PLATELIA TOXO IgA TMB 1 destička - 96 72737 KVALITATIVNÍ DETEKCE IGA PROTI TOXOPLASMA GONDII V LIDSKÉM SÉRU NEBO PLAZME ENZYMOVOU IMUNOANALÝZOU 881129-2014/06 1- POUŽITÍ PLATELIA TM TOXO IgA TMB je in vitro diagnostická souprava ke kvalitativnímu stanovení protilátek IgA proti Toxoplasma gondii (T. gondii) lidskem séru nedo plasme. 2 - KLINICKÝ VÝZNAM T. gondii je prvok, vyvolávající infekci u různých druhů živočichů a ptáků. Toxoplasmóza, častá u lidí a zvířat, je typicky asymptomatická. Výskyt této infekce v populaci, stanovený pomocí sérologických testů, se může lišit v závislosti na zemi původu a věku. Během těhotenství toxoplazmóza působí vážné vrozené abnormality (zejména poškození mozkových funkcí) a občas narození mrtvého dítěte. Průkaz protilátek IgG proti toxoplasmóze u žen před početím poskytuje jistotu ochrany plodu před toxoplasmózou během těhotenství. Predispozice k vážným infekcím toxoplasmózou je obecně u osob postižených syndromem získané imunodeficience (AIDS), nebo s jiným postižením imunity. Tyto infekce nastanou hlavně následkem reaktivace cyst T. gondii, přítomných před infekcí HIV. Specifická diagnóza infekce T. gondii může být komplikovaná a izolace parazita je vzácná. Sérologická konfirmace protilátek proti T. gondii svědčí o kontaktu s parazitem a obecně se uznává jako prostředek k určení imunního stavu a citlivosti vůči infekci. Vyšetření na několik izotypů umožňuje buď určení doby infekce a zvolení vhodné terapie v případě akutní infekce, nebo navrhnout profylaktická doporučení: hygienicko-dietní směrnice u těhotných žen, chemoprofylaxi u populace s postižením imunity. 3 - PRINCIP STANOVENÍ PLATELIA TM Toxo IgA TMB je imunoenzymatická double sandwich metoda na pevné fázi, která zachycuje IgA protilátky na pevnou fázi (jamky mikrotitrační destičky, potažené protilátkami proti lidskému alfa řetězci). Peroxidázou značená monoklonální protilátka specifická vůči T. gondii je proti povrchovému antigenu proteinu PM 30 000, jednoho z hlavních cílů humorální imunitní odpovědi. První krok Negativní, cut-off a pozitivní kontroly a vzorky se naředí na 1/101 (fetální a novorozenecké séra 1/20) a napipetují se do jamek mikrotitrační destičky. Během inkubace po dobu jedné hodiny při 37 C se IgA, přítomný ve vzorku, zachytí na pevné fázi. Po inkubaci se IgG a jiné sérové proteiny odstraní promytím. Druhý krok Do každé jamky se napipetuje roztok obsahující antigen T. gondii (T. gondii Ag, kmen RH) a monoklonální protilátka proti T. gondii, značená křenovou peroxidázou (ACM-POD). Během inkubace po dobu jedné hodiny při 37 C se protilátky IgA proti T. gondii ze vzorku, které byly zachyceny na pevné fázi, navážou na komplex antigenu T. gondii s konjugátem. Nadbytek antigenu T. gondii a konjugátu se odstraní promytím. Třetí krok Přítomnost imunního komplexu (anti IgA na pevné fázi, anti-t. gondii IgA, T. gondii Ag, konjugát anti-t. gondii Ag) se prokáže přidáním roztoku, obsahujícím peroxidázový substrát a chromogen, vyvolávající barevnou reakci. Čtvrtý krok Po půlhodinové inkubaci při laboratorní teplotě (18 30 C) se enzymatická reakce zastaví přidáním 1 N kyseliny sírové. Optická denzita, změřená při 450/620 nm, je úměrná množství IgA proti T. gondii, přítomného ve vzorku. Výskyt protilátek IgA proti T. gondii se stanoví porovnáním optické denzity změřené u vzorku vůči optické denzitě změřené u cut-off kontrolního séra. 1
