!
Obsah 1. Obsah... 5 2. Skladování... 5 3. Další potebné vybavení... 6 4. Všeobecná preventivní opatení... 7 5. Informace o pvodcích... 7 6. Princip PCR s hodnocením v reálném ase... 7 7. Popis produktu... 8 8. Protokol... 8 8.1 Izolace DNA... 8 8.2 Interní kontrola... 10 8.3 Kvantifikace... 11 8.4 Píprava PCR... 12 8.5 Programování ABI PRISM SDS... 18 8.5.1 Programování ABI PRISM 7000 SDS... 18 8.5.1.1 Pedvolená nastavení pi vytváení nového bhu PCR...18 8.5.1.2 Vytvoení/volba detektor...19 8.5.1.3 Piazení potebných informací k pozicím destiek...20 8.5.1.4 Vytvoení teplotního profilu...21 8.5.1.5 Uložení bhu PCR...22 8.5.1.6 Spuštní bhu PCR...22 8.5.2 Programování ABI PRISM 7700 SDS... 23 8.5.2.1 Pedvolená nastavení pi vytváení nového bhu PCR...23 8.5.2.2 Volba fluorescenního barviva a piazení typu vzorku...23 8.5.2.3 Piazení potebných informací k pozicím destiek...24 8.5.2.4 Vytvoení teplotního profilu...25 8.5.2.5 Dležitá pídavná nastavení...27 VZV PCR Kit 03/2007 3
8.5.2.6 Uložení bhu PCR...28 8.5.2.7 Spuštní bhu PCR...29 8.5.3 Programování ABI PRISM 7900HT SDS... 30 8.5.3.1 Pedvolená nastavení pi vytváení nového bhu PCR...30 8.5.3.2 Vytvoení/volba detektor...31 8.5.3.3 Piazení potebných informací k pozicím destiek...32 8.5.3.4 Vytvoení teplotního profilu...33 8.5.3.5 Uložení bhu PCR...35 8.5.3.6 Spuštní bhu PCR...35 9. Vyhodnocení... 36 10. ešení problém... 41 11. Specifikace... 43 11.1 Analytická senzitivita... 43 11.2 Specificita... 44 11.3 Pesnost... 45 11.4 Robustnost... 47 11.5 Reprodukovatelnost... 47 11.6 Diagnostické hodnocení... 47 12. Zvláštní pokyny pro použití produktu... 47 13. Bezpenostní informace... 48 14. Kontrola kvality... 48 15. Literatura... 48 16. Vysvtlení symbol... 49 4 VZV PCR Kit 03/2007
VZV PCR Kit * Pro použití s ABI PRISM 7000, 7700 a 7900HT Sequence Detection Systems (Applied Biosystems). Upozornní: VZV PCR Kit nelze použít ani ve spojení s GeneAmp 5700 SDS, ani s 384 formátem destiek systému ABI PRISM 7900HT SDS. 1. Obsah Oznaení a obsah List No. 8K54-02 48 reakcí Modrá VZV TM Master 4 x 12 rxns ervená ervená ervená ervená VZV LC/TM QS 1 1 x 10 4 cop/µl VZV LC/TM QS 2 1 x 10 3 cop/µl VZV LC/TM QS 3 1 x 10 2 cop/µl VZV LC/TM QS 4 1 x 10 1 cop/µl 1 x 200 µl 1 x 200 µl 1 x 200 µl 1 x 200 µl Zelená VZV TM IC 1 x 1 000 µl Bílá Water (PCR grade) 1 x 1 000 µl QS = Kvantifikaní standard IC = Interní kontrola 2. Skladování Komponenty VZV PCR Kit se skladují pi -20 C a mají trvanlivost do data uvedeného na štítku. Zabrate opakovanému rozmrazení a zmrazení (> 2 x), snižuje se tím senzitivita. Pi nepravidelném používání by proto mly být reagencie alikvotovány. V pípad, že je nutné komponenty skladovat pi teplot +4 C, skladujte je takto maximáln po dobu pti hodin. * Vyrobeno firmou QIAGEN GmbH, D-40724 Hilden, pro Abbott Diagnostics GmbH. Výrobce podle zákona o zdravotnických prostedcích: QIAGEN GmbH. Applied Biosystems je registrovaná obchodní znaka a ABI PRISM je ochranná známka firmy Applera Corporation v USA a/nebo v jiných zemích. VZV PCR Kit 03/2007 5
3. Další potebné vybavení Laboratorní rukavice bez pudru DNA-izolaní souprava (viz 8.1 Izolace DNA) Pipety (nastavitelné) Sterilní pipetovací špiky s filtrem Vortex mixer Stolní centrifuga s rotorem pro 2 ml zkumavky Centrifuga s rotorem pro mikrotitraní destiky (volitelné) 96-ti jamková reakní destika/zkumavky pro optická mení s odpovídajícími optickými uzavíracími prostedky (viz 8.4 Píprava PCR) 96-ti jamkové dvojdílné pídržné rámy k použití optických zkumavek (96-Well Tray/Retainer Set, kat.. 403 081, Applied Biosystems), viz 8.4 Píprava PCR Kompresní podložka pro použití s optickými lepicími foliemi (Optical Cover Compression Pads, kat.. 4 312 639, Applied Biosystems), viz 8.4 Píprava PCR Aplikátor k uzavení reakních destiek pi použití optických lepicích folií (Adhesive Seal Applicator Kit, kat.. 4 333 183, Applied Biosystems) ABI PRISM 7000, 7700 nebo 7900HT SDS (Applied Biosystems) Upozornní: Pi uvedení pístroj do provozu je bezpodmínen nutná jsoucí platná kalibrace barviv (Pure Spectra Component File) a pozadí (Background Component File). Použití zkumavek k optickým mením s vypouklými víky je pípustné pouze pro ABI PRISM 7700 SDS a vyžaduje zmnu nastavení doby osvitu (viz 8.5.2 Programování ABI PRISM 7700 SDS, 8.5.2.5 Dležitá pídavná nastavení). 6 VZV PCR Kit 03/2007
4. Všeobecná preventivní opatení Uživatel by ml dbát na následující: Používejte sterilní pipetovací špiky s filtrem. Skladujte, izolujte a pidávejte pozitivní materiál (vzorky, kontroly, amplifikáty) do reakce na jiném míst než ostatní reagencie. Všechny komponenty ped poátkem testu úpln rozmrazte pi pokojové teplot. Následn komponenty ádn promíchejte a krátce centrifugujte. Pracujte plynule na ledu nebo v chladicím bloku. 5. Informace o pvodcích Virus Varicella zoster (VZV) se penáší z lovka na lovka prostednictvím kapénkové infekce nebo pímým kontaktem. Infekce VZV vede k lehké horece a celkovému pocitu mírného oslabení. Pro onemocnní je charakteristický polymorfní exantém s papulami, puchýky a krustami, doprovázený silným svdním (plané neštovice). Tžký prbh infekce VZV se vyskytuje u imunosuprimovaných pacient s nebezpenými komplikacemi jako pneumonií nebo encefalitidou. Po akutní infekci persistují pvodci v senzorických spinálních gangliích a v gangliích mozkových nerv. Pi snížené imunit mže dojít k exacerbacím (nap. herpes rt, pásový opar). 6. Princip PCR s hodnocením v reálném ase Pi diagnostikování pomocí polymerázové etzové reakce (PCR) se amplifikují specifické oblasti genomu pvodce. Detekce probíhá pi PCR v reálném ase pomocí fluorescenních barviv. Barviva jsou zpravidla vázaná na oligonukleotidové sondy, které se specificky vážou na PCR amplifikát. Detekce intenzity fluorescence v prbhu PCR v reálném ase umožuje prkaz a kvantifikaci produkt, aniž by bylo nutné po PCR znovu otevírat testovací zkumavky (Mackay, 2004). VZV PCR Kit 03/2007 7
