaných potravin, je tedy použití snížení teploty. Takto uměle vytvořené, energeticky bohaté prostředí, je vhodným prostředím pro psychrotrofní a psychrofilní mikroorganismy (Gould, Russell, 1991), které snášejí nízké teploty lépe a odumírají oproti ostatní mikroflóře relativně pomalu (Arpai, Bartl, 1977). 15

16 3.3 Mikroorganismy a teplota Základní pojmy Jedním z hlavních činitelů, které podmiňují nejen intenzitu, ale vůbec možnost života mikroorganismů, je teplota prostředí. V životě mikrobů rozeznáváme tři kardinální body teploty: optimum, maximum a minimum. Optimální teplota je ta, při níž probíhají životní pochody nejlépe a zpravidla nejrychleji, tepelné optimum se však pro různé životní pochody různí (Hampl, 1968). Jak uvádějí Doyle et al. (2001), nad rozmezím optimálních teplot se růstová rychlost mikrobů snižuje strmě a při teplotách bod tepelným optimem je růst snížen také, ale více pozvolna. Maximální teplota je nejvyšší teplota, při níž ještě probíhá růst i množení mikrobů, jestliže ostatní faktory prostředí zůstávají nezměněny; Minimální teplota je taková, při níž ještě probíhá růst a množení mikrobů. Jestliže se mění jeden nebo více vnějších činitelů, výška této teploty může kolísat. Rychlost množení je při minimální teplotě velmi malá. Jestliže klesá teplota z optima na minimum, rychlost množení stále progresivně klesá. Stanovení minimální teploty je velmi problematické, neboť není předepsaná doba, po které má být růst odečítán, doba je však hlavním faktorem při určování minimální teploty. Minimální teplota pro růst bakterií může být často až o 30 C nižší, než teplota optimální, zatímco maximální teplota převyšuje optimum většinou jen o 5 C až 10 C (Hampl, 1968) Dělení mikroorganismů dle teploty prostředí Odlišné skupiny mikroorganismů mají různé nároky na teplotu prostředí, ve kterém se mohou, a nebo se mají rozmnožovat a metabolizovat (Görner, Valík, 2004). Podle Doyle et al. (2001) může být bakterie klasifikována jako psychrofilní, psychrotrofní, mezofilní a termofilní, a to podle toho, jak ovlivňuje teplota jejich růst. 16

17 Mezofilní mikroorganismy Jay et al. (2005) uvádějí, že jako mezofilní jsou označovány takové mikroorganismy, kterým se nejlépe daří ve 20 C až 45 C, s optimem mezi 30 C až 40 C. Patří k nim většina bakterií, které způsobují otravu potravinami. Jsou to zejména některé druhy a sérovary rodu Salmonella, dále Clostridium botulinum typu A a B, Clostridium perfringens, Staphylococcus aureus a jiné. Do skupiny mezofilních mikroorganismů patří i bakterie z čeledi Enterobacteriaceae, jakož i většina grampozitivních bakterií, např. rody Bacillus, Clostridium, Micrococcus a bakterie mléčného kvašení. Jejich optimální teplota je mezi 30 C až 40 C (Görner, Valík, 2004). Mezofilní kmeny mohou být nalezeny i na potravinách uložených při chladničkových teplotách. Zde již zřejmě nerostou. Mělo by být poukázáno na to, že někteří tito mikrobi umějí růst i přes mezofilní rozpětí, a to při teplotách od 0 C až k více než 40 C. Jedním z takových organismů je např. Enterococcus faecalis (Jay et al., 2005) Termofilní mikroorganismy Je to taková skupina mikrobů, která dobře roste v 45 C a více, s optimem mezi 55 C a 65 C (Jay et al., 2005). Podle Görnera a Valíka (2004) mají termofilové minimální teplotní rozmezí mezi 40 C až 45 C, optimum 55 C až 75 C a maximum 60 C až 90 C. Skupina termofilů je zajímavá z hlediska biologického, z toho důvodu, že většina jich žije a aktivně se rozmnožuje při teplotách, které na běžné mezofilní organismy jinak působí ničivě. Většina termofilů vznikla z mezofilních organismů, což potvrzuje skutečnost, že z kultur mezofilů je možné získat uměle při postupně zvyšovaných teplotách kmenyy termofilní (Hampl, 1968). Jejich vysoká metabolická aktivita při teplotách, pro jiné mikroorganismy nefyziologických, je výsledkem odlišného složení bílkovinných složek jejich enzymů. Vyšší teploty způsobují změny ve fyzikálně chemickém složení buněčných bílkovin, v nasycenosti lipidů (při vyšší teplotě obsahuje buňka více nasycených mastných kyselin) a mění se regulační systém osmózy (Grieger et al., 1990). Termofilní mikroorganismy mají své zástupce mezi rody Bacillus (B. stearothermophilus), Clostridium (C. thermosaccharolyticum), Lactobacillus (L. delbrueckii subsp. bulgaricus), mezi aktinomycetami (Thermoactinomycetes, Thermomonospora) a 17

18 v některých jiných rodech (Grieger et al., 1990), Jay et al. (2005) ještě dodává rody Paenibacillus, Geobacillus, Alicyclobacillus a Thermoanaerobacter Psychrofilní a psychrotrofní mikroorganismy Takové mikroorganismy, které dobře rostou při teplotě 7 C a nižší a mají optimum mezi 20 C a 30 C se označují jako psychrotrofní (Jay et al., 2005). Doyle et al. (2001) uvádějí, že u psychrotrofů je optimum okolo 25 C a nemohou růst nad 40 C. Praví psychrofilové pak podle něj mají optimální růstovou rychlost při 15 C a nemohou růst nad 25 C. Shoduje se ale v tom, že obě tyto uvedené skupiny rostou, i když pomalu, při 0 C. Jak je vidět, názory na rozmezí teplot se velmi různí. Podle Hampla (1968) mohou psychrofilní mikroorganismy růst i pod 0 C, minimální teplota dosahuje až 10 C, optimum růstu leží v rozmezí 20 C až 40 C, tepelné maximum může dostoupit až 45 C. Görner a Valík (2004) zase uvádějí pro psychrofilní mikroorganismy minimum 5 C až +5 C, optimum 12 C až 15 C a maximum 15 C až 20 C a pro psychrotrofní potom minimum 5 C až +5 C, optimum 25 C až 30 C a maximum 30 C až 35 C. Ať již tak, či tak, obě skupiny mikroorganismů uvedených výše se adaptovaly na nízké teploty. Vlastnosti psychrobakterií, které jsou hlavním tématem mé diplomové práce, budou podrobněji popsány v následujících kapitolách Rostou při nízkých teplotách i plísně a kvasinky? Plísně Jay et al. (2005) uvádějí, že plísně jsou schopny růst v širokém rozmezí ph, osmotického tlaku, obsahu živin a také teploty, podobně jako bakterie. Zejména některé kmeny rodů Aspergillus, Cladosporium a Thamnidium jsou schopny růstu i v chladničkových teplotách, kde mohou napadat vejce, hovězí maso a ovoce. Jako psychrofilní se též ukázaly rody Mucor a Geotrichum a kmeny Penicillium expansum, Penicillium notatum, Penicillium purpurogenum, Rhizopus niger a Botrytis cinerea (Arpai, Bartl, 1977). Plísním se tedy daří i při nízkých teplotách. 18