4 - Složení soupravy Všechny reagencie jsou určeny výhradně pro diagnostické použití in vitro. OZNAČENÍ DRUH REAGENCIE Množství R1 R2 R3 R4a R4b Microplate Concentrated Washing Solution (10x) Negative Control Cut-off control Positive Control Mikrotitrační destička (hotová k použití): 12 stripů po 8 oddělitelných jamkách, potažených protilátkami proti alfa řetězci. Koncentrovaný promývací roztok (10 x): TRIS NaCl pufr (ph 7,4), 1% Tween 20. Konzervační činidlo: 0,01% thimerosal Negativní kontrola: lidské sérum negativní na protilátku proti T. gondii a negativní na HBs Ag a protilátky proti HIV-1 a HIV-2 a protilátky proti HCV. Konzervační činidlo: 0,01% thimeorosal Cut-off kontrola: lidské sérum pozitivní na protilátku IgA proti T. gondii a negativní na HBs Ag a protilátky proti HIV-1 a HIV-2 a protilátky proti HCV. Konzervační činidlo: 0,01% thimerosal. Pozitivní kontrola: lidské sérum pozitivní na protilátku IgA proti T. gondii a negativní na HBs Ag a protilátky proti HIV 1 a HIV 2 a HCV. Konzervační činidlo: 0,01% thimerosal. R6a Antigen Toxoplazmózový antigen (lyofilizovaný), kmen RH. R6b Conjugate (80x) Konjugát: myší monoklonální protilátka proti T. gondii konjugovaná s křenovou peroxidázou. 80 x koncentrovaná. Konzervační činidlo: 0,01% thimerosal. 1 100 ml 1 ml 1 ml 1 ml 4 lahvičky 3 ml 0,4 ml R7 Diluent Ředicí pro vzorky a konjugát (hotový k použití): TRIS-NaCl pufr (ph 7,7 ± 0,15), hovězí albumin, 0,1% Tween 20 a fenolová červeň. Konzervační činidlo: 0,01 thimerosal. 2 lahvičky 80 ml R8 TMB Substrate Buffer TMB substrátový pufr: roztok kyseliny citrónové a octanu sodného (ph 4.0), obsahující 0,015% H 2 O 2 a 4% DMSO. R9 TMB Chromogen CHROMOGEN: 0,25% roztok tetrametylbenzidinu (TMB). R10 Stopping Solution Zastavovací roztok (hotový k použití). 1 N kyselina sírová. 60 ml 5 ml 28 ml 5 - UPOZORNĚNÍ, OCHRANA ZDRAVÍ A BEZPEČNOST PRÁCE Hodnověrnost výsledků závisí na dodržování následujících zásad správné laboratorní praxe: Nepoužívejte reagencie s prošlou exspirační lhůtou. Nemíchejte nebo nekombinujte reagencie z různých výrobních šarží v jednom běhu testu. Poznámka: za předpokladu, že stejné šarže se použijí v daném běhu testu, je možno použít i jiné šarže než ty, které jsou obsaženy v soupravě: promývací roztok (R2, identifikace na štítku: 10 x, modré zbarvení), substrátový pufr (R8, identifikace na štítku: TMB pufr., modré zbarvení), chromogen (R9, identifikace na štítku: TMB roztok., zelené zbarvení) a zastavovací roztok (R10, identifikace na štítku: 1 N, červené zbarvení). Tyto reagencie lze použít i s některými dalšími našimi výrobky. Podrobné informace vám poskytne náš technický servis. Před použitím ponechejte reagencie po dobu 30 minut ustálit při pokojové teplotě. Reagencie pečlivě připravte a vyvarujte se jejich kontaminaci. Test neprovádějte v přítomnosti reaktivních výparů (kyseliny, aldehydy, alkalické látky) nebo v prašném prostředí, které by mohlo změnit enzymatickou aktivitu konjugátu. Používejte laboratorní sklo a pomůcky důkladně umyté a opláchnuté deionizovanou vodou nebo přednostně materiál