Listeria monocytogenes. Jarmila Pazlarová Ústav biochemie a mikrobiologie FPBT, VŠCHT

Transkript

1 Listeria monocytogenes Jarmila Pazlarová Ústav biochemie a mikrobiologie FPBT, VŠCHT

2 Nařízení Komise (ES) č. 2073/2005 ze dne o mikrobiologických kriteriích pro potraviny Platnost od Salmonella sp. Listeria monocytogenes Enterobacter sakazakii Escherichia coli indikátor fekálního znečistění Koagulázopozitivní stafylokoky Enterobacteriacae

3 Kriteria bezpečnosti potravin Potraviny určené k přímé spotřebě pro kojence a potraviny určené k přímé spotřebě pro zvláštní léčebné účely Nepřítomnost v 25 g EN/ISO Potraviny určené k přímé spotřebě, které podporují růst L.monocytogenes, jiné než pro kojence a pro zvláštní léčebné účely 100 KTJ/g EN/ISO produkty uvedené na trh během doby údržnosti

4 Kriteria bezpečnosti potravin Potraviny určené k přímé spotřebě, které nepodporují růst L.monocytogenes, jiné než pro kojence a pro zvláštní léčebné účely 100 KTJ/g EN/ISO

5 Historický úvod Murray v roce 1926: Bacterium monocytogenes krevní monocyty králíků Patogen lidí a zvířat Pirie v roce 1940: Listeria monocytogenes Joseph Lister Od roku 1980 foodborn pathogen

6 Potraviny určené k přímé spotřebě, které nepodporují růst L.monocytogenes výrobky s ph < 4,4 nebo aw < 0,92 výrobky s ph < 5,0 a aw < 0,94 výrobky s dobou údržnosti pod 5 dní je-li to vědecky opodstatněné, i jiné výrobky

7 Rod Listeria se člení do 6 druhů: L. monocytogenes, L. innocua, L. seeligeri, L. welshimeri, L. ivanovii, a L. grayi. L. grayi a L. ivanovii mají dva poddruhy,které se obtížně rozlišují. Současné taxonomické studie tohoto rodu jako patogeny uvádějí L. ivanovii a L. monocytogenes (myši, ovce a další zvířata). Pouze L. monocytogenes je původce humánních listerios. Listeriosy vyvolané infekcí L. ivanovii a nebo L. seeligeri, jsou u lidí vyjímečné.

8 Listeria monocytogenes Scanning EM showing Flagella

9 Základní údaje - výskyt Gram-pozitivní bakterie, pohyblivá pomocí bičíku. Některé studie udávají, že 1-10% lidí může být přenašečemi L. monocytogenes ve střevním traktu. Celkem bylo nalezeno 37 kmenů u savců, jak u domácích, tak u divokých. U ptáků bylo nalezeno 17 druhů a pravděpodobně jsou druhy přenášené rybami a měkýši. Byla izolovaná z půdy, siláže a dalších přírodních zdrojů. L. monocytogenes je značně odolná, přežívá zhoubné účinky mrazu, vysušení a horka velice dobře na to, že se nejedná o sporotvorný druh. Většina kmenů L. monocytogenes je patogenní.

10 Gramovo barvení

11 morfologie

12 Asociace s potravinami L. monocytogenes bývá spojovaná s potravinami jako je syrové mléko, špatně pasterizované mléko, sýry (typy zrajících měkkých sýrů), zmrzlina, syrová zelenina, fermentované klobásy ze syrového masa, syrová a vařená drůbež, syrové maso (všech typů), a syrové a uzené ryby. Schopnost růstu při teplotách kolem 3 C umožňuje množení v chlazených potravinách.

13 Odolnost listerií Listerie jsou bakterie s širokým rozmezím teplot, při kterých si zachovávají plně vitální funkce od 0 do 50 C Při teplotě 20 C se v potravinách množí od aw 0,93 0,95 Toleruje hodnoty ph v rozsahu 4,3 9,6 Přežívá v potravinách s koncentrací soli 10 % Bakterie mléčného kvašení a bakteriociny inhibují růst listerií

14 Infekční dávka Infekční dávka L. monocytogenes není přesně určena. Zřejmě se mění v závislosti na kmenu a citlivosti nemocného. Z případů vyvolaných syrovým nebo špatně pasterizovaným mlékem bylo odvozeno, že bezpečná dávka u citlivých osob je méně než 1,000 bakterií. L. monocytogenes může pronikat gastrointestinálním epithelem. Jakmile bakterie vstoupí do monocytů, makrofágů, nebo polymorfonukleárních leukocytů, hostitele nastává její růst a následná septikémie. Její intracelulární přítomnost v fagocytujících buňkách jí dovoluje přístup do mozku a transplacentální migraci do plodu u těhotných žen. Pathogenese L. monocytogenes spočívá v její schopnosti přežívat a množit se ve fagocytárních buňkách hostitele.