7. Popis produktu VZV PCR Kit je systém k pímému použití pro prkaz VZV DNA pomocí polymerázové etzové reakce (PCR) v ABI PRISM 7000, 7700 a 7900HT Sequence Detection System (Applied Biosystems). VZV TM Master obsahuje reagencie a enzymy pro specifickou amplifikaci 82 bp dlouhého úseku genomu VZV. Detekce amplifikátu se provádí mením fluorescence FAM v ABI PRISM SDS. Krom toho obsahuje VZV PCR Kit druhý heterologní amplifikaní systém pro prkaz potenciální PCR inhibice. Tento systém je detekován jako Interní kontrola (IC) mením fluorescence VIC. Limit detekce analytické VZV PCR (viz 11.1 Analytická senzitivita) pitom není negativn ovlivnn. Spolu s produktem se dodávají externí pozitivní kontroly (VZV LC/TM QS 1-4), s jejichž pomocí lze urit množství pvodce ve vzorku. Prostudujte si prosím oddíl 8.3 Kvantifikace. 8. Protokol 8.1 Izolace DNA DNA-izolaní soupravy nabízejí rzní výrobci. V závislosti na protokolu zvoleného výrobce použijte dané množství vzorku a provete izolaci DNA podle návodu. Doporuujeme následující izolaní soupravy: Vzorek Izolaní souprava Katalogové íslo Výrobce Nosi RNA sérum, plazma, likvor, výtry QIAamp UltraSens Virus Kit (50) QIAamp DNA Mini Kit (50) 53 704 QIAGEN obsažen 51 304 QIAGEN neobsažen Užití nosie RNA má rozhodující význam pro efektivitu izolace a tím pro výtžek DNA/RNA. Pokud použitá izolaní souprava neobsahuje žádný nosi RNA, povšimnte si prosím, že je pi izolaci nukleových kyselin z nebunných tlesných tekutin resp. materiál s malým obsahem DNA/RNA (nap. likvor) drazn doporueno pidat nosi RNA (RNA 8 VZV PCR Kit 03/2007
homopolymer Poly(A), Amersham Biosciences, kat. ís. 27-4110-01). Prosím postupujte následujícím zpsobem: a) Resuspendujte lyofilizovaný nosi RNA v eluním pufru (nepoužívejte lyzaní pufr) izolaní soupravy (nap. AE pufr soupravy QIAamp DNA Mini Kit) a edním vytvote roztok o koncentraci 1 µg/µl. Rozdlte tento roztok nosie RNA na poet alikvot odpovídající Vaším požadavkm a skladujte je pi -20 C. Zabrate opakovanému rozmrazení (> 2 x) alikvotu nosie RNA. b) Používejte 1 µg nosie RNA na 100 µl lyzaního pufru. Je-li extrakním protokolem stanoveno 200 µl lyzaního pufru na jeden vzorek, vložte 2 µl nosie RNA (1 µg/µl) pímo do lyzaního pufru. Ped zaátkem každé izolace musí být podle následujícího pipetovacího schématu erstv vytvoena sms lyzaního pufru a nosie RNA (pop. i Interní kontroly, viz 8.2 Interní kontrola): Poet vzork 1 12 Lyzaní pufr nap. 200 µl nap. 2 400 µl Nosi RNA (1 µg/µl) 2 µl 24 µl Celkový objem 202 µl 2 424 µl Objem pro izolaci 200 µl po 200 µl c) Tuto erstv vytvoenou sms lyzaního pufru a nosie RNA vložte ihned do izolace. Skladování smsi není možné. Užití nosie RNA má rozhodující význam pro efektivitu izolace a tím pro výtžek DNA/RNA. Aby bylo dosaženo vyšší stability nosie RNA dodávaného s QIAamp UltraSens Virus Kit, doporuujeme následující postup lišící se od údaj uvedených v píruce izolaní soupravy: a. Resuspendujte lyofilizovaný nosi RNA ped prvním použitím izolaní soupravy v 310 µl eluního pufru obsaženého v souprav (konená koncentrace 1 µg/µl, nepoužívejte lyzaní pufr). Rozdlte tento roztok nosie RNA na poet alikvot odpovídající Vaším požadavkm a skladujte je pi -20 C. Zabrate opakovanému rozmrazení (> 2 x) alikvotu nosie RNA. VZV PCR Kit 03/2007 9
b. Ped zaátkem každé izolace musí být podle následujícího pipetovacího schématu erstv vytvoena sms lyzaního pufru a nosie RNA (pop. i Interní kontroly, viz 8.2 Interní kontrola): Poet vzork 1 12 Lyzaní pufr AC 800 µl 9 600 µl Nosi RNA (1 µg/µl) 5,6 µl 67,2 µl Celkový objem 805,6 µl 9 667,2 µl Objem pro izolaci 800 µl po 800 µl c. Tuto erstv vytvoenou sms lyzaního pufru a nosie RNA vložte ihned do izolace. Skladování smsi není možné. Použitím QIAamp UltraSens Virus Kit lze docílit zkoncentrování vzorku. Pokud se v pípad vašeho vzorku nejedná o sérum nebo plazmu, pidejte k vzorku alespo 50 % (v/v) negativní lidské plazmy. Pi izolaci využívající promývací pufr s obsahem etanolu bezpodmínen zajistte, aby byl ped elucí proveden ješt jeden centrifuganí krok (ti minuty, 13 000 ot/min) a tím se odstranily zbytky etanolu. Pedejdete tak možným inhibicím PCR. VZV PCR Kit není vhodný pro izolace na základ fenolu. Dležité: Interní kontrolu soupravy VZV PCR Kit lze vložit pímo do izolace (viz 8.2 Interní kontrola). 8.2 Interní kontrola Spolu s produktem se dodává Interní kontrola (VZV TM IC). Máte tak možnost kontrolovat jak izolaci DNA, tak také možnou inhibici PCR (viz Obr. 1). Pro tuto aplikaci pidejte k izolaci Interní kontrolu v pomru 0,1 µl na 1 µl eluního objemu. Jestliže napíklad používáte QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN) a eluujete DNA v 200 µl AE pufru, vložte 20 µl Interní kontroly. Jestliže nap. eluujete ve 100 µl, vložte 10 µl. Množství vkládané Interní kontroly závisí pouze na eluním objemu. Interní kontrola a nosi RNA (viz 8.1 Izolace DNA) by mly být pidávány pouze k 10 VZV PCR Kit 03/2007
smsi lyzaního pufru a vzorku nebo pímo k lyzanímu pufru. Interní kontrola nesmí být pidána pímo ke vzorku. Pi pidání k lyzanímu pufru se musí dbát na to, aby byla sms Interní kontroly, lyzaního pufru a nosie RNA erstv pipravena a ihned použita (skladování smsi pi pokojové teplot nebo v lednici mže již po nkolika hodinách vést k vynechání Interní kontroly a ke snížení efektivity izolace). Interní kontrolu a nosi RNA nepipetujte pímo do vzorku. Voliteln lze Interní kontrolu použít výhradn ke kontrole možné inhibice PCR (viz Obr. 2). V tomto pípad pidejte 2 µl Interní kontroly na jednu testovací sms pímo do 30 µl VZV TM Master. Pro každou PCR reakci použijte 30 µl takto vytvoeného Master Mixu a pidejte následn 20 µl izolátu. Jestliže pipravujete jeden bh pro více vzork, zvyšte potebná množství VZV TM Master a Interní kontroly podle potu vzork (viz 8.4 Píprava PCR). 8.3 Kvantifikace S Kvantifikaními standardy (VZV LC/TM QS 1-4) dodávanými spolu s produktem se zachází stejn jako s již izolovanými vzorky a pidávají se ve stejném objemu (20 µl). Standardní kivku v ABI PRISM Sequence Detection System vytvoíte tak, že vložíte všechny tyi Kvantifikaní standardy dodávané s produktem a definujete je jako standardy pi zadání odpovídajících koncentrací (viz 8.5 Programování ABI PRISM SDS). Import standardních kivek z pedchozích bh není se softwarem ABI PRISM 7000, 7700 a 7900HT SDS možný. Upozornní: Kvantifikaní standardy jsou definovány jako kopie/µl. Pro pepoet hodnot získaných pomocí standardní kivky na kopie/ml vzorku se používá následující vzorec: Zvýšení objemu podmínné pidáním Interní kontroly je pi píprav PCR reakce opominuto. Senzitivita není omezena. VZV PCR Kit 03/2007 11
