Určení místa kontaminace sporotvorných bakterií rodu Bacillus při jejich průniku technologií do finálních výrobků metodou ARDRA-PCR

Uplatněná metodika QF 4004 UM 2 - název: Určení místa kontaminace sporotvorných bakterií rodu Bacillus při jejich průniku technologií do finálních výrobků metodou ARDRA-PCR Uplatněná metodika a postup pro identifikaci a určení původu místa kontaminace finálních mléčných výrobků sporotvornými mikroorganismy rodu Bacillus pomocí molekulární metody ARDRA-PCR Cíl uplatněné metodiky: Cílem metodiky je identifikace sporotovorných mikroorganismů rodu Bacillus v mléčných výrobcích a určení místa původu kontaminace od příjmu vzorků po finální produkt zvolenou molekulární metodou ARDRA-PCR. Náplň uplatněné metodiky: Implementace dosažených výsledků, získaných na základě předchozího výzkumu a vývoje v rámci řešení projektu NAZV, MZe-ČR, QF 4004 a v rámci koordinační a konzultační metodické činnosti mikrobiologické a molekulární laboratoře a Národní referenční laboratoře pro syrové mléko (NRL-SM) Rapotín, do prostředí zpracovatelů mléka. Zdroj uplatněné metodiky: Projekt NAZV, MZe-ČR, QF 4004, Vývoj metody pro určení původu kontaminace finálních mléčných výrobků potravními patogeny. Zpracovala dne: 1.3.2007 Marcela Vyletělová, Juraj Banykó, Ludmila Nejeschlebová Výzkumný ústav pro chov skotu, s.r.o. Akreditovaná Zkušební laboratoř č. 1340 Národní referenční laboratoř pro syrové mléko (NRL-SM) Referenční laboratoř pracovní sítě referenčních mléčných laboratoří ICAR-CECALAIT Uplatnění bylo provedeno zavedením všech principů metodiky od 1.5. 2007

Určení místa kontaminace sporotvorných bakterií rodu Bacillus při jejich průniku technologií do finálních výrobků metodou ARDRA-PCR Význam sporotvorných mikroorganismů při výrobě mléčných výrobků Součástí celkové mikroflóry mléka jsou sporotvorné mikroorganismy, které jsou však těžko detekovatelné za použití kultivačních metod pro stanovení hlavního hygienického ukazatele CPM (celkový počet mikroorganismů). Mezi sledované skupiny těchto mikroorganismů řadíme rod Bacillus a Clostridium. Jejich společnou vlastností je, že mohou přežívat nepříznivé podmínky pro jejich růst i několik let v podobě spór, které jsou velmi odolné vůči extrémním teplotám. Bakterie rodu Bacillus jsou gram-pozitivní bičíkaté tyčky, tvořící endospóry a rostoucí za aerobních až fakultativně anaerobních podmínek. Většina z nich roste při teplotě kolem 30 až 37 o C (B. cereus, Bacillus licheniformis, Bacillus sporothermodurans, B. subtilis, B pumilus, B. luteus, B. lentus, B. fusiformis, B. badius, B. sphaericus, Paenobacillus pabuli, P. glukanolyticus a další), ale jsou tu i zástupci termotolerantních 45 až 55 C (B. stearothermophilus, B. licheniformis, B. badius a další) a psychrotrofních organismů 4 až 6,5 o C (Bacillus weihenstephanensis). V současné době je zaměřen zájem na výskyt bakterií rodu Bacillus, konkrétněji Bacillus cereus. Při jeho značném pomnožení (10 7 CFU/ml) může docházet ke zdravotním potížím. Objeví se příznaky průjmu a zvracení. Avšak vzhledem k tomu, že se taxonomie bakterií vyvíjí a doplňuje nejen po objevení zcela nového druhu, ale rovněž při rozlišení některých vlastností již druhu známého nebo při objevení jejich zcela nových vlastností, rozšiřuje se okruh zájmů i na tyto druhy. Bacillus weihenstephanensis byl dříve označován společně jako B. cereus. Od mateřského kmene jej oddělila schopnost růstu při nižší teplotě 4-6,5 o C a v roce 1998 byl tento kmen zařazen do samostatného druhu (Lechner a kol., 1998). Poprvé v ČR byly dva kmeny izolovány i v naší laboratoři a jsou uloženy v depozitáři České sbírky mikroorganismů v Brně pod čísly B. weihenstephanensis CCM 4965 a B. weihenstephanensis CCM 4966 (Páčová a kol., 2003). U kmene Bacillus licheniformis je známa jeho schopnost tvořit diarrhoealní toxin nebo rovněž přežít nejen vysoké pasterační, ale i UHT teploty, je rovněž spojován s otravami potravin (Salkinoja-Salonen a kol., 1999). Bacily jsou většinou schopné tvorby proteolytických a lipolytických termostabilních enzymů, které opět mohou při vysoké koncentraci znehodnotit mléko jako surovinu nebo meziprodukt. Z druhů, které se nám podařilo izolovat v syrovém kravském mléce, to jsou B. cereus, B. licheniformis, B. subtilis, 2

