Kvantitativní proteomická analýza. Martin Hubálek

Kvantitativní proteomická analýza Martin Hubálek

Kvantifikace proteinů Většinou pouze relativní srovnání odezvy mezi dvěma experimenty, případně mezi experimentem a standardem Množství proteinu bývá odvozeno z množství jednoho nebo více peptidů z proteinové sekvence Založené na porovnání výšky nebo plochy píku Peptidu(s) m/z (MS úroveň MS1) Fragmentu peptidu m/z (MS/MS úroveň MS2) Důležitý výběr peptidu Proteotypický peptid

Kvantifikace proteinů Bezznačková (Label-free) MS1 MS2 Stabilní Izotopové značení ( stable isotope labelling) 2-DE Cílená SRM Data Independent Analysis (DIA) SWATH LFQ Metabolické SILAC 14 N/ 15 N medium N-term MS1 mtraq Dimethyl MS2 itraq TMT Chemické C-term Esterifikace 16 O/ 18 O inkorporace Aminokyselina Lys (itraq) Cys (ICAT) Trp

Kvantifikační přístupy Mueller, Brusniak et al. 2008

Proteotypický peptid Peptidy, které je možné zaznamenat pomocí LC- MS Štěpitelné použitou proteázou (nejčastěji trypsin) Bez možných variabilních modifikaci (Met, Trp) Správná retence na C18 Ionizace v nanoesi + Peptidy, které jsou specifické pro stanovovaný protein ve směsi s ostatními proteiny Prohledání sekvence proti všem dostupným proteinovým sekvencím

PEPTIDERANK Predikce proteotypických peptidů http://wlab.ethz.ch/peptiderank/#home MKSINILSFLLLSSTLSLVAFARSFTSENPIVLPTTCHDDDNLVLPEVYDQDGNPLRIGERY IINNPLLGAGAVYLYNIGNLQCPNAVLQHMSIPQFLGEGTPVVFVRKSESDYGDVVRVMTVV YIKFFVKTTKLCVDQTVWKVNDEQLVVTGGKVGNENDIFKIMKTDLVTPGGSKYVYKLLHCP SHLGCKNIGGNFKNGYPRLVTVDDDKDFIPFVFIKA

Bezznačkové metody

Selected Reaction Monitoring (SRM) http://www.nature.com/nmeth/journal/v9/n6/images/nmeth.2015-f1.jpg

Selected Reaction Monitoring (SRM) Cílený přístup Výběr prekursoru (Peptide m/z) Q1 Fragmentace v kolizní cele Q2 Sken fragmentu (Peptide fragment m/z) Q3 Quantitation

% % MS APLDNDIGVSEATR (Beta-galaktosidáza) LV100309 Bgal 55 120min Q10-04034 669 (27.277) AM (Cen,4, 80.00, Ar,5000.0,0.00,1.00); Sm (SG, 8x3.00); Sm (SG, 8x3.00) 729.3654 1.53e4 100 729.8720 0 730.3918 736.4456 737.4578 715 720 725 730 735 740 745 m/z MSMS y1 y3 y5 y6 y7 y8 y9 y10 y11 y12 y13 LV100309 R Bgal TA 55 120min ES V G I D N D L P A b2 b4 b6 Q10-04034 194 (27.077) Sm (SG, 8x3.00); Sm (SG, 8x3.00); Cm (194) 100 719.3724 18.6 169.0914 563.2598 183.1405 326.1555 832.4432 1176.5780 1289.6802 833.4423 1290.7043 Přechody: ID Q1 Q3 CE 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z APLDNDIGVSEATRy8 729,4 832,5 42 APLDNDIGVSEATRy12 729,4 1289,6 42 APLDNDIGVSEATRy11 729,4 1176,6 42