výsledek (kopie/ml) = výsledek (kopie/µl) x eluní objem (µl) objem vzorku (ml) Prosím povšimnte si, že se do výše uvedeného vzorce dosazuje zásadn pvodní objem vzorku. Toto se musí zohlednit, byl-li objem vzorku ped izolací nukleových kyselin pozmnn (nap. redukce objemu centrifugací nebo jeho zvýšení naplnním na objem požadovaný pro izolaci). Dležité: Na www.giagen.com/product/bylabfocus/mdx je k dispozici píruka pro zjednodušení kvantitativního vyhodnocení systém na ABI PRISM 7000 SDS (Technical Note for quantitation on the ABI PRISM 7000 SDS). 8.4 Píprava PCR Pipravte pro plánované reakce potebný poet zkumavek resp. 96-ti jamkovou reakní destiku. Doporuené prostedky jsou uvedeny v následující tabulce: Položka Oznaení Katalogové íslo Výrobce Pídržné rámy Kompresní podložka 96-ti jamková optická reakní destika 96-Well Optical Reaction Plate 4 306 737 Applied Biosystems ne - Optické lepicí folie Optical Adhesive Covers 4 311 971 Applied Biosystems - ano Optické zkumavky ABI PRISM Optical Tubes, 8 Tubes/Strip 4 316 567 Applied Biosystems ano - Optické zkumavky MicroAmp Optical Tubes N8010933 Applied Biosystems ano - Optická víka (plochá) ABI PRISM Optical Caps, 8 Caps/Strip 4 323 032 Applied Biosystems - ne Pi použití dvojdílných pídržných rám je nutné zkumavky pi vkládání a pi vyjímání otevít. K zamezení tím zapíinných kontaminací používejte výhradn dolní díl pídržného rámu. 12 VZV PCR Kit 03/2007
Upozornní: Použití zkumavek k optickým mením s vypouklými víky je pípustné pouze pro pístroj ABI PRISM 7700 SDS a vyžaduje zmnu nastavení doby osvitu (viz 8.5.2 Programování ABI PRISM 7700 SDS, 8.5.2.5 Dležitá pídavná nastavení). Pi píprav PCR dbejte na to, aby byl spolen s každým bhem PCR proveden alespo jeden Kvantifikaní standard a jedna negativní kontrola (Water, PCR grade). Standardní kivku vytvoíte u každého bhu PCR pomocí všech spolu s produktem dodávaných Kvantifikaních standard (VZV LC/TM QS 1-4). Všechny reagencie se musí ped zaátkem testu zcela rozmrazit pi pokojové teplot, musí být dobe promíchány (opakovaný nábr pipetou a vypuštní pipety nebo krátký vortex) a následn centrifugovány. Chcete-li Interní kontrolou kontrolovat jak izolaci DNA, tak možnou inhibici PCR, musí být naped Interní kontrola pidána k izolaci (viz 8.2 Interní kontrola). V tomto pípad používejte následující schéma pipetování (viz také schématický pehled na Obr. 1): 1. Píprava Master Mixu 2. Píprava PCR reakce Poet vzork 1 12 VZV TM Master 30 µl 360 µl VZV TM IC 0 µl 0 µl celkový objem 30 µl 360 µl Master Mix 30 µl po 30 µl vzorek 20 µl po 20 µl celkový objem 50 µl po 50 µl Jestliže chcete Interní kontrolu použít výhradn ke kontrole PCR inhibice, je teba ji pidat pímo do VZV TM Master. V tomto pípad používejte následující schéma pipetování (viz také schématický pehled na Obr. 2): VZV PCR Kit 03/2007 13
1. Píprava Master Mixu 2. Píprava PCR reakce Poet vzork 1 12 VZV TM Master 30 µl 360 µl VZV TM IC 2 µl 24 µl celkový objem 32 µl 384 µl Master Mix 30 µl po 30 µl vzorek 20 µl po 20 µl celkový objem 50 µl po 50 µl Pipetujte do každé zkumavky nebo do každé potebné jamky 96-ti jamkové reakní destiky 30 µl Master Mixu. Následn pidejte 20 µl eluátu z izolace DNA. Dbejte na to, aby byly oba roztoky dobe promíchány opakovaným nábrem pipetou a jejím vypuštním. Uzavete zkumavky píslušnými víky. 96-ti jamkovou reakní destiku mžete alternativn uzavít pomocí optických lepicích folií (Optical Adhesive Covers, Applied Biosystems). Pro shromáždní vkládaného objemu na dn zkumavek nebo destiek centrifugujte zkumavky (v držáku ureném pro zkumavky PCR) pop. 96-ti jamkovou reakní destiku v centrifuze vybavené rotorem pro mikrotitraní desky po dobu 30 sekund pi 1 780 x g (4 000 ot/min). Pokud takovou centrifugu nemáte k dispozici, dbejte pi píprav reakcí PCR na to, aby byly Master Mix a objem vzorku pipetovány na dno zkumavek pop. reakních jednotek (well). Reakní smsi skladujte pi teplot +4 C, dokud nebude pístroj ABI PRISM SDS naprogramován (viz 8.5 Programování ABI PRISM SDS) a pak je pevete do pístroje. Upozornní: Pi použití optických zkumavek v kombinaci s optickými víky vkládejte do pístroje (ABI PRISM 7000, 7700 a 7900HT SDS) vždy pídržný rám (96-Well Tray/Retainer Set, Applied Biosystems). Pi použití dvojdílného pídržného rámu je nutné zkumavky pi vkládání a pi vyjímání otevít. K zamezení tím zapíinných kontaminací používejte výhradn dolní díl pídržného rámu. Zvýšení objemu podmínné pidáním Interní kontroly je pi píprav PCR reakce opominuto. Senzitivita detekního systému není omezena. 14 VZV PCR Kit 03/2007
Použití 96-ti jamkových optických reakních destiek v kombinaci s optickými lepicími foliemi vyžaduje vložení kompresní podložky (Optical Cover Compression Pads, Applied Biosystems). VZV PCR Kit 03/2007 15
Pidání Interní kontroly k izolaci Izolace sm s lyzaního pufru a vzorku + 0,1 µl IC* na 1 µl eluního objem u 20 µl izolátu* 30 µl Master* Optická reakní destika/ optické zkum avky ABI PRISM SDS Obr. 1: Schéma pracovního postupu pro kontrolu izolace a inhibice PCR. * Pi každém pipetovacím kroku je teba bezpodmínen dbát na to, aby byly používané roztoky dokonale roztáté, ádn promíchané a krátce centrifugované. 16 VZV PCR Kit 03/2007
Pidání Interní kontroly k Master 2 µl IC* 30 µl Master* Izolace 32 µl Master Mix* 20 µl izolátu* 30 µl Master Mix* Optická reakní destika/ optické zkum avky ABI PRISM SDS Obr. 2: Schéma pracovního postupu pro kontrolu inhibice PCR. * Pi každém pipetovacím kroku je teba bezpodmínen dbát na to, aby byly používané roztoky dokonale roztáté, ádn promíchané a krátce centrifugované. VZV PCR Kit 03/2007 17