B. weihenstephanensis, B. pumilus, B. luteus, B. lentus, B. fusiformis, B. badius, B. sphaericus, Paenobacillus pabuli, P. glukanolyticus (Vyletělová a kol., 2001), ve finálních výrobcích pak B. cereus a B. licheniformis (Vyletělová a Hanuš, 2005). Sporotvorné mikroorganismy ve výrobním procesu a finálním výrobku Do finálního výrobku mohou pronikat bakterie již z prvovýroby nebo v průběhu technologického zpracování mléka. Důkaz o jejich výskytu lze zjistit až cíleným rozborem. V současné době existují nejpřesnější metody identifikace a typizace mikroorganismů na molekulární úrovni (tzv. fingerprinting = otisk prstu). Použitím těchto metod je možné zjistit průnik konkrétního mikroorganismu v potravinovém řetězci a přesně určit nejen jeho druh, ale i původ. Výsledky těchto metod mohou být velmi efektivně využity v jakémkoliv výrobním procesu, spojené s potravinami, popřípadě i v klinické mikrobiologii. Pro stanovení původu kontaminace byla odzkoušena metoda ribotypizace (Vyletělová a kol., 2002). Konečné zpracování výsledků (tzv. dendrogramy) ukazují na 85-93% shodu identity kmenů B. cereus a 70-100% shodu B. licheniformis jak v syrovém, tak v pasterovaném a UHT mléku, a tím můžeme odhadovat na původ kontaminace již z prvovýroby. Jako další byla pro určení původu požita metoda rep PCR (Vyletělová, 2006; Vyletělová a Banykó, 2006). V současnosti je v naší laboratoři pro určení identifikace a typizace izolovaných kmenů B. cereus a B. licheniformis běžně využívána metoda ARDRA- PCR (Banykó, 2006). Naše výsledky a literární údaje jednoznačně předurčují metodu ARDRA-PCR pro snadné rozlišování mezi nejběžnějšími druhy rodu Bacillus, které jsou významnými potravními patogeny. Odběr vzorků mléka Vzorek mléka je odebírán z různých míst technologie od syrového mléka až po finální výrobek. Může se odebírat i vzorek sýra v průběhu jeho zrání. Odběr vzorků je prováděn za kontroly majitele nebo majitelem uřčeným pracovníkem podniku. Transport vzorků do laboratoře je nutný za teploty 6.5 C ± 1 C. Při vyšších teplotách v letním období je odběr prováděn do vzorkovnic s konzervačním Heeschenovým činidlem v poměru 1 : 10 (Heeschen a kol., 1969). Vzorky byly po dopravě ihned analyzovány nebo uloženy při teplotě 6.5 C ± 1 C po dobu 24 hodin a poté vyšetřeny. Ve výjimečných případech je možné uložit vzorky při teplotě -30 C ± 1 C pod dobu nejdéle 1 měsíce. 3

