Korelační spektroskopie jako základ multidimensionální NMR spektroskopie

Korelační spektroskopie jako základ multidimensionální NMR spektroskopie Richard Hrabal Laboratoř NMR spektroskopie, Vysoká škola chemicko-technologická v Praze, Technická 5, 166 28 Praha 6, tel. 220 443 801, e-mail: hrabalr@vscht.cz,

Malé molekuly H 1 H - spektrum H H H H H N H 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 ppm

Velké molekuly 1D 1 H spektrum proteinu kuřecí lysozym, 129 AA, M w = 14.6 kda 1082 různých atomů vodíku» 1082 signálů ve spektru methyl H NH-backbone aromatic H NH-SC aliphatic H CH

Multidimensionální NMR spektroskopie. Proč???? H Zjednodušení NMR spekter expanzí do více dimenzí!!!

Multidimensionální NMR spektroskopie. Proč???? p N (0 p N 1) 13 C 35Hz 13 C 13 130Hz H C H 35Hz 35Hz p C (0 p C 1) 13 55Hz 13 15Hz C C 15 N 11Hz 13 55Hz C 13 C H 7Hz 90Hz H N 140Hz H <1Hz p H (0 p H 1) pravděpodobnost překryvu při zobrazení jednoho jádra p H (H),p N (N) a p C (C) při zobrazení dvou jader (H-N) najednou P = p H. p N při zobrazení tří jader (H-N-C) najednou P = p H. p N. p C

Multidimensionální NMR experimenty 1D 3D 2D F 1 F 2 F 2 F 1 F 3 F 1 4D F 3 F 2 F 4 F 1

Dimensionalita NMR experimentů NMR parametry - chemický posun d - interakční konstanta J - počet signálů ve spektru - integrální intensita I I J Dimensionalita NMR experimentu je běžně určována počtem nezávislých časových domén t i. d

1D Vznik 2D experimentu f ( t) FT S( ) t ω 2D příprava vývoj t 1 směšování akvizice dat t 2 f FT ( t1, t2) S( 1, ) ω 1 ω 2

Klasický způsob snímání multidimensionálních experimentů 3D experiment jedna přímá časová doména převedená na frekvenční doménu F 3 je vytvořená přijímačem NMR spektrometru F 2 ostatní jsou nepřímé domény F 1 a F 2 jsou vytvářené postupnou změnou časových prodlev během experimentu sekvenční způsob F 1 F 3

2D experiment Základní pulsní sekvence COSY experimentu obsahuje pouze dva pulsy oddělené proměnnou časovou periodou t 1 (vývojová perioda): 90 -y 90 x t 1 t 2 Nyní se pokusme analyzovat výsledný signál po aplikaci této pulsní sekvence. t 1 =0 y x 90 -y (t 1 )-90 x y z z x přijímač t 1 >0 y x 90 -y (t 1 )-90 x y x

2D experiment (pokračování) z (t 1 )-90 x y x y z x y x (t 1 )-90 x y x Druhý p / 2 puls působí pouze na komponentu magnetizace v ose y. Komponenta v ose x není nijak ovlivněna. A(t 1 ) = A o * cos( * t 1 )

2D experiment (pokračování) Jestliže zaznamenáme sérii vzniklých spekter jako tzv. stacked plot, dostaneme následující obrázek: A(t 1 ) t 1 t 1 f 2 (t 2 ) Nyní máme frekvenční doménu f 2, (vznikla z časové domény t 2 ) a časovou doménu t 1 (interferogram). Protože amplituda se v t 1 doméně mění také periodicky, dostaneme pseudo FID, jestliže se na tato data podíváme ve směru kolmém k ose t 1. Pro zjednodušení je zanedbána relaxace signálu.