8.5 Programování ABI PRISM SDS Software ABI PRISM 7000, 7700 a 7900HT Sequence Detection Systems (SDS) potebuje ped spuštním bhu PCR dodatené informace. Postupy pi programování pístroj se od sebe významn odlišují, proto jsou v následujícím textu uvedeny v samostatných kapitolách. 8.5.1 Programování ABI PRISM 7000 SDS K detekci VZV DNA vytvote na pístroji ABI PRISM 7000 SDS profil podle následujících šesti pracovních krok (8.5.1.1-8.5.1.6). Veškeré údaje se vztahují na ABI PRISM 7000 SDS software verzi 1.0.1. Podrobnosti o programování ABI PRISM 7000 SDS si prosím prostudujte v píruce ABI PRISM 7000 SDS User Guide. Pro lepší pehled jsou potebná nastavení na obrázcích zvýraznna ernými rámeky. 8.5.1.1 Pedvolená nastavení pi vytváení nového bhu PCR Na pístroji ABI PRISM 7000 SDS vyberte pod File položku New a nastavte pro nový dokument následující základní nastavení (viz Obr. 3). Díve uložená šablona (SDS Template [*.sdt]) je k dispozici v seznamu Template nebo volbou funkce Browse (viz 8.5.1.5 Uložení bhu PCR). Svá zadání potvrte (OK). Obr. 3: Pedvolená nastavení pi vytváení nového bhu PCR (New Document). 18 VZV PCR Kit 03/2007
8.5.1.2 Vytvoení/volba detektor V nabídce Tools, v podnabídce Detector Manager, piate dokumentu odpovídající barviva detektoru. K prkazu VZV DNA a Interní kontroly pomocí VZV PCR Kit je nutné definovat reporter/quencher uvedené v následující tabulce: Prkaz Reporter Quencher VZV DNA FAM TAMRA Interní kontrola (VZV TM IC) VIC none Tyto detektory vytvoíte tak, že vyberete v položce Detector Manager vlevo dole lokalizovanou volbu File a následn volbu New. Obr. 4: Vytvoení VZV specifického detektoru (Detector Manager). Obr. 5: Vytvoení detektoru specifického pro Interní kontrolu (Detector Manager). V okn, které se zobrazí, definujte (podle Obr. 4 a Obr. 5) kombinaci reporter/quencher FAM/TAMRA pro prkaz VZV DNA, pro prkaz Interní kontroly zvolte kombinaci VIC/none. Potvrzením údaj (OK) se vrátíte zpt do Detector Manager. Oznate práv vytvoené detektory a každý výbr peneste klepnutím na volbu Add to Plate Document do Well Inspector (viz Obr. 6). Zavete okno (Done). VZV PCR Kit 03/2007 19
Obr. 6: Výbr detektor (Detector Manager). 8.5.1.3 Piazení potebných informací k pozicím destiek Pokud nyní v nabídce View otevete položku Well Inspector, naleznete tam Vámi v kapitole 8.5.1.2 zvolené detektory znovu (viz Obr. 7). Obr. 7: Piazení potebných informací k pozicím destiek (Well Inspector). Oznate pozice destiky, které jsou obsazené pro prkaz VZV DNA. Aktivujte volbu Use u obou detektor, ímž vybrané detektory piadíte k oznaeným pozicím. Objeví se zatržítko. Pro pojmenování jednotlivých reakních smsí vyberte odpovídající pozici na destice a zadejte název do položky Sample Name. Pitom pamatujte na to, že smsi se stejným Sample Name a stejným piazením detektor bude software považovat za replikáty a zprmruje je 20 VZV PCR Kit 03/2007
s ohledem na jejich kvantifikované množství pvodce. Pak vyberte pro každý typ vzorku odpovídající funkci (Task) podle následující tabulky: Typ vzorku Funkce (Task) Koncentrace (Quantity) Reporter Quencher vzorek Unknown - FAM TAMRA negativní kontrola NTC - FAM TAMRA standard Standard viz 1.Obsah FAM TAMRA Standardní kivku vytvote u každého bhu PCR pomocí všech spolu s produktem dodávaných Kvantifikaních standard (VZV LC/TM QS 1-4) a pro každý jednotlivý standard (Quantity) uvete píslušné koncentrace (viz 1. Obsah). Dbejte na to, že pro bh PCR s VZV PCR Kit musí být ROX nastaven jako pasivní reference (Passive Reference). Rovnomrné rozložení barviva ROX na všechny smsi PCR jedné šarže pomocí promíchání VZV TM Master zaruuje rozpoznání a pepoítání tube-to-tube variací (fluorescenní rozdíly mezi rznými smsmi PCR) pomocí Sequence Detection Software (normalizace). 8.5.1.4 Vytvoení teplotního profilu K zadání teplotního profilu pepnte software z režimu Setup do režimu Instrument. Podle Obr. 8 zadejte platný teplotní profil pro detekci VZV DNA. Krok 50 C uložený v pedvoleném nastavení odstraníte tak, že jej oznaíte levým tlaítkem myši, piemž pidržíte stisknuté tlaítko Shift, a následn jej vymažete tlaítkem Backspace. Zkontrolujte, zda je objem reakce nastaven na 50 µl. Volba 9600 Emulation by mla být aktivována. Pedvolená nastavení Auto Incrementu zstávají nezmnná (Auto Increment: 0.0 C, 0.0 Seconds). VZV PCR Kit 03/2007 21
Obr. 8: Vytvoení teplotního profilu. 8.5.1.5 Uložení bhu PCR Na tomto míst mžete uvedená nastavení (Setup) uložit jako masku, abyste je pozdji mohli použít ve zmnném nebo nezmnném stavu. Uložíte-li nastavení jako SDS Template (*.sdt) v adresái Template Directory (místní disk [C:]\Program Files\ABI PRISM 7000\Templates, zavedeného Applied Biosystems), mžete tento soubor zvolit pímo z Template drop-down seznamu v okn New Document. Pedlohy uložené v jiných adresáích musí být oteveny pomocí funkce Browse. Ped spuštním bhu PCR dbejte prosím na to, abyste jej znovu uložili jako SDS Document (*.sds). Tím zajistíte ukládání dat nahromadných v prbhu PCR. 8.5.1.6 Spuštní bhu PCR Bh PCR spuste volbou Start v položce nabídky Instrument nebo polem Start v režimu Instrument. 22 VZV PCR Kit 03/2007
8.5.2 Programování ABI PRISM 7700 SDS K detekci VZV DNA vytvote na pístroji ABI PRISM 7700 SDS profil podle následujících sedmi pracovních krok (8.5.2.1-8.5.2.7). Veškeré údaje se vztahují na ABI PRISM 7700 SDS software verzi 1.9.1. Podrobnosti o programování ABI PRISM 7700 SDS si prosím prostudujte v píruce ABI PRISM 7700 SDS User`s Manual. Pro lepší pehled jsou potebná nastavení na obrázcích zvýraznna ernými rámeky. 8.5.2.1 Pedvolená nastavení pi vytváení nového bhu PCR Na pístroji ABI PRISM 7700 SDS vyberte pod File položku New Plate a nastavte pro nový dokument následující základní nastavení (viz Obr. 9). Svá zadání potvrte (OK). Obr. 9: Pedvolená nastavení pi vytváení nového bhu PCR (New Plate). 8.5.2.2 Volba fluorescenního barviva a piazení typu vzorku Pomocí položky Sample Type Setup (režim Setup: Sample Type/Sample Type Setup) piate dokumentu odpovídající barviva detektoru a odpovídající typ vzorku. K prkazu VZV DNA a Interní kontroly pomocí VZV PCR Kit je nutné definovat reporter/quencher uvedené v následující tabulce: Prkaz Reporter Quencher VZV DNA FAM TAMRA Interní kontrola (VZV TM IC) VIC TAMRA VZV PCR Kit 03/2007 23