pro jednorázové použití. Mezi koncem promývacího kroku a před napipetováním další reagencie nenechte mikrotitrační destičku vyschnout. Enzymatická reakce je velmi citlivá na působení kovových iontů. Proto nesmí roztok substrátu a konjugátu přijít do kontaktu s žádnými kovovými prvky. Substrátový roztok (substrátový pufr + chromogen) musí být bezbarvý. Pokud se během několika minut po přípravě roztoku objeví modré zabarvení, je roztok nepoužitelný a musí být nahrazen jiným. Tento roztok musí být připraven v čisté plastové vaničce na jednorázové použití, nebo ve skleněné nádobce, která byla předem umyta 1 N HCl, důkladně opláchnuta destilovanou vodou a vysušena. Roztok uchovávejte ve tmě. 2
Pro každý vzorek použijte novou pipetovací špičku. Promývání mikrotitrační destičky je kritickým krokem testu: dodržujte doporučený počet promývacích cyklů a přesvědčte se, že během promývání jsou všechny jamky zcela naplňovány a poté zcela vyprázdněny. Nesprávné promytí může vést k chybným výsledků. Pro konjugát a substrátový roztok nikdy nepoužívejte stejnou nádobku. Kontrolujte správnou funkci a přesnost pipet a ostatního zařízení. Neměňte pracovní postup. Ochrana zdraví a bezpečnost práce Všechny reagencie obsažené v soupravě jsou určeny výhradně k použití pro diagnostiku in vitro. Při manipulace s reagenciemi a vzorky používejte ochranné rukavice pro jednorázové použití. Nepipetujte ústy. Materiál lidského původu použitý pro přípravu reagencií byl testován a shledán nereaktivním na povrchový antigen hepatitidy B (HBsAg), protilátky proti viru hepatitidy C (HCV) a protilátky proti virům lidské imunodeficience (anti-hiv 1 a anti-hiv 2). Poněvadž žádná metoda nemůže zcela zaručit nepřítomnost infekčních agens, zacházejte s reagenciemi lidského původu a vzorky jako se schopnými přenášet infekční onemocnění. Za potenciálně infekční považujte rovněž veškerý materiál, který přišel do styku s vyšetřovanými vzorky a reagenciemi lidského původu, tj. rovněž promývací roztok. Vyhněte se rozlití vzorků nebo roztoků obsahujících vzorky. Potřísněná místa musí být omyta 10% roztokem chlornanu sodného. Jestliže je kontaminující tekutina kyselina, potřísněná místa musí být nejprve neutralizovány hydrouhličitanem sodným a potom je třeba místo otřít roztokem chlornanu sodného a vysušit savým papírem. Použitý úklidový materiál musí být vyhozen do nádoby pro infekční odpad. Vzorky, reagencie lidského původu a stejně tak kontaminovaný materiál a produkty musí být zlikvidovány po dekontaminaci: - Buď ponořením do roztoku chlornanu sodného o konečné koncentraci 5 % po dobu 30 min., - Nebo autoklávováním při teplotě 121 C po dobu nejméně 2 hod. Autoklávování při teplotě 121 C po dobu nejméně 1 hod. je nejlepší způsob inaktivace virů HIV a HB. UPOZORNĚNÍ: ROZTOKY OBSAHUJÍCÍ CHLORNAN SODNÝ SE NESMÍ AUTOKLÁVOVAT! Při zacházení s chemikáliemi a při jejich odkládání je třeba dodržovat zásady správné laboratorní praxe. Vyvarujte se jakéhokoliv kontaktu kůže a sliznic se substrátovým pufrem, chromogenem a zastavovacím roztokem (riziko toxického působení, podráždění či poleptání). Doporučení týkající nebezpečí a upozornění v souvislosti s některými komponenty v této testovací sadě najdete na piktogramech uvedených na štítcích a v pokynech na konci návodu k použití. Bezpečnostní list je k dispozici na adrese www.bio-rad.com. 6 - VZOREK 1. Doporučený druh vzorků jsou sérum nebo plazma (EDTA, citrát nebo heparin). 