15 Bakteriální virulence Virulence porovnatelný stupeň patogenity A. LD50 míra virulence, počet mikroorganismů nezbytných k usmrcení 50% pokusných zvířat nebo buněk v kultuře. B. ID50 - míra virulence, počet mikroorganismů nezbytných k vyvolání infekce u 50% pokusných zvířat nebo buněk v kultuře. C. LD50 bakterie A u králíka je 1000 organismů, zatímco pro bakterii B 5000 organismů. Která bakterie je více virulentní?

16 Patogeneze protein gen poznámka PrfA prfa plca hlya acta inla regulační protein operonu PIPLC LLO ActA IntA fosfolipáza hemolyzin aktin internalin

17 Metody detekce Standardní normovaná metoda: (ČSN ISO a ČSN ISO ) - selektivní pomnožení (25g) v polovičním Fraserově bujonu, 225m, 30 C, 24 h - sekundární pomnožení ve Fraseru s plným obsahem inhibičních složek 37 C, 48 h - identifikace na dvou pevných selektivních médiích, inkubace 37 C, 48 h -výběr 5 charakteristických kolonií a vyočkování na chromogenní medium typu ALOA a TSAYE (Trypticase soja agar, extract yeast) inkubace 37 C,24 h - další konfirmační testy : Gramovo barvení,camp test, API Listeria test,

18 Průkaz LM

19 Půda ALOA

20 Stanovení počtu LM

21 Christie-Atkins-Munch-Peterson (CAMP) test Provedení testu: kultury α-hemolytického Staphylococcus aureus a Rhodococcus equi se načárkují paralelně na misku s krevním agarem. Testované kultury pak se nanášejí v pravém úhlu ke kulturám S. aureus a R. Equi. Po inkubaci při 35 C po h, se na miskách hledá hemolýza. Hemolytická reakce L. monocytogenes a L. seeligeri je zesílená v zonách ovlivněných nárůstem S. aureus. Ostatni druhy zůstávají nehemolytické. Reakce L. monocytogenes je častěji optimální za 24 h než po 48 h. Je doporučeno použít kontrolní kmeny Listeria spp. na dalším agaru s ovčí krví. Misky s krevním agarem (beraní erythrocyty) by měly být co nejčerstvější.

22 Provedení CAMP testu CAMP test. Na krevní agar s propranými ovčími erytrocyty samostatnou čarou naočkujte testovací kultury S. aureus a R. equi, a to navzájem rovnoběžně v opačných polovinách misky. Je zapotřebí inokulovat tenkou čarou a rovnoměrně pomocí kličky vedené kolmo k misce. Testované kmeny naočkujte podobně, každý samostatnou čarou a navzájem rovnoběžně, ve směru kolmém na očkovací čáry testovacích kultur tak, že se čar očkovaných testovacími kulturami nedotýkají, ale jsou od nich vzdálené asi 1-2 mm. Na jednu misku lze očkovat několik testovaných kmenů (nejčastěji 3 testované kmeny na jednu misku krevního agaru). Současně naočkujte kontrolní kultury L. monocytogenes, L. innocua a L. ivanovii. Takto naočkované misky krevního agaru inkubujte v termostatu s teplotou udržovanou na 37 C po dobu hodin.

23 CAMP test

24

25

26 MALDI TOF - RESULTS 174 = 170

27 MALDI TOF - RESULTS

28 Trojúhelník onemocnění: kompatibilní interakce mezi patogenem a hostitelem končí nemocí při vhodných vnějších podmínkách. Nejsou-li všechny podmínky splněny, nemoc nepropukne.

29 Oportunní patogen Cílové populační skupiny pro listeriosu jsou: Těhotné ženy/plod - perinatální a neonatální infekce; Imunokompromisní pacienti po ošetření kortikosteroidy, protirakovinými léky, pacienti po transplantacích orgánů,nemocní AIDS; Pacienti s rakovinou zvláště s leukémií; Méně často také - diabetici, astmatici, lidé s cirrhosou a ulcerativní kolitidou; Senioři; Zdraví lidé - podle některých zpráv i normální, zdraví lidé mohou být nakaženi. Při epidemii ve Švýcarsku, kdy vehikulem byl sýr ze syrového mléka onemocněli jinak zdraví lidé, jednalo se vysoké koncentrace L.monocytogenes.