Pro mení VZV DNA pomocí VZV PCR Kit vyberte podle tabulky barvivo reporteru FAM. To platí pro standardy (STND), vzorky (UNKN) a pro negativní kontroly (UNKN). K mení Interní kontroly (IPC+) definujte VIC jako reporter. Jako quencher nastavte TAMRA. Piazení barviv a typ vzork v okn Sample Type Setup je zobrazeno na Obr. 10. Obr. 10: Volba fluorescenních barviv a piazení typu vzorku (Sample Type Setup). Piazení typu vzorku k odpovídající funkci (Acronym) se provádí podle následující tabulky: Typ vzorku Funkce (Acronym) Koncentrace (Quantity) Reporter Quencher vzorek UNKN - FAM TAMRA negativní kontrola UNKN - FAM TAMRA standard STND viz 1. Obsah FAM TAMRA 8.5.2.3 Piazení potebných informací k pozicím destiek Pro piazení detektor a typ vzork k jednotlivým pozicím destiek zvolte odpovídající pole. Pak otevete v režimu Setup dialogové okno Dye Layer a piate píslušný reporter. Aktivujete-li pop-up menu Sample Type, tak v zobrazeném seznamu znovu naleznete typy vzork piazené reporteru v Sample Type Setup (viz Obr. 11). Vyberte vhodný typ vzorku (viz tabulka v 24 VZV PCR Kit 03/2007
8.5.2.2) a urete pomocí Dye Layer a nabídky Sample Type piazení ke zbývajícím pozicím destiky. V poli Sample Name lze každému vzorku piadit jméno. Pole definovaná jako Replicate (zadání názvu kontrolního vzorku do kolonky Replicate) zprmruje software vzhledem k jejich kvantifikovanému množství pvodce a vypoítá jejich standardní odchylku. Obr. 11/12: Piazení potebných informací k pozicím destiek. Standardní kivku vytvote u každého bhu PCR pomocí všech s produktem dodávaných Kvantifikaních standard (VZV LC/TM QS 1-4) a pro každý jednotlivý standard (Quantity, viz Obr. 12) uvete píslušné koncentrace (viz 1. Obsah). To je však možné pouze tehdy, jestliže pozice obsazené standardy byly pedem jako takové definovány pomocí nabídky Sample Type. 8.5.2.4 Vytvoení teplotního profilu K zadání teplotního profilu pepnte na nabídku Thermal Cycler Conditions na ploše Setup. Podle Obr. 13 zadejte pro detekci VZV DNA platný teplotní profil. Zkontrolujte, zda je objem reakce nastaven na 50 µl. Pedvolená nastavení as Ramp a Auto Increment zstávají nezmnná (Ramp Time: 0:00, Auto Increment: 0.0 C, 0.0 Seconds). VZV PCR Kit 03/2007 25
Obr. 13: Vytvoení teplotního profilu. Krom toho se v nabídce Thermal Cycler Conditions nachází volba Show Data Collection. Zvolením této volby se dostanete do okna zobrazeného na Obr. 14. Každá Ramp a Plateau teplota je opatena symbolem sbru dat (Data Collection Icon), který znázoruje pijetí dat v tomto uritém okamžiku bhu. Klepnutím odstrate všechny symboly až na ten ve chvíli kroku Annealing-Extension (Stage2/Step2), ímž ušetíte zbytená fluorescenní mení. Tak udržíte celkovou dobu bhu a množství dat co nejnižší. 26 VZV PCR Kit 03/2007
Obr. 14: Sbr dat (Data Collection). 8.5.2.5 Dležitá pídavná nastavení K nastavení doby osvitu (vybuzení fluorescenního barviva) a také pro volbu soubor Pure Spectra a Background pejdte z režimu Setup na režim Analysis. V nabídce Instrument, v podnabídce Diagnostics, zvolte nyní aktivovanou položku Advanced Options. Provete nastavení podle Obr. 15. Deaktivací funkce výbru Spectra Components (Analysis) se pi novém vyhodnocování již analyzovaných bh automaticky použijí aktuální kalibraní data, která byla do složky Spectra Components uložena ve chvíli vytváení dat. Pro analýzu starších bh za použití nov natených Spectra Components aktivujte prosím ob tato pole. Dbejte na to, že pro bh PCR s VZV PCR Kit musí být ROX nastaven jako pasivní reference (Reference). Rovnomrné rozložení barviva ROX na všechny reakní smsi PCR jedné šarže pomocí promíchání VZV TM Master zaruuje rozpoznání a pepoítání tube-to-tube variací (fluorescenní rozdíly mezi rznými reakními smsmi PCR) pomocí Sequence Detection Software (normalizace). VZV PCR Kit 03/2007 27
Upozornní: Doba osvitu (Exposure Time) pi použití 96-ti jamkových reakních destiek pro optická mení ve spojení s optickými lepicími foliemi (Optical Adhesive Covers) nebo optickými zkumavkami s plochými víky je deset milisekund. Používáte-li optické zkumavky s vypouklými víky, nastavte tento asový údaj na 25 milisekund. Obr. 15: Dležitá pídavná nastavení (Advanced Options). 8.5.2.6 Uložení bhu PCR Na tomto míst mžete uvedená nastavení (Setup) uložit jako masku, abyste je mohli pozdji použít ve zmnném nebo nezmnném stavu. Proto uložte tento soubor ve Stationary File Format. Ped spuštním aktuáln programovaného bhu PCR pamatujte na to, že jej musíte znovu uložit ve Normal File Format. Tím zajistíte uložení dat nahromadných v prbhu PCR. 28 VZV PCR Kit 03/2007
8.5.2.7 Spuštní bhu PCR Bh PCR spuste volbou Run v položce nabídky Instrument nebo polem Run v režimu Analysis. VZV PCR Kit 03/2007 29
8.5.3 Programování ABI PRISM 7900HT SDS K detekci VZV DNA vytvote na pístroji ABI PRISM 7900HT SDS profil podle následujících šesti pracovních krok (8.5.3.1-8.5.3.6). Veškeré údaje se vztahují na ABI PRISM 7900HT SDS software verzi 2.1. Podrobnosti o programování ABI PRISM 7900HT SDS si prosím prostudujte v píruce ABI PRISM 7900HT SDS User Guide. Pro lepší pehled jsou potebná nastavení na obrázcích zvýraznna ernými rámeky. 8.5.3.1 Pedvolená nastavení pi vytváení nového bhu PCR Na pístroji ABI PRISM 7900HT SDS vyberte pod File položku New a nastavte pro nový dokument následující základní nastavení (viz Obr. 16). Díve uložená šablona (ABI PRISM SDS Template Document [*.sdt]) je k dispozici v seznamu Template nebo volbou funkce Browse (viz 8.5.3.5 Uložení bhu PCR). Svá zadání potvrte (OK). Upozornní: VZV PCR Kit nelze použít ve spojení s 384 formátem destiek ABI PRISM 7900HT SDS. Obr. 16: Pedvolená nastavení pi vytváení nového bhu PCR (New Document). 30 VZV PCR Kit 03/2007