2. Při odběru, zpracování a uchovávání krevních vzorků dodržujte následující doporučení: - Při odběru krevních vzorků vždy zachovávejte rutinní bezpečnostní opatření pro odběr krve ze žíly. - Při přípravě séra ponechte vzorky úplně koagulovat před centrifugací. - Zkumavky nechte uzavřené po celou dobu. - Po centrifugaci oddělte sérum nebo plazmu do těsně uzavřené zkumavky. - Jestliže testování bude provedeno během 7 dnů, mohou být vzorky uchovávány při +2 8 C. - Jestliže test nebude ukončen během 7 dnů nebo při posílání vzorků, zmrazte je na 20 C, nebo níže. - Vzorky rozmrazujte pouze 3x. - Zmražené vzorky musí být po rozmražení před testováním důkladně promíchány. - Test se provádí se sérem naředěným 1/101. Jelikož množství IgA, vytvářená v plodu nebo u novorozenců jsou menší než u dospělých, nařeďte tato séra 1/20. 3. U vzorků s obsahem do 90 g/l albuminu, 100 mg/l bilirubinu, lipemických vzorků s obsahem do ekvivalentu 36 g/l trioleinu (glyceridu) a hemolyzovaných vzorků, obsahujících do 10 g/l hemoglobinu, není ovlivněn výsledek. 4. Vzorky nezahřívejte. 7 - PRACOVNÍ POSTUP 7.1 Potřebný materiál, který není součástí dodávky. Mixér Vortex. Spektrofotometr k měření na mikrotitračních destičkách, vybavený filtry 450 nm a 620 nm (*). Vodní lázeň nebo rovnocenný inkubátor mikrotitračních destiček s termostatem nastaveným na teplotu 37 1 C (*). Manuální, poloautomatická či automatická promývačka mikrotitračních destiček (*). Nádoba na nebezpečný odpad. Chlornan sodný a hydrouhličitan sodný. Destilovaná nebo deionizovaná voda. Odměrné válce opatřené stupnicí o objemu 25, 50, 100 a 1000 ml. Ochranné latexové rukavice pro jednorázové použití. 3
Ochranné brýle. Savý papír. Automatické či poloautomatické nastavitelné či fixní pipety či multipipety k měření a pipetování objemů 10 až 1000 l a 1, 2 a 10 ml. Zkumavky pro jednorázové použití. (*) Konzultujte s námi detailní informace o zařízení, doporučeném naším technickým oddělením. 7.2 - Příprava reagencií R1: Sáček odřízněte 0,5 1 cm nad spojem. Nepoužité stripy vraťte ihned zpět do sáčku. Zkontrolujte, zdali je obsažen vysoušecí prostředek. Sáček pečlivě uzavřete a uchovávejte při +2 8 C. R2: Nařeďte v destilované vodě 1/10. Pro ruční promývání připravte 350 ml na jednu destičku o 12 stripech. R3, R4a, R4b: nařeďte 1/101 reagencií R7 (příklad: 10 l R3 + 1,0 ml R7). R6a: rozpusťte lyofilizovaný antigen přidáním 3 ml ředicího roztoku (R7) do jedné lahvičky. Roztok rozpuštěného antigenu musí být naprosto čirý. Jedna lahvička může být použita pro 3 stripy. Upozornění: jestliže se objeví výrazný zákal, nesmí být reagencie použita. V tomto případě reagencii vyměňte. Roztok antigenu by měl být ihned po rozpuštění uložen při 20 C (antigen rozmrazte pouze 1x). V tomto případě může být antigen uchováván 3 měsíce při 20 C. R6b: peroxidázou značená monoklonální protilátka je 80x koncentrovaný roztok. Pro jednu mikrotitrační destičku nařeďte 0,150 ml konjugátu (R6b) ve 12 ml ředícího roztoku (R7). Řádně promíchejte. Naředěný konjugát musí být ihned použit. Pracovní roztok konjugátu: naředěný R6a + naředěný R6b: na jednu mikrotitrační destičku smíchejte 12 ml naředěného konjugátu (naředěný R6b) a 12 ml naředěného antigenu (naředěný R6a) (4 lahvičky). Tyto objemy podělte 12 pro jeden srip. R9: nařeďte 1/11 v R 8, např.: 1 ml R9 + 10 ml R8. 