19 Kvasinky Podobně jako u ostatních mikroorganismů, mohou se i kvasinky podle teploty rozdělit na psychrofilní, mezofilní a termofilní. Teplotní rozsah růstu kvasinek je od několika stupňů pod nulou až do několika stupňů blížících se 50 C, rozmezí teplot však u individuálního kmene obvykle nepřekračuje 40 C a častěji bývá užší (Deák, 2008). Vzhledem k tématu mé diplomové práce se blíže zaměřím pouze na skupinu kvasinek psychrofilních a na vliv teploty prostředí na ně. Psychrofilní kvasinky Jak uvádí Schreck (2006), psychrofilní kvasinky jsou schopny růstu mezi 5 C až 18 C, obligátně psychrofilní kmeny pak mají horní hranici tohoto rozmezí limitováno 20 C. Psychrofilní kvasinky, které se adaptovaly na nízké teploty, jsou velmi důležité organismy, které způsobují kažení mrazených potravin. Na nízké teploty jsou adaptovány pomocí speciálních ochranných mechanismů, zahrnujících produkci protimrznoucích bílkovin. Po utrpění chladového šoku (v asi 4 C až 10 C) dochází k zástavě dělení buněk a dochází k tvorbě právě těchto specifických proteinů, které zapříčiní tepelnou hysterezi. Ve stavu hystereze se sníží bod mrznutí kvasinek bez ovlivnění jejich bodu tání a také se zabrání rekrystalizaci ledu, což je hlavní příčina zničení kvasinkové buňky, spočívající v porušení jejich membrány vakuoly (Schreck, 2006). Kažení potravin Kažení potravin pří nízkých teplotách je u kvasinek chápáno jako změny produktu při chlazení, při teplotě 5 C a nižší. Je sem tedy zahrnuto i kažení mrazených potravin pod bodem mrazu (0 C). Proces kažení je za chladných teplot málokdy doprovázeno produkcí plynu, a tak jsou obvykle patrné pouze změny vyvolané povrchovým růstem kvasinek na kazícím se produktu. Nízké teploty sice nevytváří pro většinu kvasinek způsobujících kažení přátelské prostředí a potraviny skladované za těchto teplot pro ně nejsou typickou živnou půdou (jedná se především o mrazenou zeleninu, jako je hrách, dále chlazené a mrazené ryby a maso), avšak obvyklý rozklad uvedených potravin bakteriemi je díky nízké teplotě již zastaven a vyvstává tak příležitost ke kažení potravin právě pomaleji rostoucími psychrofilními kvasinkami (Schreck, 2006). 19

20 Zástupci psychrofilních kvasinek Za psychrofilní jsou podle Deáka (2008) považovány kvasinky jako Leucosporidium scottii a Mrakia frigida, mající minimální teplotu růstu jen od 1 C po 4 C a maximum kolem 20 C. Schreck (2006) uvádí jako psychrofilní rovněž rod Leucosporidium spp. (např. L. frigidum) a dále rod Torulopsis spp. (např. Torulopsis psychrophila). Arpai a Bartl (1977) potom výčet doplňují ještě o zástupce rodů Debaryomyces, Candida a Rhodotorula. Co se týče role kvasinek jako původců kažení chlazeného masa baleného za vakua, je zatím dostupných pouze velmi málo informací. Podle Hvízdalové (2010) byly při nedávném výzkumu vakuově baleného masa izolovány a identifikovány kvasinky, o nichž až dosud nebylo nic, v souvislosti s jejich výskytem v mase, publikováno. Jedná se o druhy rodu Mrakia, které byly nalezeny na Antarktidě, v ledovcích Patagonie a v Alpách. Dané izoláty byly prostřednictvím molekulárně biologických a biochemicko morfologických metod identifikovány jako Mrakia gelida a Mrakia robertii. 3.4 Psychrofilní mikroorganismy Charakteristika Termín psychrofil byl poprvé použit již roku 1902, a to Schmidt-Nielsenem. Označil tak bakterie schopné růst při 0 C. Tento pojem je nyní používán pro organismy rostoucí v rozmezí od teplot pod nulou až ke 20 C (Jay et al., 2005). Hampl (1968) uvádí, že psychrofilní (z řeckého psychros = studený, philos = přítel), chladnomilní mikrobi jsou definováni jako mikroorganismy, které rostou značně a bohatě při 0 C, tj. tvoří kolonie na pevném živném prostředí viditelné pouhým okem během 2 týdnů při 0 C, kvantitativně vyjádřeno jsou to mikrobi, jejichž generační doba při 0 C je 48 hodin. Mohou růst i pod 0 C, minimální teplota dosahuje až 10 C. Psychrofilové jsou obvykle označovány jako mikroorganismy, které vykazují růst při optimální teplotě 15 C a nižší. Při 0 C a níže mohou psychrofily světélkovat, pohybovat se a syntetizovat zelená, žlutá, oranžová, červená a jiná barviva; zkvašovat sacharidy, rozkládat bílkoviny, tvořit indol a obecně vykonávat všechny biochemické pochody jako při vyšší teplotě, ale přiměřeně pomaleji (Hampl, 1968). 20

21 3.4.2 Výskyt Nedávné výzkumy ukázaly, že psychrofilové jsou více rozšířeni, než se předpokládalo. Psychrofilní bakterie jsou zastoupeny ve všech třech sférách života, mnoho z těchto organismů je methanotrofní, sulfát redukující, železo oxidující a methanogenní (Montross, 2005). Psychrofilní mikroorganismy rostou, na rozdíl od psychrotrofních, v užším rozmezí teplot (Wyn-Williams, 1990). Úspěšně kolonizovaly trvale studená stanoviště, jako jsou polární a alpské regiony, nebo hlubinné vody (Hoyoux et al., 2004), ve kterých jsou nedílnou součástí potravního řetězce. Hluboká moře jsou vedle toho i oblasti s vysokým tlakem vody, a tak je mnoho izolátů získaných při výzkumu tohoto epitopu barofilní či barotolerantní (Stibor, Králová, 2000). Studená stanoviště představují více než ¾ zemského povrchu a jsou vystaveny teplotám, které jsou více či méně trvale pod 5 C. Mikrobiální růst a metabolická aktivita byly zaznamenány také ve 3 až 6 metrech ledu trvale zmrzlých jezer a v povrchovém sněhu na Jižním Pólu, kde i nejvyšší letní teploty zůstávají hodně pod nulou (alespoň 10 C) (Hoyoux et al., 2004). Cavicchioli et al. (2002) uvádějí, že byly tyto mikroorganismy nalezeny obývající jak suchozemské, tak i vodní prostředí v polárních a horských oblastech a v mělkých podzemních regionech (např. jeskynních systémech), na i v rostlinách a živočiších obývajících studené oblasti a v neposlední řadě také v chladicích zařízeních. Narozdíl od mikroorganismů, které mohou přestát pouze přechodné období v chladu, musí mít ty, které obývají chladné prostředí trvale, všechny buněčné procesy optimálně přizpůsobeny růstu při nízkých teplotách Adaptace na chlad Pro udržení rychlosti metabolismu a jejich prosperování v chladném prostředí museli tito extremofilové vyvinout obrovské množství úprav (Hoyoux et al., 2004). Tyto adaptační úpravy zahrnují jak změny ve struktuře proteinů (enzymy), tak i změny ve složení lipidů tvořících buněčné mambrány. Strukturní změny proteinů mají na rozdíl od lipidových, které mají genotypový i fenotypový charakter, pouze charakter genotypový (Stibor, Králová, 2000). Psychro bakterie vykazují vlastnosti výrazně odlišné od mikrobů jiných tepelných tříd (např. teplomilných) (Cavicchioli et al., 2002). 21