In te n s ity, c p s In te n s ity, c p s In te n s ity, c p s In te n s ity, c p s XIC of +MRM (80 pairs): 729,4/1176,6 Da ID: APLDNDIGVSEATR from Sample... Max. 1,8e5 cps. 1,8e5 17,14 1,6e5 1,4e5 729,4 832,5 1,2e5 1,0e5 8,0e4 6,0e4 4,0e4 2,0e4 XIC of +MRM (80 pairs): 729,4/1176,6 Da ID: APLDNDIGVSEATR from Sample... Max. 1,8e5 cps. 0,0 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 Time, min XIC of +MRM (80 pairs): 729,4/832,5 Da ID: APLDNDIGVSEATR from Sample... Max. 1,4e5 cps. 1,8e5 17,14 1,4e5 17,14 1,6e5 1,2e5 1,0e5 729,4 1176,6 1,4e5 8,0e4 1,2e5 6,0e4 4,0e4 1,0e5 2,0e4 8,0e4 0,0 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 Time, min 6,0e4 XIC of +MRM (80 pairs): 729,4/1289,6 Da ID: APLDNDIGVSEATR from Sample... 1,28e5 1,20e5 1,00e5 8,00e4 6,00e4 4,00e4 17,12 Max. 1,3e5 cps. 729,4 1289,6 4,0e4 2,0e4 0,0 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 Time, min 2,00e4 0,00 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 Time, min

Skyline sw pro tvorbu SRM přechodů i vyhodnocení výsledků Selekce nábojového stavu Selekce přechodů Optimalizace kolizní energie Finální metoda

Cycle Time Intensity (cps) Scheduled MRM maximalizace cyklu monitoruje každý MRM přechod jen očekávaném elučním čase redukuje počet překrývajících se přechodů zvyšuje čas měření pro každý přechod zlepšuje analytickou přesnost lepší LLOQ mnoho MRM málo MRM MRM XIC Time (mins)

AQUA Absolutní kvantifikace Stabilně izotopicky značený peptid o stejné sekvenci jakou kvantifikuji

Peak ratio - Light x Heavy PeptideSequence ProteinName ReplicateName Absolute spike RT RatioToStandard AGPESDGQFQFTGIK sp Q9JJW3 USMG5_RAT 150420_RHD50G50 50 fmol 54.54 4.0401 THSDQFLVSFK tr Q6PCU0 Q6PCU0_RAT 150420_RHD50G50 50 fmol 46.96 4.0608 Absolutní koncetrace proteinu USMG5: 50 * 4,0401 = 202 fmol Q6PCU0: 50* 4,0608 = 203 fmol

Full Dynamic Range Proteome Analysis of S. cerevisiae by Targeted Proteomics Figure 1 Cellular Concentrations of the Set of Measured Proteins Protein abundances are derived from Ghaemmaghami et al. (2003). Proteins detected by SRM assays are sorted by abundance to show the even distribution across the whole range of concentration (blue circles). Proteins for which the absolute abundance was measured using isotopically-labeled standards are indicated on top of the graph (open circles). http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2009.05.051

SRM (MRM) peptidů Vysoce selektivní Široký dynamický rozsah

Data Independent Analysis (DIA) MS/MS fragmentace iontů o určité m/z nezávisle na přítomnosti signálu v MS Širokopásmová (broadband) Příklad: MS E Cílená na úzká pásma m/z Příklad: SWATH

SWATH SWATH-MS: Sequential Windowed data independent Acquisition of the Total High-resolution Mass Spectra Selekční okno prekurzoru - kolem 25 mu (x 1mu v SRM) Fragmentace v kolizní cele MS/MS scan pro všechny prekurzory v cele fragmenty ze všech přítomných iontů

SWATH-MS Adapted from Gillet et. al., Molecular & Cellular Proteomics, 2012

Př.: 1 protein 10 peptidů 6 přechodů celkem 60 hodnot pro kvantifikaci a statistické hodnocení 24 měření ve dvou variantách vzorků

Stabilní izotopové značení Stabilní izotopy Těžké (heavy): 13 C, 15 N, 18 O, 2 H Lehké (light): 12 C, 14 N, 16 O, 1 H Zavedení jednoho atomu Trypsinové štěpení v H 2 18 O 15 N značené v buněčné kultuře Zavedení skupiny s několika těžkými izotopy Stable isotope labelling of amino acids in cell culture (SILAC) Isobaric tag for relative and absolute quantitation (itraq) Dimethyl labelling předpoklad Shodné chování v průběhu chromatografie a ionizace odpovídající H/L formy peptidu eluují ve stejný čas obě formy mají stejnou pravděpodobnost ionizace na pozadí danné matrice