8.5.3.2 Vytvoení/volba detektor V nabídce Tools, v podnabídce Detector Manager, (alternativn zvolte režim Setup/funkci Add Detector) piate dokumentu odpovídající barviva detektor. K prkazu VZV DNA a Interní kontroly pomocí VZV PCR Kit je nutné definovat reporter/quencher uvedené v následující tabulce: Prkaz Reporter Quencher VZV DNA FAM TAMRA Interní kontrola (VZV TM IC) VIC Non Fluorescent Tyto detektory vytvoíte tak, že vyberete v položce Detector Manager vlevo dole lokalizovanou volbu New. Obr. 17: Vytvoení VZV specifického detektoru (Detector Manager). Obr. 18: Vytvoení detektoru specifického pro Interní kontrolu (Detector Manager). V okn, které se zobrazí, definujte (podle Obr. 17 a Obr. 18) kombinaci reporter/quencher FAM/TAMRA pro prkaz VZV DNA, pro prkaz Interní kontroly vyberte kombinaci VIC/Non Fluorescent. Potvrzením údaj (OK) se vrátíte zpt do Detector Manager. Oznate práv vytvoené detektory a každý výbr peneste klepnutím na volbu Copy to Plate Document do režimu Setup (viz Obr. 19). Zavete okno (Done). VZV PCR Kit 03/2007 31
Obr. 19: Výbr detektor (Detector Manager). 8.5.3.3 Piazení potebných informací k pozicím destiek Vámi v kapitole 8.5.3.2 zvolené detektory naleznete znovu po uzavení Detector Manager (Done) seazené v tabulce v režimu Setup (Well Inspector) (viz Obr. 20). Obr. 20: Piazení potebných informací k pozicím destiek. Oznate pozice destiky, které jsou obsazené pro prkaz VZV DNA. Aktivujte volbu Use u obou detektor, ímž vybrané detektory piadíte k oznaeným pozicím. Objeví se kížek. Pro pojmenování jednotlivých reakních smsí zvolte odpovídající pozici na destice a zadejte název do položky Sample Name. Pitom pamatujte na to, že smsi se stejným Sample Name a stejným piazením detektor bude software považovat za replikáty a zprmruje je s ohledem na jejich kvantifikované množství pvodce. Pak vyberte pro každý typ vzorku odpovídající funkci (Task) podle následující tabulky: 32 VZV PCR Kit 03/2007
Typ vzorku Funkce (Task) Koncentrace (Quantity) Reporter Quencher vzorek Unknown - FAM TAMRA negativní kontrola NTC - FAM TAMRA standard Standard viz 1. Obsah FAM TAMRA Standardní kivku vytvote u každého bhu PCR pomocí všech s produktem dodávaných Kvantifikaních standard (VZV LC/TM QS 1-4) a pro každý jednotlivý standard (Quantity) uvete píslušné koncentrace (viz 1. Obsah). Dbejte na to, že pro bh PCR s VZV PCR Kit musí být ROX nastaven jako pasivní reference (Passive Reference). Rovnomrné rozložení barviva ROX na všechny smsi PCR jedné šarže pomocí promíchání VZV TM Master zaruuje rozpoznání a pepoítání tube-to-tube variací (fluorescenní rozdíly mezi rznými smsmi PCR) pomocí Sequence Detection Software (normalizace). 8.5.3.4 Vytvoení teplotního profilu K zadání teplotního profilu pepnte software z režimu Setup do režimu Instrument. Podle Obr. 21 zadejte pro detekci VZV DNA platný teplotní profil. Zkontrolujte, zda je objem reakce nastaven na 50 µl. Volba 9600 Emulation by mla být aktivována, pedvolená nastavení asu Ramp a Auto Increment zstávají nezmnna (Ramp Time: 0:00, Auto Increment: 0.0 C, 0.0 Seconds). VZV PCR Kit 03/2007 33
Obr. 21: Vytvoení teplotního profilu. Krom toho se v režimu Instrument nachází volba Data Collection. Zvolením této volby se dostanete do okna zobrazeného na Obr. 22. Každá Ramp a Plateau teplota je opatena jedním symbolem sbru dat (Data Collection Icon), který znázoruje pijetí dat v tomto uritém okamžiku bhu. Odstrate všechny symboly až na ten ve chvíli kroku Annealing-Extension (Stage2/Step2), ímž ušetíte zbytená fluorescenní mení. Tak udržíte celkovou dobu bhu a množství dat co nejnižší. 34 VZV PCR Kit 03/2007
Obr. 22: Sbr dat (Data Collection). 8.5.3.5 Uložení bhu PCR Na tomto míst mžete uvedená nastavení (Setup) uložit jako masku, abyste je mohli pozdji použít ve zmnném nebo nezmnném stavu. Uložíte-li nastavení jako ABI PRISM SDS Template Document (*.sdt) v adresái Template Directory ([D:]\Program Files\Applied Biosystems\ SDS 2.1\Templates, zavedeném Applied Biosystems), mžete tento soubor zvolit pímo z Template seznamu v okn New Document. Pedlohy uložené v jiných adresáích musí být oteveny pomocí funkce Browse. Ped spuštním aktuálního bhu PCR dbejte prosím na to, abyste jej znovu uložili jako ABI PRISM SDS Document (*.sds). Tím zajistíte ukládání dat nahromadných v prbhu PCR. 8.5.3.6 Spuštní bhu PCR Bh PCR spuste volbou Start v položce nabídky Instrument. VZV PCR Kit 03/2007 35
9. Vyhodnocení Pi uvedení pístroje do provozu je bezpodmínen nutná jsoucí platná kalibrace barviv (Pure Spectra Component File) a pozadí (Background Component File). Tyto kalibraní soubory slouží následujícím zpsobem pro pesný výpoet výsledk: Veškeré pístrojem podmínné rušivé signály, které ovlivují mení, jsou eliminovány programem Sequence Detection Software pístroj ABI PRISM Sequence Detection Systems za pomoci Background Component File. Navíc se u vícebarevných analýz vyskytují mezi emisními spektry jednotlivých fluorescenních barviv interference. Software ABI PRISM SDS kompenzuje tyto interference pepoítáním pomocí spektrálních dat jednotlivých barviv uložených v Pure Spectra Component File. Piazení fluorescenních dat shromáždných v prbhu PCR v celém mitelném spektru k naprogramovaným detektorm provádí software také pomocí souboru Pure Spectra Component. Následn se zjištná fluorescenní data jednotlivých barviv rozdlí pro pepoítání tube-to-tube variací (fluorescenní rozdíly mezi rznými reakními smsmi PCR) pomocí signálu pasivní reference (ROX). Tímto zpsobem normalizované signály lze vyhodnotit pomocí Amplification Plot. Kalibraní soubory použité pi vyhodnocení bhu PCR jsou automaticky zajištny pi ukládání dat. Pokud nejsou instalovány žádné kalibraní soubory, vytvote tyto soubory podle pokyn v ABI PRISM SDS User Guide/Manual. Pokud do bhu PCR integrujete více než jeden systém PCR (dbejte na teplotní profil), analyzujte prosím tyto testovací systémy oddlen. Vzorky s totožným oznaením (Sample Name) a piazením detektoru identifikuje ABI PRISM 7000 a 7900HT SDS Software automaticky jako replikáty a zprmruje je s ohledem na kvantifikované množství pvodce. 36 VZV PCR Kit 03/2007