22 Změny ve struktuře proteinů Když teplota klesá, v psychrofilech je vyvolána syntéza specifických proteinů (Cold-shock proteiny) umožňující pokračování všech specifických činností i za nízkých teplot (Deming, 2002). Jak uvádí Aghajari (1998), enzymy z psychrofilních mikroorganismů pracují i při teplotách blízkých 0 C, při kterých se činnost jejich mezofilních a termofilních protějšků drasticky snižuje. Obecně se předpokládá, že termofilnost je spojena s tuhými proteiny, zatímco psychrofilní enzymy mají tendenci být více flexibilní. Enzymy, produkované psychrofily, se vyznačují za nízkých teplot vysokou katalytickou aktivitou, ale jsou teplotně labilní (Hoyoux et al., 2004). Studie srovnávající tyto enzymy s jejich mezofilními a termofilními protějšky ukázaly, že molekulární podstata jejich adaptace na teploty blízké 0 C je z největší části způsobena snahou zachovat flexibilitu jejich struktury. Ta vychází z oslabení intramolekulárních interakcí a naopak ze zesílení interakcí s rozpouštědlem. Tyto modifikace jsou však doprovázeny malou stabilitou za vyšších teplot, což je cena za jejich vysokou aktivitu při teplotách obecně považovaných za nízké (Stibor, Králová, 2000). Zejména díky jejich vlastnostem nabízejí psychrofilní enzymy vysoký potenciál nejen pro základní výzkum, ale i pro biotechnologické účely (Hoyoux et al., 2004), viz. kapitola Změny v lipidové membráně Jak uvádějí Stibor a Králová (2000), základním rysem všech změn, a to jak změn ve složení mastných kyselin, tak ve složení fosfolipidů, je snaha o zachování membránové fluidity (= přizpůsobivosti, pružnosti). Membrána mikroorganismů obsahuje lipidovou dvojvrstvu, která musí mít pro podporu většiny biologických funkcí patřičnou fluiditu (Hoyoux et al., 2004). Složení mastných kyselin lze jednoduše stanovit pomocí plynové chromatografie (Russel, 1997), která umožnila definovat, k jakým změnám při snížení růstové teploty u jednotlivých mastných kyselin dochází. Mezi základní z nich patří syntéza nenasycených mastných kyselin, zkracování délky jejich řetězce, větvení mastných kyselin a vzrůst poměru anteiso/iso větvení mastných kyselin (Stibor, Králová, 2000). Uvedené adaptivní změny, jak ve struktuře proteinů, tak i ve složení membránových lipidů, je u obou skupin mikroorganismů, psychrofilních i psychrotrofních, stejné. 22

23 3.4.4 Zástupci Doyle et al. (2001) uvádějí jako psychrofilní rod Flavobacterium, tento však bývá u některých autorů řazen mezi mikroorganismy psychrotrofní, např. u Jay et al. (2005), nebo u Görnera a Valíka (2004). Margesin a Schinner (1993) považují za psychrofilní také bakterii Aquaspirillum sp. Jak ale bude popsáno dále, pravých psychrofilů existuje málo Význam v potravinářství Biotechnologické aplikace Psychrofilní, ale i psychrotrofní mikroorganismy, představují velký potenciál pro současné biotechnologie (Stibor, Králová, 2000), jako jsou např. nakládání s odpady při pokojové teplotě, enzymologie, potravinářský průmysl a lékařství (Margesin, Schinner, 1993). Toto je dáno právě díky jejich unikátní schopnosti žít, růst a množit se za teplot, které jsou člověkem vnímány jako extrémní (Stibor, Králová, 2000). Podle Stibora a Králové (2000) spočívají hlavní výhody použití produktů z psychrobakterií: v rychlém a ekonomickém ukončení procesu za mírných tepelných podmínek, ve vysokých výtěžcích při reakcích zahrnujících teplotně senzitivní složky, v ovlivňování specifity při reakcích katalyzovaných enzymy a ve snížení nákladů eliminací chladících/ohřívajících kroků v procesu. Jahandideh et al. (2006) vidí výhodu použití psychrofilních enzymů také v jejich specifické aktivitě, kterou se sníží množství potřebných enzymů, a v jejich jednoduché inaktivaci. Jak uvádějí Margesin a Schinner (1993), nízká tepelná stabilita enzymů psychrobakterií může omezovat jejich používání, ale tato skutečnost je kompenzována právě výhodami uvedenými výše. K nejpoužívanějším enzymům, které našly uplatnění v potravinovém průmyslu, patří lipázy a proteázy (Stibor, Králová, 2000). Dle Margesina a Schinnera (1993) jsou lipázy využívané jako enzymy modifikující aroma nebo detergenty přídatných látek. Proteázy jsou také v potravinářství široce rozšířené, a to při zpracování piva, výrobě fermentovaných potravin, používají se v pekárnách a ve výrobě sýrů pro urychlení jejich zrání. 23

24 V pivovarnictví mají vedle proteáz význam ještě amylázy, které zrychlují vystírání sladu za nízkých teplot. Dalším příkladem, kdy měl výzkum psychrobakterií přímou návaznost na biotechnologickou aplikaci, je využití proteinů tvořících krystaly ledu při výrobě zmrzliny. Tvorba krystalků byla pozorována u řady psychrotrofních bakterií parazitujících na rostlinách (Stibor, Králová, 2000). Jak popisují Karasová et al. (2002), enzymem využívajícím se především v mléčné technologii, je β- galaktosidáza. Tento enzym nabízí využití zejména v přípravě bezlaktózového mléka, které je důležité pro lidi trpící laktózovou intolerancí Význam při kažení potravin Na kažení potravin se psychrofilové účastní jen zřídka. Častěji se kazí potraviny díky skupině mikroorganismů psychrotrofních a příčinou je skutečnost, že v přírodě se vyskytuje pouze velmi málo pravých psychrofilních bakterií. Jak uvádějí Jay et al. (2005), co se týče potravin, výskyt psychrofilů by se dal očekávat pouze na surovinách z oceánských vod a nebo z extrémně chladného klima. Z hlediska skladovatelnosti a zkázy potravin při nízkých teplotách (chladírenské teploty kolem 4 C) mají tedy významnější úlohu psychrotrofní bakterie (Görner, Valík, 2004). 3.5 Psychrotrofní mikroorganismy Charakteristika Jak uvádějí Jay et al. (2005), pojem psychrotrof byl okolo roku 1960 navrhnut pro organismy schopné růst při teplotě 5 C a méně. V současnosti je mezi mikrobiology široce užíván termín psychrotrof pro organismus, který roste v rozmezí teplot 0 C až 7 C a vytváří při něm viditelné kolonie za 7 až 10 dní. Protože někteří psychrotrofové mají schopnost růst i za teplot vysokých, asi 43 C, jsou to vlastně mezofilové. Mohou to být krátké i dlouhé tyčinky, koky, grampozitivní nebo gramnegativní, sporulující nebo nesporulující, aerobní i anaerobní (Grieger et al., 1990). Görner a Valík (2004) uvádějí, že převážná většina psychrotrofních bakterií jsou gramnegativní tyčinky. Psychrotrofnost není taxonomická vlastnost, vyskytuje se u různých rodů a druhů. Psychrotrofní mikroorganismy mají v cytoplazmatické membráně větší množství 24