Stanovení sledovaných druhů konvenční metodou Pro stanovení a konfirmaci B. cereus a B. licheniformis se vychází z normy ČSN ISO 7932 (2005), pro kultivaci je použit MYP Agar (HiMedia) jako základní kultivační médium. Kmeny rodu Bacillus jsou izolovány na MYP Agar doplněný Egg Yolk emulzí a Polymyxin B sulfátem (HiMedia) po devitalizaci vzorků při 85 o C ± 1 C /10 min. Vzorky mléka jsou inokulovány po 0,1 ml na Petriho misky s předsušenou diagnostickou půdou. Petriho misky se inkubují při 30 C ± 1 C 24 až 48 hodin. Podle morfologie růstu lze předběžně označit jako B. cereus růžové kolonie a jako B. licheniformis bezbarvé, vypouklé, slizovité kolonie. Všechny podezřelé kolonie jsou následně vyočkovány na krevní agar a kultivovány při 36 ± 1 C po dobu 24 hodin. Kmeny s charakteristickým růstem (bez hemolytické reakce, s vypouklým profilem a zvlněný tvar s nepravidelným okrajem) jsou označeny jako B. licheniformis, ve sporných případech zaslány pro konfirmaci na Českou sbírku mikroorganismů, Brno a identifikovány metodu ARDRA-PCR. Kmeny s jasnou hemolýzou předběžně označené jako B. cereus jsou dále konfirmovány na tvorbu acetylmetylkarbinolu, fermentaci glukózy a redukci dusičnanů (ČSN ISO 7932, 2005). V případě sporných výsledků jsou kmeny rovněž identifikovány metodu ARDRA-PCR, popřípadě zaslány pro potvrzení identifikace na Českou sbírku mikroorganismů, Brno. Molekulární metoda ARDRA-PCR Přesnější identifikace je následně provedena pomocí molekulární metody ARDRA- PCR. Technika ARDRA (Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis) amplifikovaná restrikční analýza ribosomální DNA je založené na polymerázové řetězové reakci, při níž jsou identifikovány specifické sekvence genů. Pomocí této techniky se určují bakteriální druhy na základě jejich konservované 16S rrna. Protože produkuje jednoznačné a nezaměnitelné vzorce restrikčních fragmentů, které v některých případech jsou použitelné i na rozlišování mezi kmeny, je hodnověrnou typizační metodou. Amplikony v případě analýzy druhů rodu Bacillus jsou natráveny restrikčními enzymy AluI a TaqI. Po jejich následné elektroforetické separaci můžeme vidět různé profily pásů obsahujících 2 až 5 fragmentů, dlouhých 76 až 804 bp. Příprava kolonií Izoláty kolonií Bacillus a referenčních kmenů B. cereus (CCM2010) a B. licheniformis (CCM2145) jsou kultivovány 48 hod v tekutém médiu (Bacto-Peptone; hovězí extrakt, Lab- Lemco; MnSO 4.H 2 O) při 36 C ± 1 C. Izolace DNA 4

Izoláty kolonií Bacillus a referenčních kmenů B. cereus (CCM2010) a B. licheniformis (CCM2145) jsou kultivovány 48 hod v tekutém médiu (Bacto-Peptone; hovězí extrakt, MnSO 4.H 2 O) při 37 C. Kultury referenčních kmenů pocházejí z České sbírky Mikroorganismů, Masarykova Universita, Brno. PCR amplifikace Používá se skupinově specifický pár primerů, které amplifikují gen pro 16S rrna mesofiliních, aerobních a sporulujících mikroorganismů rodu Bacillus (Wu et al., 2006). Výsledkem PCR amplifikace je cca 1 114 bp dlouhý amplikon. Pro amplifikaci s objemem reakční směsi 50 µl se používá termocykler s vyhřívaným víkem a PCR reakce probíhá při těchto parametrech: denaturace 5 min při 95 C; následuje 35 cyklů za podmínek 95 C, 1 min; 57 C, 1 min; 72 C, 2 min. Reakce jsou ukončeny extenzí při 72 C, 10 min. ARDRA-PCR Produkty PCR jsou nejdříve pročištěny fenol/chloroform/isoamylalkoholovou metodou, pak přeneseny do dvou 1,5 ml mikrozkumavek tak, aby každá zkumavka obsahovala po 5µl produktu a příslušný enzym na štěpení produktů. Směsi ve zkumavkách se inkubují 4-5 hod při teplotách předepsaných pro restrikční enzymy TaqI a AluI. Produkty štěpení jsou separovány na 1,5% agarosovém gelu při 80 V po dobu 4 hod v 0,5x TBE pufru. Fragmenty DNA v gelu se vizualizují v UV světlu a fotografují pomocí digitálního zachycovacího systému (DP-001.FDC, Vilber Lourmat). Odhad dloužky DNA fragmentů je proveden použitím 100 bp+ DNA žebříku. Hodnocení výsledků Prostřednictvím analýzy clustrů pomocí softwaru na analýzu gelů (např. Bio-Light od Vilber Lourmat) lze identifikovat kmeny Bacillus cereus a B. licheniformis a rovněž určit pomocí Jaccardova koeficientu similarity (UPGMA) fylogenetický vztah mezi vzorky sledovaných druhů mikroorganismů. Předání uplatněné metodiky Určení místa kontaminace sporotvorných bakterií rodu Bacillus při jejich průniku technologií do finálních výrobků metodou ARDRA-PCR 5