30 onemocnění Listeriosa je označení pro skupinu zdravotních poruch a potíží vyvolaných L. monocytogenes. Povaha onemocnění:listeriosa je klinicky definovaná v případě, že organismus je izolován z krve, cerebrospinálního moku nebo z jiných za normálních podmínek sterilních míst (např. placenta, fetus).

31 Infekční cyklus 1 Primární místo infekce je střevní epitel, kde bakterie napadá nefagocytující buňky pomocí mechanismu zipování. Vstup je stimulován vazbou listeriového internalinu (Inl) do hostitelské buňky adhezními faktory jako Ecadherin nebo Met. Tato vazba aktivuje některé Rho-GTPasy, které následně váže a stabilizuje Wiskott Aldrich Syndrome Protein (WASp). WASp tak může vázat komplex Arp2/3 a slouží jako bod nukleace aktinu. Následná polymerace aktinu rozpíná buněčnou membránu kolem bakterie, která je pohlcena. Hlavním účinkem vazby internalinu je využití připojovacího mechanismu hostitele k internalizaci bakterie.

32 Infekční cyklus 2 L. monocytogenes může také napadat fagocytující buňky (např. makrofágy) ale k invazi do nefagocytujících buněk stačí internaliny. Po internalizaci musí bakterie opět uniknout z vakuoly/fagosomu dříve než dojde k fúzi s lysosomem. Dva hlavní faktory virulence, které únik umožňují jsou listeriolysin O (LLO kódovaný hly) a fosfolipasa-c B (plcb). Sekrece LLO a PlcB rozruší membránu vakuoly a dovolí bakterii proniknout do cytoplasmy, kde se může množit.

33 Průnik L. monocytogenes do hostitelské buňky Za adhezi L. monocytogenes k hostitelské buňce jsou zodpovědné povrchové proteiny Ami, bakteriální adhezin, který se váže na fibronektin sliznic a povrchový protein p104, internalin A a internalin B slouží k průniku do buňky indukcí fagocytózy, fosfolipázy, fosfatidylinositol-specifická fosfolipáza C a fosfatidylcholin-specifická fosfolipáza C, společně listeriolysin O, který tvoří póry v buněčné membráně vazbou na cholesterol v ní obsažený, naruší stěnu lysozomu a umožní buňce dostat se do cytoplasmy, kde se množí. Listeriolysin a fosfolipázy jsou zároveň cytolytickými toxiny, hemolyziny. Baktérie produkuje také Zn2+dependentní proteázu, která působí jako exotoxin, povrchový protein LMaA je zřejmě zodpovědný za indukci pozdní hypersenzitivity a povrchový komplex Ei, izolovaný z buněčné stěny, je strukturou i účinky pozoruhodně podobný endotoxinům gramnegativních bakterií - L. monocytogenes je jediná grampozitivní bakterie, která je tvoří.

34 Virulence internalin Listeriolysin, lecitinasa Aktinová vlákna Faktory virulence jsou umístěny v lecithinasovém operonu a jejich transkripce ke regulována transkripčním aktivátorem PrfA.

35 Internalizace listerií savčí buňkou

36

37 Infekční cyklus 3 Po průniku do cytoplasmy L. monocytogenes použije aktin hostitele podruhé. ActA proteiny spojené se starým buněčným pólem bakterie (jako bacillus, L. monocytogenes tvoří septum ve středu buňky, a tak má vždy jeden nový pól a jeden starý ) jsou schopné vazby komplexu Arp2/3 a tak indukují nukleaci aktinu ve specifické oblasti povrchu bakterie. Polymerace aktinu pohání bakterii cíleně k membráně hostitele. Takto vzniklý výčnělek může pak být internalizován sousední buňkou, za tvorby vakuoly s dvojitou membranou, ze které bakterie unikne použitím LLO a PlcB.

38 Listeria monocytogenes L. monocytogenes tvoří biofilmy na nejrůznějších typech povrchů. Některé kmeny obsahují luxs gen, který je odpovědný za tvorbu biofilmu. luxs kóduje S-ribosylhomocysteinasu, která katalyzuje hydrolýzu Sribosylhomocysteinu na homocystein a 4,5-dihydroxy-2,3-pentadion (DPD), která je prekursorem autoinduktoru 2 (AI-2). AI-2 byl nalezen jako jeden z autoinduktorů regulujících bioluminiscenci u V.harveyi a dále byla AI-2 podobná aktivita detekována v supernatantu mnoha bakterií (G+ i G-). Orthology luxs byly identifikovány rovněž u mnoha bakterií(g+ i G-). AI-2 je universální jazyk pro mezidruhovou komunikaci