25 nenasycených mastných kyselin, což jim umožňuje mít aktivní metabolismus i při nízkých teplotách (Görner, Valík, 2004). Adaptace na chlad je popsána výše, v kapitole Pro psychrofily i psychrotrofy je princip přizpůsobení nízkým teplotám stejný. Psychrotrofní mikroorganismy spolehlivě ničí pasterizační teploty. Již teplota 63 C za 10 s je dostačující k devitalizaci gramnegativních bakterií. Pasterizaci přežívají jen spóry a některé termofilní a termorezistentní vegetativní formy mikroorganismů (Grieger et al., 1990) Dělení psychrotrofních mikrobů a zástupci Jak uvádějí Jay et al. (2005), jelikož každý psychrotrof neroste v rozmezí 0 C až 7 C stejnou rychlostí, byly navrženy termíny eurypsychrotrof (eurys= široce rozšířený) a stenopsychrotrof (stenos= úzký). Eurypsychrotrofové (Enterobacter cloacae, Hafnia alvei, Yersinia enterocolitica) obvykle nevytváří viditelné kolonie dříve, než za 6 až 10 dní, zatímco stenopsychrotrofové (Pseudomonas fragi, Aeromonas hydrophila) tvoří viditelné kolonie asi za 5 dní. Významnou část psychrotrofních mikroorganismů tvoří bakterie z čeledi Pseudomodaceae, rody Pseudomonas, Flavobacterium a Alcaligenes, méně z čeledi Enterobacteriaceae, rody Escherichia, Enterobacter, Proteus, Aeromonas. Výjimečně se izolují psychrotrofní kmeny grampozitivních rodů, např. sporotvorného druhu Bacillus subtilis, zejména z potravin tepelně upravených (Görner, Valík, 2004). Psychrotrofní jsou podle Griegra et al. (1990) také někteří zástupci rodů Achromobacter, Alcaligenes, Serratia, Chromobacterium, Vibrio, Yersinia, Lactobacillus, Microbacterium, Streptococcus, Staphylococcus, Micrococcus, Corynebacterium, Sarcina, Actinomyces, Brevibacterium Výskyt Psychrotrofní bakterie jsou v přírodě velmi rozšířené, vyskytují se v půdě a ve vodě, jakož i na rostlinách a živočiších (Görner, Valík, 2004). Dále byly nalezeny v prachu, krmivu, ve výkalech zvířat (Grieger et al., 1990). Podle Stibora a Králové (2000) se nacházejí psychrotrofové v oblastech, kde dochází v průběhu roku k výkyvům teplot, na rozdíl od psychrofilů, kteří obývají trvale chladná stanoviště. Příkladem vý- 25

26 skytu psychrotrofů mohou být arktické a antarktické půdy, ve kterých se teplota pohybuje mezi 5 C až 10 C, avšak v krátkém letním období stoupá Význam v potravinářství Psychrotrofní mikroorganismy mají význam z hlediska biotechnologických aplikací, stejně jako psychrofilové, což bylo popsáno v kapitole Co se týče kažení potravin, Görner a Valík (2004) popisují, že tato skupina mikroorganismů vstoupila do pozornosti potravinářských mikrobiologů a technologů se vznikem potřeby více než jednodenního chladírenského skladování rychle se kazících potravin (syrové a pasterizované mléko, chlazená drůbež a jiné). Takto uložené potraviny se za několik dní zjevně, anebo diskrétně kazily. Později se ukázalo, že příčinou jsou bakterie, které rostou a štěpí bílkoviny a tuky surovin i při chladírenských teplotách. Gramnegativní psychrotrofní bakterie produkují extracelulárně proteolytické a lipolytické enzymy, které se účastní na vzniku pachuti v déle chlazeném syrovém i pasterizovaném mléce a z něho vyrobených mléčných produktů. Na chlazené drůbeži způsobují její osliznutí a barevné skvrny vyvolané pigmentujícími pseudomonádami (Görner, Valík, 2004). Některé z enzymů jsou termorezistentní a mohou si uchovat aktivitu i po pasterizaci, a tak způsobovat nežádoucí změny např. u mléčných výrobků (Grieger et al., 1990) Kažení základních druhů potravin činností psychrotrofních bakterií Kažení masa Maso je na základě svého chemického složení, fyzikálních vlastností a vysokého obsahu vody ideální živnou půdou pro mikroorganismy. Proto je náchylné ke kažení a častou příčinou chorob z potravin mikrobiologického původu (Görner, Valík, 2004). Maso je obvykle uchováváno při chladničkových teplotách, z důvodu, aby se prodloužila jeho skladovatelnost. Jak uvádějí Doyle et al. (2001), chlazení omezuje růst mezofilů, obvyklé hlavní složky mikroflóry počátečního kažení, ale dovoluje růst psychrotrofním bakteriím, které nakonec v mikroflóře dominují. Zpravidla se jedná o rody Pseudomonas, Lactobacillus, Moraxella, Acinetobacter nebo Brochotrix thermospacta. Podle Fernanda et al. (1995) se chlazené maso skladované aerobně kazí navzdory různorodosti počáteční mikroflóry díky gramnegativním psychrotrofním organismům, zastoupených převážně členy již uvedeného rodu Pseudomonas. 26

27 Mikrobiální kažení masa se uskutečňuje převážně od povrchu dovnitř. Viditelným znakem tohoto procesu je osliznutí masa, tvorba barevných skvrn a nepřirozeného pachu, což se projevuje počty bakterií 10 7 až 10 8 KTJ.cm -2. Se stoupající teplotou uchovávání, které bývá doprovázeno poklesem vodní aktivity na povrchu masa (osychání), dochází k uplatnění i jiných gramnegativních bakterií. Často jsou to Enterobacteriaceae, rody Serratia, Citrobacter, silně proteolytické druhy rodu Proteus a grampozitivní bakterie rodů Micrococcus, Staphylococcus a Bacillus. Pokud se maso nějakým způsobem rozdělí (nakrájí, namele), enormně se tím zvětší jeho povrch a také stoupá počet kontaminujících bakterií, které se urychleně rozmnožují. Kažení se tímto urychlí a pokud jsou přítomné i choroboplodné bakterie, vzniká nebezpečí onemocnění konzumentů mikrobiálního původu. Takto upravené potraviny se proto musí zkonzumovat ještě týž den, kdy došlo k jejich naporcování (Görner, Valík, 2004) Kažení mléka Podle Matselise a Roussise (1998) vylučují psychrotrofní bakterie rostoucí v chladném syrovém mléku teplu odolné proteinázy a lipázy, které způsobují změny mléčných výrobků. Psychrotrotrofové, kteří kazí syrové i pasterizované mléko, jsou zejména aerobní gramnegativní rody čeledi Pseudomonadaceae a příležitostně také zástupci čeledi Neisseriaceae a rodů Flavobacterium a Alcaligenes. Téměř 70 % z izolátů psychrotrofních mikroorganismů v syrovém mléce náleží k rodu Pseudomonas. Typické jsou i další rody, zahrnující rod Bacillus, Micrococcus, Aerococcus, Staphylococcus a také čeleď Enterobacteriaceae. Když je mléko udržováno při typické skladovací teplotě 3 C až 7 C, všechny tyto uvedené rody bývají přerosteny právě gramnegativními obligátními aeroby (především Pseudomonas spp.). Také Bacillus cereus bývá v syrovém mléce přítomen až v 80 % vzorků (Doyle et al., 2001). Na rychlost rozmnožování psychrotrofů v mléku má vliv jejich stav látkové přeměny v čase kontaminace, stupeň kontaminace a teplota mléka. Významný vliv má i rychlost ochlazení mléka po nadojení. V důsledku jejich enzymatické činnosti mohou v mléku a mléčných produktech vyvolat nevítané senzorické změny. Chuťové změny se obvykle projevují až při jejich obsahu vyšším než 10 6 KTJ.ml -1. Tato hranice je však závislá na převládajícím druhu psychrotrofa a na jeho biochemické aktivitě (Görner, Valík, 2004). 27