Vyvinutá uplatněná metodika byla předána do užívání v písemné formě ing. Petrovi Lakomému, výrobnímu řediteli společnosti Orrero, Tři Dvory, Litovel dne 20. 4. 2007. Přílohy, dokumenty a doklady: Technická řešení a postupy této uplatněné metodiky byly zčásti převzaty z vědecké a odborné literatury a zejména podpořeny výsledky vlastního výzkumu, které byly postupně publikovány a jako dokladové materiály mohou tvořit přílohu tohoto metodického materiálu. Datum: 20. 4. 2007 Za zhotovitele: RNDr. Marcela Vyletělová, Ph.D. Výzkumný ústav pro chov skotu, s.r.o. Za uživatele: Ing. Petr Lakomý Orrero a.s., Tři dvory, Litovel Přílohy a seznam použitých podkladů Normy a vyhlášky uvedené v sestavené metodice ČSN ISO 7932 (1995): Mikrobiologie. Všeobecné pokyny pro stanovení počtu Bacillus cereus. Technika počítání koloniíí vykultivovaných při 30 C. ČNI, Praha. Literatura HEESCHEN, W., REICHMUTH, J., TOLLE, A., ZIEDLER, H. (1969): Preservation of milk samples for bacteriologic and cytologic examinations and examinations for inhibitors. Milchwissenschaft, 24, 1969: 729-734. LECHNER, S., MAYR, R., FRANCI,S K.P., PRÜSS, M., KAPLAN, T., WIESSNER-GUNKEL, E., STEWARD, G.S.A.B., SCHERER, S. (1998): Bacillus weihenstephanensis spp. no. is a new psychrotolerant species of the Bacillus cereus group. Int. J. Syst. Bacteriol., 48: 1373-1382. PÁČOVÁ, Z., ŠVEC, P., STENTORE, L.P., VYLETĚLOVÁ, M., SEDLÁČEK, I. (2003): Isolation of the psychrotolerant species B. weihenstephanensis from raw cow s milk. Czech J. Animal. Sci., 48 (2): 93-96. SALKINOJA-SALONEN, M.S., VUORIO, R., ANDERSSON, M.A., KÄMPFER, P., ANDERSSON, M.C., HONKANEN-BUZALSKI, T., SCOGING, A.C. (1999): Toxigenic strains of Bacillus licheniformis related to food poisoning. Appl. Environ. Microbiol., 10: 4637-4645. 6

VYLETĚLOVÁ M., HANUŠ O., PÁČOVÁ Z., ROUBAL P., KOPUNECZ P. (2001): Frequency of Bacillus bacteria in raw cow s milk and its relation to other hygienic parameters. Czech J. Animal Sci.: 46 (6): 260-267. VYLETĚLOVÁ M., ŠVEC P., PÁČOVÁ Z., SEDLÁČEK I., ROUBAL P. (2002): Occurrence of Bacillus cereus and Bacillus licheniformis strains in the course of UHT milk production. Czech J. Anim. Sci., 47: 200-205. VYLETĚLOVÁ M., HANUŠ O. (2005): Výskyt vybraných potravních patogenů při výrobě UHT mléka, jogurtu a sýru. Veterinářství,9: 567-572. Publikace výsledků k uplatněné metodice BANYKÓ J. (2006): Identification of Bacillus genomic species by means of amplified rdna restriction analysis (ARDRA). Výzkum v chovu skotu, 4: 14-18. ISSN 0139-7265. VYLETĚLOVÁ M. (2006): Differentiation of B. cereus strains isolated from raw milk, pasteurized milk and milk products using molecular methods ribotyping and rep-pcr. Výzkum v chovu skotu, 4: 10-14. ISSN 0139-7265 VYLETĚLOVÁ M., BANYKÓ J. (2006): Differentiation of B. cereus strains isolated from milk and milk products using rep-pcr. In Abstracts book. 3 rd International Symposium Milk Genomics and Human health. 19. - 21. 9. 2006, Brussel, Belgium. 7