2D experiment ( ) Existuje FID v t 1, takže můžeme provést druhou Fourierovu transformaci v t 1 doméně (první byla provedena v t 2 doméně). Tímto způsobem získáme dvoudimensionální spectrum: f 1 1 Na průsečíku frekvenčních čar získáme tzv. krospík, v tomto případě diagonální. f 2 1 Mnohem přehlednější je tzv. contour plot, kdy jako bychom tyto krospíky sesekli a podívali se na ně shora. f 1 f 2

2D experiment - COSY (reálná data) čas - čas t 1 t 2 čas - frekvence t 1 f 2 frekvence - frekvence f 1 f 2

2D experiment - COSY (reálná data) Contour-plot se záznamem všech krospíků: mimodiagonální krospík f 1 diagonální krospík f 2 Otázka nyní zní Odkud se vzaly všechny ty mimo-diagonální krospíky?

Co je korelační spektroskopie? Základem je korelace NMR parametrů (chemický posun, interakční konstanta ) určitých jader. Korelaci lze realizovat přenosem polarizace (magnetizace, informace) z jednoho jádra (zdroje) na jádro jiné (příjemce) přenos polarizace přímou (dipól-dipólovou) interakcí excitace zdroj H příjemce H detekce C C přenos polarizace nepřímou interakcí

Přenos polarizace s neselektivními pulsy Použijeme-li dva p / 2 pulsy vzájemně fázově posunuté o 90 o a oddělené periodou t 1 = 1 / 2J CH, dosáhneme převrácení vektoru a 90 -y 90 -x t D t D = 1 / 2J CH z t D = 1 / 2J z y x J CH / 2 y x z 90 -x x y

Homonukleární korelace experiment COSY Předpokládejme opět pulsní sekvenci pro COSY 90 -y - t 1-90 -y - t 1 90 -y 90 -y t 1 t 2 t 1 = 0 z z z y x y x y x

t 1 > 0 Homonukleární korelace COSY z x t 1-90 -y x y y Pro t 1 = 0, budeme mít kompletní inverzi spinu I (jedná se o pseudo p puls) a signál S se nezmění. Pro všechny ostatní časy se však intenzita spinu S bude měnit v důsledku rozdílné míry přenosu polarizace z jádra I na jádro S. Tato změna bude periodicky záviset na frekvenci spinu I a velikosti interakční konstanty J IS.. Nejvíce polarizace se přenese nastavíme-li t 1 = 1/2J. x t 1-90 -y x y y A S (t 1,t 2 ) = A I * trig( I * t 1 ) * sin (pj IS * t 1 ) trig( S * t 2 ) * sin (pj IS * t 2 )

2D experiment přenosová funkce A S (t 1,t 2 ) = A I * trig( I * t 1 ) * sin (pj IS * t 1 ) trig( S * t 2 ) * sin (pj IS * t 2 ) intenzita výchozí magnetizace cos nebo sin chemický posun jádra I během vývojové periody t 1 chemický posun jádra S během vývojové periody t 2 Velikost výsledné magnetizace bude záviset na chemickém posunu jádra I během periody t 1,na chemickém posunu jádra S během akvizice, tj. periody t 2 a na velikosti nepřímé spin-spinové interakce mezi oběma jádry. Jinými slovy, výsledná magnetizace ponese informaci o chemickém posunu obou jader a tím pádem povede k vytvoření mimodiagonálního krospíku. množství přenesené magnetizace závisí i na velikosti interakce mezi jádry I a S

dopoledne t 1 přechod J IS přechod J IS odpoledne t 2 stejná barva květů diagonální krospík různá barva květů mimo-diagonální krospík

S I f 1 f 2 I S

2D experiment - COSY (reálná data) f 1 f 2

Heteronukleární korelace - HETCOR Na podobném principu jako COSY funguje experiment, který nám poskytuje konektivitu mezi spiny 1 H a 13 C (obecně X). Nazývá se HETCOR, (HETeronuclear CORrelation spectroscopy.) Pulsní sekvence obsahuje jak pulsy aplikované na 1 H, tak i na 13 C současně. Základní pulsní sekvence vypadá následovně: 90 -y 90 -y 1 H: t 1 90 { 1 H} t 2 13 C:

Heterokorelovaná spektra jsou jednodušší než homokorelovaná!! Proč? Důvodem je možnost kontroly excitace jader (výběru zdroje a cíle) a tím pádem i přenosu magnetizace. V případě homokorelovaných experimentů jsou excitována všechna jádra najednou a tím pádem dochází k oboustrannému přenosu magnetizace. Důsledkem je vyšší počet mimodiagonálních krospíků uspořádaných symetricky podle diagonály (redundantní informace). V případě heterokorelovaných experimentů mají zdroj i cíl jinou rezonanční frekvenci a lze je tím pádem velmi dobře odlišit. Proto dochází k přenosu magnetizace pouze jedním směrem (z jádra intenzivnějšího na jádro méně Intenzivní) a výsledná spektra jsou mnohem jednodušší.