28 Pasterizační teploty spolehlivě ničí psychrotrofní mikroorganismy. Již teplota 63 C po dobu 10 sekund je dostačující k devitalizaci gramnegativních bakterií. Je-li zabráněno rekontaminaci, mléko může být skladováno bezpečně při 6 C až 8 C po dobu 48 hodin. Mléko odebrané ihned za pastérem neobsahuje žádné psychrotrofní mikroorganismy. Pasterizaci přežívají pouze spóry a některé termofilní a termorezistentní vegetativní formy mikroorganismů (Grieger et al., 1990). Psychrotrofní mikroflóra způsobující kažení mléka je zpravidla proteolytická, s mnoha izoláty schopnými produkovat extracelulární lipázy, fosfolipázy a další hydrolytické enzymy, ale neschopnými využívat laktózu. Za bakterie nejčastěji spojované se změnou chuti chlazeného mléka se považují Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas fragi, Pseudomonas putida a Pseudomonas lundensis. Jak již bylo zmíněno, vady mléka spojované s růstem psychrotrofních mikrobů souvisí s produkcí extracelulárních enzymů. Hořká chuť a hnilobné aroma mléka spolu s jeho koagulací je způsobeno proteolýzou. Žluklá nebo ovocná vůně je zase výsledkem lipolýzy (Doyle et al., 2001). Mikrobiální lipázy: Představují vedle proteáz nejdůležitější enzymy, které zhoršují kvalitu mléka a mléčných výrobků. Silnou lipolýzu v potravinách způsobují mikroorganismy rodů Achromobacter, Proteus, Bacillus, Micrococcus, Staphylococcus, Clostridium (Grieger et al., 1990). Görner a Valík (2004) doplňují výčet ještě o kmeny rodů Pseudomonas a Alcaligenes a Doyle et al. (2001) upřesňuje, že z rodu Pseudomonas se jedná hlavně o Pseudomonas fragi a Pseudomonas aeruginosa. Mikrobiální lipázy štěpí triacylglyceroly na diacylglyceroly a monoacylglyceroly a volné mastné kyseliny. Pro vznik smyslových vad mléka a mléčných výrobků jsou důležité mastné kyseliny s nízkým počtem uhlíků (C 4 až C 12 ), zvláště kyselina máselná. Přitom je potřeba, aby lipolytické mikroorganismy dosáhly hodnot nejméně ml -1 (Grieger et al., 1990). Jak uvádějí Doyle et al. (2001), hnilobná příchuť a zápach obvykle vyplývá z činnosti lipáz uvolňujících mastné kyseliny s malým počtem uhlíků (C 4 až C 8 ). Mastné kyseliny s vyšší molekulovou hmotností vytváří příchuť popsanou jako mýdlovitá. Ovocnou příchuť pak produkuje Pseudomonas fragi esterifikací volných mastných kyselin s ethanolem. 28

29 Optimum teploty produkce lipáz kolísá podle druhu mikroorganismu a je nižší než optimální teplota růstu. U psychrotrofů je to přibližně 20 C. Lipázy jsou však aktivní i při nižších teplotách. Zvýšený obsah volných mastných kyselin v syrovém mléce byl zjištěn při 4 C za 48 hodin a při 8 C za 24 hodin. Většina psychrotrofních mikroorganismů produkuje lipázy v pozdní logaritmické fázi a časně stacionární fázi růstu. Proto mezi počtem organismů a koncentrací enzymu není přímý proporcionální vztah. Mikrobiální lipázy jsou na rozdíl od mléčných lipáz termorezistentní, zachovávají si tedy aktivitu i po pasterizaci, v čemž spočívá jejich nebezpečí (Grieger et al., 1990). Termorezistence mikrobiálních lipáz je rozdílná podle druhu lipolytických organismů. Při dlouhodobé pasterizaci (63 C za 30 min) některé lipázy ztrácí 15 až 60 % své aktivity, při šetrné pasterizaci (72 C za 17 s) ztrácí 2 až 40 % aktivity a při záhřevu 130 C trvajícím 5 až 10 minut se jejich aktivita sníží na minimální hodnoty. Bylo prokázáno, že k inaktivaci některých lipáz je potřeba teplota až 150 C (Görner, Valík, 2004). Mikrobiální proteázy: Většina psychrotrofů produkuje v mléce vedle lipáz také enzymy proteolytické. Mezi nejsilnější producenty patří rody Pseudomonas, Flavobacterium, Proteus, Bacillus, Alcaligenes a některé plísně a kvasinky (Grieger et al., 1990). Proteolytické enzymy psychrotrofních bakterií mají podle druhu odlišný charakter. Některé štěpí celou molekulu bílkoviny (Bacillus, Pseudomonas), jiné až nižší štěpné produkty bílkovin (Escherichia, Proteus). Podle Görnera a Valíka (2004) je termorezistence některých proteáz vysoká. Při 77 C za 17 sekund byla ztráta aktivity asi 20 %, při 140 C za 5 sekund asi 70 %. Mikrobiální proteázy mohou ve významné míře ovlivnit skladovatelnost trvanlivého mléka. I malé reziduální množství, které odolalo tepelnému namáhání při výrobě trvanlivého mléka, mohou za dlouhý čas jeho skladování (týdny až měsíce) štěpit κ-kasein s následkem vzniku koagulátu kaseinů. Výzkumy se přišlo na to, že proteázy přednostně hydrolyzují κ-kasein před ostatními druhy. Degradace kaseinu v mléce enzymy produkovanými psychrotrofy má za následek uvolňování hořkých peptidů. Právě hořká chuť je běžnou vadou pasterizovaného mléka, které bylo vystaveno postpasterizační kontaminaci psychrotrofními bakteriemi. Pokud proteolýza pokračuje, dochází ke vzniku hnilobné příchutě, způsobené 29

30 degradací produktů o nižší molekulové hmotnosti, jako jsou např. amoniak, aminy a sulfidy (Doyle et al., 2001) Mikrobiální kontaminace vajec Na mikrobiální kažení jsou obzvlášť náchylná poškozená vejce (např. s prasklou skořápkou, znečištěným povrchem). Náchylnost k jejich kažení se zvyšuje i s prodlužující se dobou uchovávání vajec. Prevencí proti tomuto procesu je skladování vajec při nízkých teplotách. Tomu odpovídá chladírenské skladování při 0 C až 5 C. Ani při těchto teplotách však kvůli schopnosti růstu psychrotrofních bakterií nejsou vejce dokonale ochráněna. Nejčastější vada vajec uchovávaných v chladu je zelená hniloba, způsobená obvykle psychrotrofním mikroorganismem Pseudomonas fluorescens. Název této vady je odvozen od zelenkavého zabarvení bílku v počátečním stádiu jeho vývoje, které je způsobeno fluoreskujícím pigmentem produkovaným P. fluorescens. V pozdějším stádiu se žloutek rozloží a pomísí s bílkem. Tato fáze bývá provázena nepříjemným ovocným, nebo nasládlým zápachem. Bezbarvá, bílá anebo světlá hniloba bývá způsobena některými druhy rodu Pseudomonas a Alcaligenes a některými enterobakteriemi. Černou hnilobu provází špinavě hnědé zabarvení celého vejce a hnilobný zápach s jednoznačně rozeznatelným sirovodíkem (tvorba plynu). Tuto chybu způsobují obvykle rody Proteus nebo Pseudomonas (Görner, Valík, 2004). 3.6 Psychrotrofní organismy způsobující alimentární onemocnění Mezi nejvýznamnější zástupce z psychrotrofních mikroorganismů způsobujících alimentární onemocnění patří bezesporu Bacillus cereus a Listeria monocytogenes Alimentární onemocnění Nákazy z potravin (alimentární) jsou taková onemocnění, která jsou způsobena přítomností příslušných choroboplodných mikroorganismů v konzumované potravině (anebo v pitné vodě) a po jejich vniknutí do organismu člověka se v něm usídlují a pomnožují (Görner, Valík, 2004). 30