Mže dojít k následujícím výsledkm: 1. Je detekován fluorescenní signál FAM. Výsledek analýzy je pozitivní: Vzorek obsahuje VZV DNA. V tomto pípad je detekce fluorescenního signálu VIC (Interní kontrola) podružná, protože vysoké výchozí koncentrace VZV DNA (pozitivní fluorescenní signál FAM) mohou vést k redukovanému až chybjícímu fluorescennímu signálu Interní kontroly (kompetice). 2. Není detekován žádný fluorescenní signál FAM, nýbrž pouze fluorescenní signál VIC (signál Interní kontroly). Ve vzorku není prokazatelná žádná VZV DNA. Lze jej proto považovat za negativní. Pi negativní VZV PCR vyluuje detekovaný signál Interní kontroly možnost inhibice PCR. 3. Není detekován ani fluorescenní signál FAM, ani fluorescenní signál VIC. Není možné uinit diagnostický závr. Pokyny týkající se zdroj chyb a jejich odstranní jsou uvedeny v kapitole 10. ešení problém. Píklady pozitivních a negativních reakcí PCR jsou uvedeny na obrázcích 23/24 (ABI PRISM 7000 SDS), 25/26 (ABI PRISM 7700 SDS) a 27/28 (ABI PRISM 7900HT SDS). VZV PCR Kit 03/2007 37
Obr. 23: Prkaz Kvantifikaních standard (VZV LC/TM QS 1-4) detekcí fluorescenního signálu FAM (ABI PRISM 7000 SDS). NTC: non-template control (negativní kontrola). Obr. 24: Prkaz Interní kontroly (IC) detekcí fluorescenního signálu VIC (ABI PRISM 7000 SDS) pi souasné amplifikaci Kvantifikaních standard (VZV LC/TM QS 1-4). NTC: nontemplate control (negativní kontrola). 38 VZV PCR Kit 03/2007
Obr. 25: Prkaz Kvantifikaních standard (VZV LC/TM QS 1-4) detekcí fluorescenního signálu FAM (ABI PRISM 7700 SDS). NTC: non-template control (negativní kontrola). Obr. 26: Prkaz Interní kontroly (IC) detekcí fluorescenního signálu VIC (ABI PRISM 7700 SDS) pi souasné amplifikaci Kvantifikaních standard (VZV LC/TM QS 1-4). NTC: nontemplate control (negativní kontrola). VZV PCR Kit 03/2007 39
Obr. 27: Prkaz Kvantifikaních standard (VZV LC/TM QS 1-4) detekcí fluorescenního signálu FAM (ABI PRISM 7900HT SDS). NTC: non-template control (negativní kontrola). Obr. 28: Prkaz Interní kontroly (IC) detekcí fluorescenního signálu VIC (ABI PRISM 7900HT SDS) pi souasné amplifikaci Kvantifikaních standard (VZV LC/TM QS 1-4). NTC: nontemplate control (negativní kontrola). 40 VZV PCR Kit 03/2007
10. ešení problém Žádný fluorescenní signál FAM pi pozitivních kontrolách (VZV LC/TM QS 1-4): Volba barviva detektoru pi analýze dat PCR neodpovídá protokolu. K analýze dat zvolte barvivo detektoru FAM pro analytickou VZV PCR a barvivo detektoru VIC pro PCR Interní kontroly. Nastavení uvedená v položce Options k vyhodnocení získaných dat (Extension Phase Data Extraction) se neshodují s nastaveními Data Collection (viz ABI PRISM 7700 SDS, 8.5.2.4 Vytvoení teplotního profilu). Analyzujte bh PCR s opraveným nastavením a zopakujte vyhodnocení (Analysis). Naprogramování teplotního profilu ABI PRISM Sequence Detection Systems je chybné. Porovnejte teplotní profil s údaji protokolu (viz 8.5 Programování ABI PRISM SDS). PCR reakce byla chybn sestavena. Porovnejte Vaše pracovní kroky s pipetovacím schématem (viz 8.4 Píprava PCR) a pop. PCR zopakujte. Podmínky skladování jednoho nebo více komponent soupravy neodpovídají pedpism uvedeným v kapitole 2. Skladování nebo byla pekroena doba použitelnosti soupravy VZV PCR Kit. Prosím zkontrolujte jak podmínky skladování, tak i dobu použitelnosti reagencií (viz štítek soupravy) a použijte pop. novou soupravu. Slabý nebo chybjící signál Interní kontroly (fluorescenní signál VIC) pi souasné nepítomnosti fluorescenního signálu FAM specifické VZV PCR: Podmínky PCR neodpovídají protokolu. Zkontrolujte podmínky PCR (viz výše) a pop. PCR zopakujte s opraveným nastavením. PCR byla inhibována. VZV PCR Kit 03/2007 41
Ujistte se, že používáte námi doporuený postup izolace (viz 8.1 Izolace DNA) a držte se pesn pedpis výrobce. Pesvdte se, že byl pi izolaci DNA ped elucí proveden dodatený doporuený centrifuganí krok k úplnému odstranní zbytk etanolu (viz 8.1 Izolace DNA). Bhem izolace dochází k úbytku DNA. Byla-li k izolaci pidána Interní kontrola, mže nepítomnost signálu Interní kontroly znamenat úbytek DNA bhem izolace. Ujistte se, že používáte námi doporuený postup izolace (viz 8.1 Izolace DNA) a držte se pesn pedpis výrobce. Podmínky skladování jednoho nebo více komponent soupravy neodpovídají pedpism uvedeným v kapitole 2. Skladování nebo byla pekroena doba použitelnosti soupravy VZV PCR Kit. Prosím zkontrolujte jak podmínky skladování, tak i dobu použitelnosti reagencií (viz štítek soupravy) a použijte pop. novou soupravu. Fluorescenní signál FAM analytické PCR pi negativních kontrolách. Bhem pípravy PCR došlo ke kontaminaci. Zopakujte PCR v replikátech s novými reagenciemi. Uzavete jednotlivé PCR zkumavky pokud možno ihned po vložení zkoumaného vzorku. Pipetujte pozitivní kontroly zásadn jako poslední. Ujistte se, že jsou pracovní plochy a pístroje pravideln dekontaminovány. Bhem izolace dochází ke kontaminaci. Zopakujte izolaci a PCR zkoumaných vzork za užití nových reagencií. Ujistte se, že jsou pracovní plochy a pístroje pravideln dekontaminovány. Pokud se vyskytnou další otázky nebo problémy, kontaktujte prosím naší technickou podporu. 42 VZV PCR Kit 03/2007
11. Specifikace 11.1 Analytická senzitivita Pro zjištní analytické senzitivity VZV PCR Kit byla vytvoena ada ední standard od 60 do nomináln 0,019 VZV-ekvivalent kopie /µl. Ta byla následn analyzována za použití VZV PCR Kit s ABI PRISM 7000, 7700 a 7900HT Sequence Detection Systems. Experimenty byly pro každý pístroj provedeny ve tech rzných dnech formou osminásobných urení. Výsledky byly zjištny probitovou analýzou. Jejich grafické vyhodnocení (ABI PRISM 7700 SDS) je zobrazeno na Obr. 29. Limit detekce (p = 0,05) ABI PRISM 7000 SDS 0,4 kopií/µl ABI PRISM 7700 SDS 0,6 kopií/µl ABI PRISM 7900HT SDS 0,3 kopií/µl To znamená, že je s 95 % pravdpodobností detekováno 0,4 kopií/µl (ABI PRISM 7000 SDS), 0,6 kopií/µl (ABI PRISM 7700 SDS) resp. 0,3 kopií/µl (ABI PRISM 7900HT SDS). U zde použitého standardu se jedná o klonovaný PCR produkt, jehož koncentrace byla zjištna spektrální a fluorescenní fotometrií. VZV PCR Kit 03/2007 43