7.3 - Uchovávání otevřených a/nebo naředěných reagencií R1: po otevření sáčku jsou nepoužité stripy stabilní 1 měsíc při ±2 8 C v uzavřeném sáčku. R2: naředěný roztok je stabilní do 2 týdnů při ±2-8 C. Koncentrovaný roztok uchovávaný při ±2-25 C bez mikrobiální kontaminace je stabilní až do data exspirace, uvedeného na nálepce. R6: naředěný roztok je stabilní do 4 hodin při pokojové teplotě (+18 30 C). R9:naředěný roztok je stabilní do 6 hodin ve tmě při pokojové teplotě (+18 30 C). R3, R4a, R4b, R7 a R10: reagencie uchovávané při +2 8 C, jestliže nejsou kontaminovány, jsou stabilní až do exspirační doby, uvedené na štítku (i když již byly otevřeny). 7.4 Pracovní postup Přesně dodržujte pracovní postup. Při každém běhu testu používejte kontroly k validaci výsledků testu. Před použitím ponechte reagencie ustálit při pokojové teplotě (+18 30 C). 1. Zaznamenejte a určete umístění vzorků a identifikační schéma. 2. Nařeďte R2 jak je uvedeno (viz odstavec 7.2). 3. Vyjměte rámeček a stripy (R1) z ochranného sáčku. 4. Stripy jamek mikrotitrační destičky jedenkrát promyjte naředěným R2. Mikrotitrační destičku obraťte dnem vzhůru a opatrně ji oklepejte na savém papíru, aby se odstranila zbylá tekutina. 5. Testované vzorky a kontroly nařeďte v ředícím roztoku R7 v poměru 1/101: 10 l vzorku + 1 ml ředícího roztoku R7. Důkladně promíchejte (vortex). 6. Do jamek napipetujte 200 l naředěných kontrol (R3, R4a, R4b) a vzorků naředěných 1/101 (S1, S2, atd.) následujícím způsobem: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A R3 S5 B R4a S6 C R4a S7 D R4b S8 E S1 S9 F S2 S10 G S3 S11 H S4 S12 7. Mikrotitrační destičku překryjte samolepicí fólií a pevně ji na destičku přimáčkněte, aby těsně přilnula k povrchu. Mikrotitrační destičku inkubujte v termostaticky řízené vodní lázni nebo v inkubátoru pro mikrotitrační destičky při 37 1 C po dobu 1 hod. 5 min. 8. Před koncem inkubační doby připravte potřebné množství roztoku konjugátu R6b a antigenu (R6a). Příprava pracovního roztoku konjugátu je uvedena v odstavci 7.2. 9. Po ukončení první inkubační doby odstraňte samolepicí fólii. Obsah všech jamek odsajte do nádoby pro nebezpečný biologický odpad (která obsahuje chlornan sodný). Mikrotitrační destičku 3x promyjte. Potom ji obraťte dnem vzhůru a opatrně oklepejte na savém papíru, aby se odstranila zbývající tekutina. 4
10. Do všech jamek vždy napipetujte 200 l pracovního roztoku konjugátu (R6a + R6b). Roztok musí být před použitím opatrně protřepán. 11. Mikrotitrační destičku překryjte samolepicí fólií a pevně ji na destičku přimáčkněte, aby těsně přilnula k povrchu. Potom mikrotitrační destičku inkubujte v termostaticky řízené vodní lázni nebo v inkubátoru pro mikrotitrační destičky při 37 1 C po dobu 1 hod. 5 min. 12. Odstraňte samolepicí fólii, obsah všech jamek odsajte a mikrotitrační destičku 4x promyjte jak je popsáno výše. Obraťte mikrotitrační destičku a oklepejte ji na savém papíru, aby se odstranila zbývající tekutina. 