31 3.6.2 Bacillus cereus Charakteristika a výskyt Jak uvádějí Rasko et al. (2005), B. cereus je grampozitivní, pohyblivý mikrob, tvořící endospóry. Buňky mají v průměru 1,0 až 1,2 µm a délku 3 až 5 µm. Roste v širokém rozmezí teplot za aerobních až fakultativně anaerobních podmínek. Většina případů otravy jídlem připisovaná rodu Bacillus je spojena právě s mikroorganismem Bacillus cereus (Páčová et al., 2003), u něhož byla tato schopnost zaznamenána v Evropě již roku 1906 (Jay et al., 2005). Obr. 1 Bacillus cereus ( B. cereus je ubikvitární a může být izolován z půdy, prachu, vody a různých potravin (Dierick et al., 2005). Vzhledem k jeho všudypřítomnosti je znám jako potenciální kontaminant potravin jak rostlinného (hlavně zeleniny), tak i živočišného původu. Do potravin se dostává především kontaminovanými surovinami, a to hlavně zeleninou, moukou, kořením, cukrem. V těchto surovinách je přítomen ve formě odolných spór, které mu umožňují snášet suché prostředí a přežívat i běžné tepelné režimy při výrobě potravin, např. pasterační teploty. Jeho výskyt byl prokázán v tepelně upravené či vařené stravě, pečeném chlebu, vařené rýži, v těstovinách, mase, mléku a mléčných produktech (Rajkovic et al., 2006). Podle Páčové et al. (2003) omezuje tento mikrob trvanlivost pasterizovaného mléka. 31

32 Onemocnění konzumenta Bednář et al. (1996) uvádějí, že jako podmíněný patogen se může bacil uplatnit pouze u hostitele s výrazně sníženou imunitou. Bacillus cereus může vyvolat otravu z potravin, a to ve dvou klinicky odlišných formách: syndrom průjmu: inkubace 8 až 16 hodin, s bolestmi břicha a profusními vodnatými průjmy; syndrom zvracení: s krátkou inkubací 1 až 5 hodin, nevolností a zvracením. Obvykle bývá bez průjmu. U syndromu průjmu jde o účinek enterotoxinu a za syndrom zvracení je zodpovědný emetický toxin. K onemocnění dochází po pozření vysoce kontaminované potravy Prevence a léčba Jeho rozšířený výskyt a odolnost toxinů staví tohoto mikroba na pozici těžce kontrolovatelného organismu. Zatímco buňky Bacillus cereus mají schopnost přichytit se na povrch nerezové oceli a zde vytvořit biofilm, jeho spóry jsou přilnavé ještě více. Spóry a vegetativní buňky, usazené v biofilmu, jsou tímto více chráněny před jejich inaktivací dezinfekčními prostředky. Vysoká odolnost vůči teplu (126 C za 90 min), snášení extrémního ph (2 až 11) a proteolytické enzymy dělají jeho zničení nebo vymýcení z potravin ještě složitější. Tímto se takovéto potraviny stávají velkým rizikem pro jejich konzumenty (Heredia et al., 2009). Dalším problémem je, že chlazení nedokáže zabránit růstu tohoto psychrotrofního mikroba. Avšak dostatečný záhřev, nízké teploty, nízká aktivita vody, nebo snížené ph v potravině může zničit, nebo značně zredukovat růst a klíčení spór enterotoxigenního Bacillus spp., a tím předcházet tvoření toxinů v potravině. Proto by mělo být dodržování těchto pokynů a správné zacházení s potravinami používáno jako prevence ke snížení rizika alimentárního onemocnění způsobeného Bacillus cereus. V méně závažném případě alimentární nákazy postačí jako léčba perorální rehydratace a dieta, u těžšího průběhu, zvláště se zvracením, je nutno provést (nitrožilní) rehydrataci organismu. 32

33 3.6.3 Listeria monocytogenes Jak popisuje Duben (2007), onemocnění, které bakterie listerie způsobují, tzv. listerióza, je známo zhruba padesát let, a to především díky dokonalejším diagnostickým metodám. Samotná bakterie Listeria monocytogenes je známa již téměř sto let. Byla pojmenována po anglickém chirurgovi Josephu Listerovi ( ), který se zasadil o radikální pokles pooperační úmrtnosti důsledným dodržováním antiseptických opatření v operačních sálech. Listeriózou neonemocní pouze člověk, tímto bakteriálním onemocněním mohou trpět všichni obratlovci. Zdravý jedinec se s malým množstvím bakterií vyrovná bez problémů. Oslabený si však s jejich masivním množstvím neporadí (Duben, 2007). Odhaduje se, že tato bakterie je příčinou přibližně 0,5 1 % všech hromadných alimentárních onemocnění. Mezi těmito nemocemi má však zcela nesporné prvenství v procentu mortality, které dosahuje až 33 % z celkového počtu onemocnění (Blažková et al., 2005) Charakteristika Listerie jsou krátké (0,5 až 2 µm) grampozitivní tyčky jevící sklon přecházet v kokoidní formy a tvořit řetízky. Rostou za fakultativně anaerobních podmínek, netvoří spóry a jsou pohyblivé (mají bičíky). Druhy Listeria monocytogenes a Listeria ivanovii mohou být patogenní pro lidi i zvířata. Virulence Listerie monocytogenes bývá v závislosti od kmene silně variabilní. Jiné druhy listerií se považují za nepatogenní (Görner, Valík, 2004), a to L. innocua, L. seeligeri, L. welshimeri a L. grayi (Doyle et al., 2001). Jak uvádějí Blažková et al. (2005), tento mikroorganismus roste dobře na běžných kultivačních půdách (živný agar, krevní agar) a v širokém teplotním rozmezí. Optimální teplota růstu se pohybuje okolo 37 C. Teplota velmi ovlivňuje patogenní vlastnosti bakterie. Většina kmenů se pomnožuje v rozmezí ph 5,6 až 9,6, přičemž optimální ph pro růst je 7,0 až 7,5. V kyselejším prostředí (ph < 3,5) je devitalizovaná (Görner, Valík, 2004). Listerie se dobře množí i při vysokých koncentracích soli (10 %). Listeria monocytogenes se pomnožuje v teplotním rozmezí 0 C až 44 C, tedy i při chladničkové teplotě. Zatímco při 0 C trvá její pomnožení 7,5 dne, při teplotě 35 C, která je podle těchto autorů optimální, se pomnoží za 41 minut (Šatrán, Duben, 2006). 33