Homonukleární experimenty excitace detekce zdroj příjemce H příjemce zdroj H excitace detekce C C Současně probíhá přenos magnetizace oběma směry!!!!

Heteronukleární experimenty excitace zdroj příjemce H C příjemce zdroj žádná excitace detekce Přenos magnetizace probíhá pouze jedním směrem!!!!

HETCOR ( ) Fourierova transformace v obou doménách nám poskytne 2D korelační spektrum: 13C 13C dekapling J CH 1H 1H f 1 J CH f 1 f 2 f 2 Hlavní rozdíl oproti COSY je v asymetričnosti spektra. Jedna osa nese 1 H frekvence a druhá 13 C frekvence. Problémem je rozštěpení signálu interakční konstantou J CH, což jednak snižuje intenzitu spektra, ale zejména dochází k překryvům různých CH spinových systémů. Z tohoto d;vodu se ruší interakce C-H během obou vývojových period t 1 a t 2.

Zrychlené snímání multidimensionálních experimentů

Klasický způsob snímání multidimensionálních experimentů 3D experiment jedna přímá časová doména převedená na frekvenční doménu F 3 je vytvořená přijímačem NMR spektrometru F 2 ostatní jsou nepřímé domény F 1 a F 2 jsou vytvářené postupnou změnou časových prodlev během experimentu sekvenční způsob F 1 F 3 sekvenční způsob je pomalý!!!!!

Proč jsou nd NMR experimenty tak časově náročné? Nutnost použití více skenů Citlivost 3D Koherentní načítání signálu (I signal n), šum (I noise n/2) Cyklování fází Výběr správných koherencí, potlačení artefaktů 8 1.2 5120 = 40960 s 13 ½ hod Většina 3D experimentů vyžaduje n 2, běžně n = 8. Prodleva mezi skeny 4D Čas pro obnovení definovaného výchozího stavu 8 1.2 327 680 = 3 145 728 s 36,5 dne Typicky 1-1.3 s Vzorkování nepřímých domén 5D Opakování experimentů s proměnnými prodlevami Amplitudová modulace signálu k určení frekvence nepřímo detekovaných jader 8 Opakovaní 1.2 experimentů 13 107 s různou 200 fází některých 1,2 x10 pulsů 8 s 4 roky Rozlišení kladné a záporné frekvence (kvadraturní detekce) 3D NMR experiment s 3240 časovými inkrementy, každý nasnímán 22 kombinacemi fází pulsů kvůli kvadraturní detekci, tj. 324022 = 5120 experimentů, 4D 32x40x32x2x2x2=327 680 experimentů, 5D 32x40x32x32x2x2x2x2x2 =13 107 200 experimentů

Proč snímat NMR experimenty o vyšší dimensionalitě? Přiřazení resonancí v biomolekulách H C β O H C β N C α C N C α H H H H AA i-1 AA i 3D HNCA HN N C αi /C α-1 4D HNCOCA HN N CO-C α-1 5D HNCOCACB HN N CO-C α-1 -C β-1 6D HNCOCANH HN N CO-C α-1 -N i-1 -HN i-1 7D HNCOCANH HN N CO-C α-1 -C β-1 -N i-1 -HN i-1

Zrychlené snímání multidimensionálních NMR experimentů Využití lineární predikce Nelineární vzorkování v nepřímých doménách (V. Orekhov, W. Kozminski) Multidimensionální Hadamardova spektroskopie G-matrix FT NMR spectroscopy, GFT NMR (T. Szyperski) Projection reconstruction PR NMR (E. Kupče, R. Freeman) Single scan multidimensional spectroscopy (L. Frydman)

t 1 [ms] t 1 [ms] Delší vzorkování lepší rozlišení více bodů větší rozlišení delší experimentální čas t 1 max 20 t 1 max 10 t 2 [ms] 100 t 2 [ms] 100 Pro zlepšení rozlišení je třeba více experimentů, čili delší experimentální čas.