Probitová analýza: Varicella zoster virus (ABI PRISM 7700 SDS) Obr. 29: Analytická senzitivita VZV PCR Kit (ABI PRISM 7700 SDS). 11.2 Specificita Specificita VZV PCR Kit je v první ad zaruena výbrem primer a sond, jakož i volbou písných reakních podmínek. Primery a sondy byly na základ sekvenní analýzy pezkoušeny na eventuální homologie se všemi sekvencemi publikovanými v genových bankách. Tímto zpsobem byla kontrolována také detekovatelnost všech relevantních kmen. Validace specificity byla provedena na 30 rzných VZV negativních vzorcích likvoru, které spolu s VZV specifickými primery a sondami obsaženými v VZV TM Master negenerovaly žádný signál. K urení specificity VZV PCR Kit byla kontrolní skupina uvedená v Tabulce 1 testována na kížovou reaktivitu. Žádný z testovaných pvodc nebyl reaktivní. 44 VZV PCR Kit 03/2007
Tabulka 1: Testování specificity diagnostické soupravy pomocí potenciáln kížov reaktivních pvodc. Kontrolní skupina VZV (FAM) Interní kontrola (VIC) Lidský Herpesvirus 1 (Herpes simplex virus 1) - + Lidský Herpesvirus 2 (Herpes simplex virus 2) - + Lidský Herpesvirus 4 (virus Epsteina a Barrové) - + Lidský Herpesvirus 5 (Cytomegalovirus) - + Lidský Herpesvirus 6A - + Lidský Herpesvirus 6B - + Lidský Herpesvirus 7 - + Lidský Herpesvirus 8 (Kaposi s sarcoma-associated herpesvirus) - + 11.3 Pesnost Údaje o pesnosti pro VZV PCR Kit umožují stanovení celkové variability testovacího systému. Tato celková variabilita se skládá z Intra-Assay variability (variabilita vzork stejné koncentrace v rámci jednoho pokusu), z Inter-Assay variability (variabilita zpsobená provedením experimentu rznými osobami v jedné laboratoi a užitím rzných pístroj stejného typu) a z Inter-Batch variability (variabilita zpsobená použitím rzných šarží). Pitom byla vždy vypoítána standardní odchylka, variance a koeficient variace jak pro specifickou PCR pvodce, tak i pro PCR Interní kontroly. Tyto údaje byly pro VZV PCR Kit stanoveny na základ Kvantifikaního standardu s nejnižší koncentrací (QS 4; 10 kopií/µl). Experimenty byly provedeny formou osminásobných urení. Vyhodnocení výsledk bylo provedeno na základ Ct hodnot amplifikaních kivek (Ct: threshold cycle, viz Tabulka 2) a z toho urených kvantitativních hodnot v kopiích/µl (viz Tabulka 3). Celková variabilita libovolného vzorku uvedené koncentrace iní tedy 0,72 % (Ct) resp. 8,33 % (konc.), pro prkaz Interní kontroly 1,40 % (Ct). Tyto hodnoty se zakládají na souhrnu všech dílích hodnot zjištných variabilit. VZV PCR Kit 03/2007 45
Tabulka 2: Údaje o pesnosti na základ Ct hodnot. Intra-Assay variabilita: VZV LC/TM QS 4 Intra-Assay variabilita: Interní kontrola Inter-Assay variabilita: VZV LC/TM QS 4 Inter-Assay variabilita: Interní kontrola Inter-Batch variabilita: VZV LC/TM QS 4 Inter-Batch variabilita: Interní kontrola Celková variabilita: VZV LC/TM QS 4 Celková variabilita: Interní kontrola Standardní odchylka Variance Koeficient variace [%] 0,13 0,02 0,42 0,08 0,01 0,25 0,13 0,02 0,40 0,20 0,04 0,64 0,30 0,09 0,93 0,61 0,37 1,98 0,23 0,05 0,72 0,43 0,18 1,40 Tabulka 3: Údaje o pesnosti na základ kvantitativních hodnot (v kopiích/µl). Intra-Assay variabilita: VZV LC/TM QS 4 Inter-Assay variabilita: VZV LC/TM QS 4 Inter-Batch variabilita: VZV LC/TM QS 4 Celková variabilita: VZV LC/TM QS 4 Standardní odchylka Variance Koeficient variace [%] 0,95 0,91 9,48 0,70 0,48 6,93 0,96 0,91 9,52 0,84 0,70 8,33 46 VZV PCR Kit 03/2007
11.4 Robustnost Pezkoušení robustnosti slouží k stanovení celkové etnosti chyb VZV PCR Kit. Za tímto úelem bylo 30 VZV negativních vzork likvoru smíseno s 1,8 kopiemi/µl eluního objemu kontrolní VZV DNA (tínásobná koncentrace analytické hranice senzitivity), pomocí QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN) izolováno (viz 8.1 Izolace DNA) a pomocí VZV PCR Kit analyzováno. etnost chyb pro VZV inila u všech vzork 0 %. Robustnost Interní kontroly byla dodaten pezkoušena izolací a analýzou 30 VZV negativních vzork likvoru. Celková etnost chyb inila 0 %. Inhibice nebyly pozorovány. Robustnost VZV PCR Kit iní tedy 99 %. 11.5 Reprodukovatelnost Údaje o reprodukovatelnosti jsou poizovány za úelem pravidelného hodnocení výkonnosti VZV PCR Kit a výkonnostního srovnání s ostatními produkty. Tyto údaje jsou získávány na základ úastí na mezilaboratorních pokusech. 11.6 Diagnostické hodnocení VZV PCR Kit je v souasné dob evaluován ve více studiích. 12. Zvláštní pokyny pro použití produktu Všechny reagencie se smí používat výhradn pro diagnostiku in vitro. Prostedek by mli používat pouze pracovníci, kteí jsou speciáln poueni a vyškoleni v metodice diagnostiky in vitro (EN375). Pesné dodržování protokolu je bezpodmínen nutné k dosažení optimálních výsledk PCR. Dbejte na konec doby použitelnosti uvedený na balení a na štítcích jednotlivých komponent. Nepoužívejte reagencie s prošlou trvanlivostí. VZV PCR Kit 03/2007 47
13. Bezpenostní informace Bezpenostní informace k souprav VZV PCR Kit naleznete v odpovídajících bezpenostních listech (material safety data sheets, MSDS). Tyto listy jsou k dispozici v podob kompaktního a snadno použitelného PDF souboru na www.qiagen.com/support/msds.aspx. 14. Kontrola kvality V souladu se systémem managementu jakosti spolenosti QIAGEN certifikovaným podle norem ISO 9001 a ISO 13485 byla každá šarže VZV PCR Kit testována podle pedem stanovených specifikací, aby byla zaruena jednotná kvalita produktu. 15. Literatura Mackay IM. Real-time PCR in the microbiology laboratory. Clin. Microbiol. Infect. 2004; 10 (3): 190-212. 48 VZV PCR Kit 03/2007
16. Vysvtlení symbol Použitelné do íslo šarže Výrobce Katalogové íslo Teplotní rozmezí íslo materiálu Kvantifikaní standard Interní kontrola VZV PCR Kit 03/2007 49
50 VZV PCR Kit 03/2007
VZV PCR Kit 03/2007 51
Distribuuje spolenost Abbott Laboratories Abbott GmbH Max-Planck-Ring 2 65205 Wiesbaden Nmecko Telefon: +49 6122 58 0 Fax: +49 6122 1244 Celosvtový prodej a podpora Informace o prodejních místech a technické podpoe získáte u Vaší místní poboky Abbott Diagnostics QIAGEN GmbH QIAGEN Strasse 1 40724 Hilden Nmecko!"#$%$&'#!$$#