34 Schopnost vysoké termotolerance a růstu za nízkých teplot staví tohoto psychrotrofního mikroba do spojitosti především s kontaminací chlazených potravin (Hwan Oh, Marshall, 1993). Obr. 2 Listeria monocytogenes ( Výskyt Podle Bednáře et al. (1996) je prokázáno, že Listeria monocytogenes i jiné druhy listerií jsou ubikvitární. Jsou rozšířené nejen u zvířat, ale i ve volné přírodě, ve vodě a na rostlinách nebo v produktech, které jsou z nich vyráběny (siláž). Listeria monocytogenes je pro mnohá hospodářská zvířata, jako ovce, kozy, hovězí dobytek a drůbež patogenní mikroorganismus. Pramenem nákazy těchto zvířat bývá nedostatečně zfermentovaná siláž o ph > 5 (Bednář et al., 1996). Onemocnění u nich bývá zpravidla bezpříznakové, a tedy neléčené. Tento fakt může v konečném důsledku vést až ke kontaminaci masa při porážce zvířete. Primárně kontaminované může být rovněž mléko a syrová zelenina, která se hnojí fekáliemi infikovaných zvířat (Blažková et al., 2005). Listerie jako podmíněně patogenní mikrobi také mohou přechodně osidlovat sliznice svých hostitelů (lidí i zvířat), především v zažívacím traktu. Ten je i hlavní branou vstupu infekce u dospělých osob (Bednář et al., 1996) Druhy kontaminovaných potravin Některé polotovary představují pro vnímavé konzumenty vysoké riziko onemocnění listeriemi. Tyto potraviny jsou obvykle uchovávány chlazením a představují tak příhodné prostředí pro množení tohoto mikroba během výroby, přepravy a jejich skla- 34

35 dování. Do této kategorie potravin náleží nepasterizované mléko a produkty z něj vyrobené, měkké sýry, drůbeží výrobky, plody moře a uzeniny (Doyle et al., 2001). Nařízení Komise (ES) 2073/2005 o mikrobiologických kritériích pro potraviny jasně definuje kategorii potravin nepodporující růst L. monocytogenes, která musí splnit alespoň jedno z následujících kritérií: výrobky s dobou údržnosti pod 5 dnů, ph 4,4 aw 0,92, ph 5,0 a zároveň aw 0,94. Všechny ostatní výrobky je nutné považovat za růst podporující tohoto mikroba (OKLC, 2007). Doyle et al. (2005) uvádějí, že velmi dobrým zdrojem Listeria monocytogenes je syrové mléko. Prováděné studie na inaktivaci tohoto mikroorganismu v mléce pomocí teploty však měly rozporné výsledky. Některé výzkumy prokázaly, že buňky Listeria monocytogenes byly vysokou teplotou za krátký čas (71 C/15 s) efektivně zničeny, jiné zas odporovaly tím, že tato bakterie nebyla zcela inaktivována. Ukázalo se, že L. monocytogenes začíná v pasterizovaném mléce růst při 4 C za 7 dní, a že roste rychleji v pasterizovaném mléce, než v syrovém mléce uchovávaném při 7 C. Takže mléko, které je kontaminováno po pasterizaci a skladováno v chladničce, může vykazovat po 1 týdnu vysoký počet těchto mikroorganismů. Co se týká syrového masa, podle Görnera a Valíka (2004) jsou častým zdrojem listerií především mleté maso a drůbež, kdežto fermentované masné produkty jako syrové klobásy a lákované produkty jsou jejich nositeli zřídka. Listerie jsou vylučovány stolicí. Po porážce zvířat může docházet ke kontaktu fekálií s poraženým tělem, jakož i s vlastním masem. Z hlediska rizika pro konzumenta není toto nebezpečí významné, neboť se jedná pouze o malé množství listerií, méně než 10 2 KTJ.g -1 ). Maso se rovněž konzumuje zpravidla po tepelné úpravě, takže případné listerie jsou zničeny. Navíc bývají obvykle devitalizovány již při zrání masa a při fermentaci uzenin už se kvůli nízkým hodnotám ph dále nerozmnožují. Přítomnost listerií v tepelně upravených masných produktech tedy může být způsobena jejich sekundární kontaminací (krájené uzeniny) anebo nedostatečným záhřevem. V těchto produktech není v důsledku tepelné úpravy přítomna konkurenční mik- 35

36 roflóra a listerie se tak mohou nerušeně rozmnožovat. Eliminace takovýchto možností se dosahuje bezchybným dodržováním správné výrobní praxe (Görner, Valík, 2004) Onemocnění a prevence Vlastní rozvoj klinicky manifestního onemocnění probíhá ve dvou na sebe navazujících fázích. V první fázi dochází k průniku listerií do buněk hostitele, kde se množí. Ve druhé fázi, po předchozí bakteriemii, jsou postiženy cílové orgány, především centrální nervový systém a placenta. Nejčastější vstupní branou infekce je sliznice zažívacího traktu, ale může to být i spojivka, respirační nebo urogenitální trakt, u profesních onemocnění veterinářů, řezníků apod. pak porušená kůže. Není-li množství infikujících zárodků velké, rozvíjí se onemocnění jen u osob se sníženou rezistencí (např. nádorové onemocnění, diabetes), nebo s fyziologickou zátěží (těhotné ženy) (Bednář et al., 1996). Jako první se obvykle objevují příznaky onemocnění trávícího traktu, jako je nevolnost, zvracení a průjmy. To je doprovázeno horečkou. Krví se pak listerie mohou šířit do různých orgánů a mohou tak vyvolat zánět srdce, hnisavý zánět jater nebo zánět mozkových blan (meningitidu). Listerie u těhotných žen napadají placentu a následně i tkáně plodu, důsledkem čehož je pak obvykle potrat. Podle Staňkové et al. (2008) brání alimentární nákaze důkladná tepelná úprava masitých i zeleninových jídel a oddělené ukládání zeleniny, syrového masa, polotovarů a hotových jídel v chladničce. Těhotné ženy a imunosupresivní jedinci by měli jíst jen dobře provařenou stravu a řádně pasterizované mléčné výrobky. Léčba se provádí pomocí antibiotik, např. ampicilinem. U alergie na penicilinové přípravky lze užít makrolidy, doxycyklin a léčba má trvat nejméně 14 dní. 3.7 Metody boje proti nežádoucím mikroorganismům Správné dodržování hygieny a výrobní praxe Mléko Zdroje kontaminace syrového mléka jsou voda, půda, prach, rostliny, krmivo, a výkaly zvířat, ale rovněž dojicí zařízení. Především mléčné potrubí, ventily a gumové nástavce představují největší riziko. Výplachy z mléčného potrubí mohou obsahovat až 36

37 10 5. ml -1 mikroorganismů. Vysoké počty mohou obsahovat také výtěry z ventilů a výpustných kohoutů. Mléko získané za dobrých hygienických podmínek by nemělo obsahovat více než ml -1 psychrotrofních mikroorganismů. Počet kolonií nad ml -1 signalizuje nevyhovující podmínky získávání mléka. Skladovací teplota mléka má rozhodující vliv na růst mikroorganismů. Pro zajištění dobré kvality mléka je potřeba jej po nadojení co nejrychleji zchladit a uchovávat při teplotě nižší než 5 C. Pomalé zchlazování čerstvě nadojeného mléka zvyšuje pravděpodobnost pomnožení nežádoucí mikroflóry. Již teplota 63 C po 10 sekund je dostačující k devitalizaci gramnegativních bakterií, což zajišťuje pasterizace. Je-li zabráněno rekontaminaci, může být mléko bezpečně skladováno při 6 C až 8 C. K zamezení ekonomických ztrát, které vznikají činností mikrobiálních proteáz a lipáz v mléce a mléčných výrobcích je tedy třeba: - zabránit pomnožení psychrotrofních mikroorganismů v syrovém mléce rychlým a účinným zchlazením nadojeného mléka - provádět účinné čištění a dezinfekci zařízení - zabránit rekontaminaci pasterizovaného mléka (Görner, Valík, 2004) Maso Jak uvádějí Görner a Valík (2005), preventivním opatřením ve snaze co nejvíce prodloužit trvanlivost masa je co nejúčinněji zabránit jeho primární mikrobiální kontaminaci a vhodným uchováváním zabránit jeho sekundární kontaminaci. Maso po porážce se má v jádře co nejdříve ochladit na teplotu minimálně 7 C. Při intenzivním chlazení se tato teplota u vepřových kusů dosahuje za 10 až 16 hodin a u hovězích půlek za 15 až 24 hodin. Navazující uchovávání má být při 1 C, nanejvýš při +2 C. Vedlejší jatečné produkty se vychlazují na minimálně 3 C. Samozřejmou součástí správné výrobní praxe je již v dnešní době také zavedení systému HACCP (Hazard Analysis and Critical Control Points), což je analytická metoda navržená pro zjištění nejrizikovějších míst v procesu zpracování daného produktu, tedy i masa. Jedná se o procesy výroby, v nichž je eventuální chemická či mikrobiologická kontaminace nejpravděpodobnější. Po jejich zjištění jsou navrženy kroky, jak v nejcitlivějších článcích zpracovatelského řetězce možnost hrozící nákazy omezit. V 37