Delší vzorkování lepší rozlišení 15 N 15 N 1 H 1000 x 26 komplexních bodů t 1 max = 1,0 ms ( 15 N) 1 H 1000 x 96 komplexních bodů t 1 max = 3,7 ms ( 15 N)

Využití lineární predikce v nepřímé doméně n bodů v nepřímé doméně n n-1 t 1 t 2 2. 1. t 1 n-k bodů v nepřímé doméně n n-1 t 1 k Lineární predikce k 2. 1. 2. 1.

t 1 [ms] t 1 [ms] Využití lineární predikce v nepřímé doméně d k m j1 a j d k j k=m, M-1 t 1 max 20 t 1 max 10 t 2 [ms] 100 100 t 2 [ms]

Využití lineární predikce v nepřímé doméně

t 1 [ms] t 1 [ms] Nelineární vzorkování nepřímých domén - NUS 2D 20 t 1 nepřímá časová doména t 2 přímá časová doména t 1 max 3D t 1 nepřímá časová doména t 2 nepřímá časová doména t 3 přímá časová doména t 1 max t 2 [ms] 100 t 2 [ms] t 2 max Zpracování: - nelineární Fourierova transformace - MFT - multidimensionální rozklad - MDD

Způsob zpracování NUS nelineární Fourierova transformace S( ) f ( t)exp( it) dt f FT1 FT2 FT3 ( t, t, t ) S( t, t, ) S( t,, ) S(,, ) 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 3 3 1 2 1 2 t max t max t max 1 2 3 1 S(,, ) f ( t1, t2, t3)cos( 1, t1)cos(, t2)cos(, t3) w( t1, t2, t3) t 0 t 0 t 0 1 2 3 Kazimiercuk K., Zawadska A., Kozminski W., Zhukov I.: J.Biol.NMR 36, 157-168 (2006)

Způsob zpracování NUS - Multidimensionální rozklad MDD S MDD a F 1... F M 1 F M 3D NUS FID Components 1D shapes (t 1, t 2, ω 3 ) FT(t 3 ) MDD t 1 t 2 t 3 Σ t 1 t 2 ω 3 3D complete spectrum FT(t 1,t 2 ) t 1 ω 1 ω 3 ω 2 t 2 ω 3 3D reconstruction (t 1, t 2, ω 3 ) Jaravine V.A., Zhuravleva A:V., Permi P., Ibraghimov I., Orekhov V.Y..: J.Am.Chem.Soc. 130, 3927 (2009)

Nelineární vzorkování-zisk 3D HNCA experiment, stejná doba snímání dat 1. Delší vzorkování v nepřímých doménách-lepší rozlišení 2. Zkrácení experimentálního času (faktor 4-6)

Rekonstrukce nd spektra z projekcí (Projection Reconstruction PR ) α=45 α=-25 α=90 α=-60 α=0

Rekonstrukce nd spektra z 2D projekcí 5D APSY CBCACONH 15 N 15 N 15 N 1 H 1 H 1 H # Number of dimensions 5 #INAME 1 B #INAME 2 A #INAME 3 O #INAME 4 N #INAME 5 H C β C α CO N HN 1 42.9993 50.3139 172.5675 122.4962 9.0969 2 27.3396 52.8698 172.6124 118.0237 7.4186 3 30.5975 57.0974 177.5137 121.4193 8.2263 4 28.9973 52.4853 171.1283 124.4636 8.7298 5 37.0858 53.0968 174.2979 116.8410 7.7558 6 27.9000 52.3851 173.2651 115.1311 8.2546 7 30.5610 52.6278 175.1953 108.8944 8.4318 8 41.7106 51.1206 172.3650 119.7418 9.1592 9 29.8820 55.1740 172.9720 114.6918 9.2590 10 34.6627 51.4727 171.5110 118.9632 7.2042