39 Schéma tvorby biofilmu

40

41 Provedení experimentu Studium tvorby biofilmu Listeria monocytogenes : kultura rostla ná BHI 37 oc, 24h OD600 nm 1,0, 100x naředěny čerstvým BHI, 0,5 ml aplikováno na 24 jamkovou polystyrenovou destičku. Kultivace 1-2 dny 37 oc staticky. Jamky 3x promyty 0,5 ml redest. vodou. Kvantitativní vyhodnocení: 0,1% krystal. violeť. Destička se 1h suší - 65 oc. Vyhodnocení: plate reader BioTec. Množství biofilmu průměr adsobance (OD595) extrahované violeti ze dvou nezávislých pokusů, každý po 3 paralelách.

42 Listeria monocytogenes - biofilm

43 Lineární mapa genomické DNA obklopující luxs L.monocytogenes Známé a předpověděné ORF a jejich orientace. ORF lmo1285 a lmo 1285 kódují hypotetické proteiny podobné B.subtilis YneS a YneT. Lmo1291protein podobný B.subtilis acyltransferase (Yrhl protein.)

44 Mikroskopické analýzy prokázaly, že biofilm pokrývá lépe a více plochy z PVC, než z nerezové oceli. Na PVC vzniká biofilm již po 2 h kontaktu. Interakce mezi bakteriálními buňkami a anorganickým nosičem jsou závislé na hydrofobitě nebo hydrofilitě sledovaného povrchu. I když metod ke studiu je celá řada, použití mikrotitračních destiček je velmi výhodné a reprodukovatelně porovnatelné.

45 Kmen vysoká tvorba biofilmu na nerezové plošce - A, na PVC - C. Kmen nízká tvorba biofilmu na nerezové plošce - B, na PVC - D Úsečka 8,6 μm

46 Tvorba biofilmu u L.monocytogenes 0,08 0,07 0,06 A620 0,05 0,04 25 C 0,03 37 C 0,02 0,01 0 Lm52 Lm53 Lm54 Lm55 Lm 56 Lm57 Lm 58 Lm59 Lm 60 Lm169 Lm 170 Lm171

47 log CFU Adherence to abiotic surfaces 5 4 Ent. faecalis. 3 E. coli St. aureus L.innocua Glas Glass Gummi rubber Cleaning Nirosta stainless steel Glas Glass Gummi rubber Nirosta stainless steel Cleaning+acidic desinfection

48 Rybí výrobky Mléčné výrobky Zelenina ostatní Masné výrobky Cukrářské výrobky Lahůdkové saláty Zelenina mražená procento pozitivních Výsledky studie MIKROMON

49

50 Pulsní gelová elektroforéza -PFGE PFGE je elektroforetická metoda použitelná i k separaci dlouhých úseků DNA při separaci se používá změny elektrického proudu během elektroforézy. K provedení je nutná speciální aparatura, která je schopná střídat elektrické pole mezi dvěma páry elektrod orientovaných pravoúhle, případně třemi páry elektrod sestavených do šestiúhelníku. Separace probíhá převážně na základě rozdílné velikosti molekul. Kratší molekuly putují gelem výrazně rychleji než molekuly velké.

51 Moderní metody identifikace Pulzní gelová elektroforéza (PFGE)

52 Jaký typ vyvolal epidemii? Pulsotypy ze všech izolátů dodaných do Národní referenční laboratoře v Brně byly jednoho typu.

53 Comparison of serovar 4b distribution among large and small cheese making facilities % small-scale Statistically significant, p<0.05, Kolmogoroff Smirnoff, T-test large-scale

54 Nálezy L. monocytogenes v potravinách v členských zemích EU (EFSA) Potravina Pozitivní vzorky Pozitivní vzorky Výrobky z hovězího masa % % Výrobky z vepřového masa 0-28 % 0-6 % Výrobky z drůbežího masa 0-40 % 0-32 % Výrobky z dalších druhů masa 0-29 % 0-22 % Sýry 0-13 % 0-5 % Syrové mléko % 0.03 % Další mléčné výrobky % % % 0-33 % % Rybí výrobky Ovoce a zelenina

55 Rizikové skupiny sýrů Sýry s plísní uvnitř hmoty (Niva, Gorgonzola, Roquefort): ph 4.9, NaCl 4 % Sýry s plísní na povrchu typ Camembert: ph , NaCl 3.5% Sýry zrající pod mazem (Romadur, Ol. tvarůžky): ph , NaCl do 5%

56 Děkuji za pozornost