38 těchto kritických bodech je pak pravidelně prováděna fyzická, chemická a mikrobiologická kontrola ( Rady pro správné uchovávání potravin v chladničce Nepřerušujte chladicí řetězec, tzn., nakupujte chlazené a mrazené potraviny až na závěr nákupu. Poté je doma ihned vložte do chladničky/mrazničky (Ostrý, 2004). Udržujte chladničku v čistotě a pravidelně ji odmrazujte. Vnitřní část chladničky pravidelně vymývejte teplou vodou se saponátem a jednou za čas i s dezinfekčním prostředkem. Odborníci doporučují chladničku, i když máme samoodmrazovací přístroj, umýt jednou za měsíc zevnitř buď roztokem Sava, nebo vodou s octem ( Vždy setřete potřísněné povrchy dříve, než ztuhnou ( Pokud i po vyčištění lednice bojujeme se zápachem, doporučuje se dát dovnitř několik plátků citronu nebo misku či skleničku s octem nebo jedlou sodou. Plátky citronu pohltí pach lednice ( Nikdy nepřeplňujte lednici, neboť pak nelze udržet doporučenou bezpečnou teplotu. Pomocí kuchyňského teploměru zkontrolujte, že teplota v nejchladnější část lednice je v rozmezí 0 C až 4 C. V mrazáku má být teplota 18 C. Chlazené potraviny vraťte do lednice ihned po použití (např. mléko, máslo, majonézu atd.). Vyhoďte všechny nespotřebované zbytky pokrmů či výrobků, které jsou v lednici déle než dva, nejvýše tři dny. Nenechávejte u chladničky zbytečně dlouho otevřené dveře. Do lednice nepatří horké potraviny. Tepelně upravené potraviny před uzavřením do dóz a nádob a uložením do lednice nejprve rychle zchlaďte. Vejce uchovávejte v lednici a vždy si umyjte ruce po manipulaci s nimi. Snížíte tak riziko onemocnění salmonelou. 38

39 Neskladujte potraviny v otevřených konzervách. Potraviny nebo výrobky přesuňte do nekovových obalů, uzavřete a spotřebujte do 2 dnů. Potraviny do lednice neukládejte těsně vedle sebe, bráníte tak lepší cirkulaci chladného vzduchu v lednici. Uchovávejte čerstvé maso odděleně od tepelně upravených potravin, např. vařeného masa, šunky nebo potravin určených k přímé spotřebě bez tepelné úpravy. Omezíte tak riziko křížové kontaminace ( popsané v kapitole Mléčné výrobky snadno nasáknou vůně a pachy, proto je uchovávejte oddělené. Zmrazené mleté maso zkonzumujte do dvou dnů, pečené do šesti dnů, kotlety a steaky do tří dnů (Šumanská, 2009) Tipy pro správné zmrazování Nikdy nepoužívejte mrazničku k ochlazení horkého jídla. Zvyšuje se tím teplota ostatních, v ní uskladněných potravin. Před zamrazením nechte všechny potraviny vychladnout. Zamrazujte potraviny v nejlepším stavu, ne až když končí jejich trvanlivost, zachováte tak jejich chuť. Před zamrazením znovu zabalte maso, zakoupené v obchodě. Obal zaměňte za nový igelitový sáček, který k masu těsně přilne. Balte maso a ryby v porcích tak, abyste rozmrazovali vždy ideální množství určené k jídlu. Před zamrazením zeleninu oloupejte nebo poduste a rychle zchlaďte ve studené vodě. Tím zničíte enzymy, které by poškodily chuť, živiny a strukturu zeleniny. Potraviny mohou být v mrazničce ponechány od 3 do 12 měsíců. Skladovací lhůty se liší podle druhu potravin a možností mrazničky. Potraviny obsahující tuk jsou na skladování citlivější než jiné. 39

40 Ujistěte se, že mezi jednotlivými porcemi potravin může cirkulovat vzduch. Ploché balíčky se zmrazí rychleji než ty objemnější (Šumanská, 2009) Tipy pro bezpečné rozmrazování Nejbezpečnější je rozmrazování v mikrovlnné troubě, které je nejrychlejší, a tím se snižuje rozmnožování bakterií. Nikdy nerozmrazujte venku nebo na kuchyňském pultu, usnadňuje se tak rozmnožení škodlivých bakterií. Potraviny určené k rozmrazování položte do spodní části lednice na tácky nebo do misek, aby se zabránilo vytékání vody nebo šťáv z masa a případné kontaminaci jiných potravin uložených v chladničce. Nikdy znovu nezmrazujte již rozmrazené potraviny. Rozmrazování ve studené vodě je rychlejší než rozmrazování v lednici, ale je zapotřebí větší opatrnosti. Jídlo musí být v nepropustném obalu, jinak by se do něj mohly dostat bakterie ze vzduchu nebo okolního prostředí. Při rozmrazování měňte vodu každých 30 minut. Nikdy zmrazené jídlo nerozmrazujte v horké vodě (Šumanská, 2009) Zabránění křížové kontaminaci Křížovou kontaminaci lze definovat jako přenos mikroorganismů z míst jejich přirozeného výskytu, např. ze syrového masa, zeleniny, vajec, na ostatní potraviny či pokrmy, které dále slouží bez tepelné úpravy k výživě člověka (Ostrý, 2003). Člověk může být působení patogenních, choroboplodných bakterií vystaven třemi způsoby: 1. požitím přímo nakažených produktů, 2. kontaktem s jiným nakaženým člověkem, 3. požitím potravin, které se dostaly do styku s kontaminovaným zařízením kuchyně (pracovní plochy, nádobí), nebo s kontaminovanou potravinou ( 40

41 Křížové kontaminaci lze zabránit, a to dodržováním základních pravidel, např.: syrové maso, vejce a zeleninu při nákupu řádně zabalte, nebo uložte odděleně od ostatních potravin, při vaření a úpravě potravin používejte odlišné nože a nářadí na syrové potraviny a na již hotové či dále neupravované potraviny a pokrmy, kuchyňské nářadí vždy po kontaktu se syrovými potravinami důkladně umyjte v horké vodě se saponátem a následně opláchněte vodou, ruce si myjte co nejčastěji, vždy po manipulaci se syrovým masem, zeleninou a vejci, omyté potraviny, např. ovoce, umístěte do čistého sáčku, nedávejte je zpět do původního obalu (Ostrý, 2003). Při jakékoli pochybnosti je vždy nejlepší potraviny či jídlo jednoduše vyhodit, nežli riskovat onemocnění, v horším případě otravu. Samozřejmostí by mělo být vyhození všech rizikových, snadno se kazících potravin, které se nacházely mimo chladničku při teplotě nad 25 C déle než 4 hodiny. Nepomůže, když je po této době dáme znovu do lednice. Obr. 3 Chladnička ( 41