Rekonstrukce nd spektra z projekcí (Projection Reconstruction PR ) Klasický sekvenční způsob nasnímání 2D experimentu vyžaduje např. 128 t 1 inkrementů, tj. 128 1D spekter, každý je nasnímán se 16 skeny. Experimentální čas je 128 x 24s, tj. 51 minut. Metoda rekonstrukce 2D spektra z 1D projekcí vystačí s 5-6 1D spektry. Experimentální čas je 6 x 24s, tj cca 2,5 minuty. ω 1 Klasika PR dim počet bodů čas počet bodů čas 2D* 128 51 min 6 2,5 min 3D 128 x 64 55 hod 10 x 128 8,5 hod 4D 128 x 64 x 64 146 dní 20 x 128 17 hod 5D 128 x 64 3 25,5 roku 30 x 128 25,5hod 6D 128 x 64 4 1634 let 40 x 128 34 hod 7D 128 x 64 5 105 tis. let 64 x 128 55 hod ω 2 *2D experiment je snímán jako 1D projekce, zatímco experimenty s vyšší dimensionalitou jako 2D projekce

Nepřímá (inverzní) detekce Jedním z největších problémů v NMR spektroskopii je citlivost!!!! S N ~ N exc 3 2 det B 3 2 o NS 1 2 T T 2 Citlivost se v NMR spektroskopii vyjadřuje jako poměr signálu k šumu S/N. Citlivost je možné zvýšit zejména zvýšením počtu aktivních jader (N) použitívětšího externího magnetického pole B o a zvýšením počtu akumulací (NS). Další z možností jak dosáhnout vyšší citlivosti je vhodné uspořádání experimentu z hlediska excitovaného a detekovaného jádra ( EXC DET ). Můžeme rozlišit tři případy: A. Excitujeme a detekujeme stejné jádro. X excitace manipulace se spiny akvizice dat

Nepřímá (inverzní) detekce (pokračování) B. Excitujeme protony, přeneseme polarizaci a detekujeme X jádro (přímá detekce). 1 H excitace přenos magnetizace X manipulace se spiny akvizice dat Relativní citlivost Zkrácení doby experimentu k dosažení stejného S/N 1 H/ 13 C zvýšení 4x 16x 1 H/ 15 N zvýšení 10x 100x

Nepřímá (inverzní) detekce (pokračování) C. Excitujeme protony, přeneseme polarizaci na X jádro a zpět a detekujeme opět protony (nepřímá detekce). 1 H excitace přenos magnetizace akvizice dat X manipulace se spiny Relativní citlivost Zkrácení doby experimentu k dosažení stejného S/N 1 H/ 13 C = zvýšení 32x 1024x 1 H/ 15 N = zvýšení 292x 85264x

Nepřímá (inverzní) detekce (pokračování) Nepřímá nebo-li inverzní detekce má význam pro zvýšení citlivosti jader s nízkým. 90 180 1 H: 90 90 13 C: 2t t 1 / 2 t 1 / 2 2t { 13 C} Nejjednodušší pulsní sekvencí je HMQC (Heteronuclear Multiple Quantum Coherence). Dalším hojně používaným experimentem je HSQC (Heteronuclear Single Quantum Coherence). Inverzní analogií experimentu korelující 1 H s 13 C přes 2 a 3 vazby je HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Coherence).

Experimenty HMQC nebo HSQC poskytují korelace jader 1 H s X jádry ( 13 C, 15 N) přímo na ně vázanými, jinými slovy, přenos magnetizace se děje přes jednovazebnou interakční konstantu J HX. H H R 1 J HC 1 J HC C C C Ve spektrech se objeví pouze X jádra, která mají přímo vázaný atom 1 H. Nelze využít pro identifikaci kvarterních uhlíků!!! Experiment HMBC naproti tomu koreluje jádra 1 H s jádry X ( 13 C, 15 N) přes dvě nebo tři vazby (interakce dalekého dosahu). H H R 3 J HC 2 J HC C C C Slouží téměř výhradně k identifikaci X jader, které nemají přímo vázaný atom 1 H, např. kvarterních uhlíků. Ve spektru se objeví i interakce ostatních X jader s atomy 1 H vzdálené o dvě/ tři vazby.