Značení stabilními izotopy - SILAC o Stable Isotope Labeling with amino ACids in cell culture (SILAC) o Metoda relativní kvantifikace proteinů ve dvou paralelně kultivovaných buněčných kulturách v médiu s lehkými nebo těžkými AK. o V mediu s těžkými AK se používá např.: Arg, Lys 13 C, 15 N o Kvantifikace MS1, ověření identity v MS2 o Nutné dosáhnout vysoké úrovně inkorporace těžkých AK do buněk o Minimálně 5 buněčných cyklů MS spektrum 2x nabitých iontů při SILAC experimentu 37

SILAC Inkorporace Inkorporace těžkých AK ( 13 C 15 N Arg, Lys) do buněčné kultury H/L ratio = 35 i.e. incorporation level 97 %

SILAC výsledek

SILAC + - Vzorky jsou smíseny na počátku experimentu Vhodné pro složité postupy přípravy vzorku Je možné použít shotgun i cílený přístup Auxotrofie pro Lys, Arg Snadné pouze v buněčných kulturách Metabolická konverze Arg na Pro Limitovaná multiplicita drahé

Dimethyl Labeling Reakce N-termini a ε-amino skupiny Lys s formaldehydem následovanou redukcí kyanoborohydridem sodným Boersema, P. J., et al. Triplex protein quantification based on stable isotope labeling by peptide dimethylation applied to cell and tissue lysates. Proteomics. 8, 2008, pp. 4624 4632.

Dimethyl labelling + - Levné a snadno získatelné reagencie Reakce rychlá V roztoku po štěpení ostatní primarní aminy mohou reagovat s formaldehydem vynechat Tris, Am. Bic, použij TEAB Všechny kroky před smísením kriticky důležité pro kvantifikaci - optimalizace

Izobarická značka pro rel. a abs. kvantifikaci itraq Isobaric Tag for Relative and Absolute Quantitation (itraq) Současná (relativní) kvantifikace až 4 vzorků. Sada 4 izobarických činidel, která se váží na aminoskupinu peptidů (proteinů). V MS mají stejný poměr m/z, v MS/MS poskytují 4 různé ionty. MS/MS MS Isobarická značka 145 Da itraq značky Relativní kvantifikace podle intenzit iontů m/z 114, 115, 116, 117 Možný i oktaplex 39

itraq Poměry jsou odečteny po peptidové fragmentaci MS/MS (MS2): Reporterové ionty a jejich poměry určují rozdíly v kvantitě

TMT značky

MS2 značení + - Levnější než SILAC Reakce rychlá V roztoku po štěpení Stejné chování peptidu v průběhu analýzy až na rozdíl v MSMS spektru ostatní primarní aminy mohou reagovat s formaldehydem vynechat Tris, Am. Bic, použij TEAB Všechny kroky před smísením kriticky důležité pro kvantifikaci -optimalizace Skutečné rozdíly v kvantitě jsou větší než naměřené

Stabilní izotopové značení Metabolické Eg. SILAC Chemické Eg. Dimethyl labeling

naměřená změna log základ 2 Srovnání Label-free kvantifikace a kvantifikace pomocí TMT 10plex 1 2 3 4 5 6 7 8 9 20ug krysích peptidů v 25ul 20 10 5 2,5 1,25 0,625 0,31 0,156 0,078 ug kvasinkových peptidů 25ul 0 2 4 8 16 32 64 128 256 ředění porovnání metod 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 0 2 4 6 8 10 log ředění o základu 2 realita Labellfree MS2 MS3

Druhá dimense Dvoudimensionální elektroforéza + 2DE princip metody První dimense - + + - + - - - - - - ++ + + + + - + + ++ - - - + - - - - pi 3 - - - - + ++ - - - - - + + - - + + - + + - - + - - - + ++ - - pi 10 _ + - + + - - Polyakrylamidový gel - ++ + - + - - +

2DE relativní kvantifikace