Experimenty HMQC versus HMBC HMQC C N HO O C N C C H HMBC

Spin-locking práce při nízkých magnetických polích. Čím vyšší pole, tím lepší rozlišení a citlivost. Toto je hnací síla vývoje čím dál větších magnetů. Avšak existují případy, kdy je výhodnější pracovat naopak při velmi malém externím magnetickém poli B o. Ideální by bylo dosáhnout rozlišení a citlivost vysokého magnetického pole B o a některé ostatní pochody studovat při nižším poli např. přenos polarizace. Pro 2D experiment to znamená provádět přípravnou, vývojovou a akviziční periodu při B o a směšovací periodu při nižším poli. Jak ale zařídit rychlý přechod mezi oběma poli? Technika, která se pro tento účel používá se nazývá spin-locking. Podstata spočívá v odstranění vlivu externího magnetického pole B o a donucení spinů precedovat okolo nového, nižšího magnetického pole.

Spin-locking - princip z z y x 90 B SL (x) y B SL x Abychom odstranili vliv pole B o, sklopíme vektor magnetizace z osy <z> buď do osy <x> nebo <y> pomocí p / 2 pulsu. Je-li magnetizace nyní v rovině <xy>, je nutné ji tam po jistou dobu udržet. Toto je dosaženo tzv. uzamčením spinů v příslušném směru <x> nebo <y> novým magnetickým polem. Spiny potom začnou vykonávat precesní pohyb okolo směru působení nového magnetického pole. Magnetické pole B SL je vytvářeno RF části spektrometru buď jako kontinuální ozařování nebo (moderněji) sérií tzv. kompozitních pulsů, které mají stejný efekt. před SL: o = - B o po SL: SL = - B SL

Spin-locking princip (pokračování) B SL je fluktující magnetické pole aplikované při nebo blízko rezonanční podmínky pro ta která jádra. V rotující soustavě souřadnic je statické a pracujeme pouze s jeho intenzitou. Toto je důvod, proč experimenty využívající spin-locking nazýváme experimenty v rotující soustavě souřadnic. Důvod proč se používají kompozitní pulsy spíše než CW je ve větší spektrální šířce, kterou jsme tímto polem schopni pokrýt. SL Zvětšení spektrální šířky je možné dosáhnout buď větším výkonem RF vysílače (nebezpečí přehřátí vzorku) nebo kompozitními pulsy.

TOCSY Prvním experimentem využívajícím spin-lock je TOCSY (TOtal Correlation SpectroscopY) nebo jinak nazývané HOHAHA (HOmonuclear HArtmann-HAhn experiment). Pracujeme-li při B o, platí pro slabě interagující systémy Dd (Hz) >> J (Hz). Jinými slovy, příspěvek k celkové energii systému pocházející z interakčních konstant je daleko menší než z rozdílu chemických posunů. H = H d + H J + H d >> H J Za podmínek spin-locku (B SL << B o ) se rozdíly v chemických posunech minimalizují (H d pro jednotlivá jádra je srovnatelný). Pro interakční konstanty to však neplatí jejich velikost nezávisí na velikosti externího magnetického pole. Protože dojde k přiblížení energetických hladin jednotlivých spinů, magnetizace může volně přecházet z jednoho na druhý v rámci tzv. interakční sítě.

TOCSY (pokračování) A B C D X Maximum přenosu magnetizace mezi dvojicí spinů, které mají interakční konstantu J Hz je tehdy, nastavíme-li délku spin-locku na hodnotu t m = 1 / 2J. Bude-li t m delší, umožníme přechod magnetizace na další spiny. 90 90 90 t 1 t m vysoké magnetické pole B o nízké magnetické pole B SL vysoké magnetické pole B o Pulsní sekvence 2D TOCSY experimentu obsahuje počáteční p / 2 puls, kterým magnetizaci sklopíme do roviny <xy>, kde dojde k jejímu uzamčení některou ze sekvencí kompozitních pulsů (MLEV, DIPSI ). Tímto umožníme volný tok magnetizace po systému vzájemně interagujících spinů.

TOCSY spektrum versus COSY * A B * C d *