13. Připravte substrátový roztok (R8 + R9) (viz odstavec 6.2) a do každé jamky napipetujte vždy 200 l. Rekci nechte vyvíjet ve tmě 30 5 min. při pokojové teplotě (+18-30 C). Během této inkubace nepřekrývejte destičku samolepicí fólií. 14. Do každé jamky přidejte po 100 l zastavovacího roztoku (R10) ve stejném pořadí a stejnou rychlostí jako u substrátového roztoku. 15. Pečlivě otřete dno mikrotitrační destičky. Změřte optickou denzitu pomocí spektrofotometru pro mikrotitrační destičky při 450/620 nm do 30 min. po zastavení reakce (před měřením musí být vždy stripy ponechány ve tmě). 16. U všech výsledků zkontrolujte, zda je shoda mezi měřením spektrofotometru a vizuálním vyhodnocením rozložením vzorků a identifikačním schématem. 8 INTERPRETACE VÝSLEDKŮ 8.1 - Validace testu Používejte všechny kalibrátory pro každý běh testu. Pro platnost testu musí být splněna následující kriteria: Hodnoty O.D.: O.D. R4b 0,500 Poměry: Průměr O.D. R4a / O.D. R3 1,500 O.D. R4b / průměr O.D. R4a 1,500 Jestliže tyto podmínky nejsou splněny, test musí být opakován. 8.2 Výpočet hodnoty cut-off (CO) CO = průměr O.D. R4a 8.3 - Výpočet poměru vzorku Poměr vzorku = OD vzorku / CO (průměr OD R4a). Výsledky mohou být též vyjádřeny výpočtem fixačního indexu. Fixační index vzorku = (O.D. vzorku OD M R4a / (O.D. R4b OD M R4a) x 10 8.4 Interpretace výsledku Poměr Výsledek Reagencie 1,00 Pozitivní Je zapotřebí vyšetření na specifické IgM a kvantitativní vyšetření na anti-t. gondii IgG. Výsledky by měly konfirmovány za 15 25 dní. 0,8 1,00 Neurčitý Obdobné výsledky by měly být konfirmovány za 15 25 dní. Vyšetření IgM a IgG proti T. gondii ve stejném séru. 0,80 Negativní Jestliže je test negativní na specifické IgM, pravděpodobně se nejedná o akutní infekci parazitem. Fixační index umožňuje semikvantitativní interpretaci výsledků ve dvou sérech stejného pacienta. Sérum s fixačním indexem mezi 0 a 2 odpovídá hraničnímu pozitivnímu séru. 8.5 Návod k řešení problémů Nevyhodnotitelné a neopakovatelné reakce jsou často způsobeny : Nedostatečným promytím destičky. Kontaminací negativních vzorků sérem nebo plazmou s vysokým titrem protilátek. Kontaminací substrátového roztoku oxidačními činidly (chlornan sodný, ionty kovů). Kontaminací zastavovacího roztoku. 9 - OMEZENÍ TESTU Diagnóza akutní infekce parazitem může být prokázána pouze na základě kombinace klinických a sérologických údajů. Výsledek z jednoho vzorku séra neposkytuje dostatečný průkaz diagnózy akutní infekce. Pouze kombinace klinických a sérologických údajů (signifikantní zvýšení anti-t. gondii IgG protilátek ve dvou vzorcích séra odebraných v minimálním intervalu 3 týdnů a testovaných ve stejném běhu testu, výskyt anti-t. gondii IgM o signifikantním titru) umožňují diagnózu akutní infekce parazitem. Během těhotenství je nutný průkaz anti-t. gondii IgM, protože IgG se může objevit poněkud později vzhledem k IgM (Platelia TM Toxo IgM TMB). 5
10 ÚČINNOST Následovně uvedená účinnost Platelia TM Toxo IgA TMB byla prokázána na 3 různých místech za použití vzorků z fetů, novorozenců a těhotných žen. Studie specifičnosti a citlivosti byly provedeny se soupravou Platelia TM Toxo IgA (OPD) (72733) za použití klinicky dokumentovaných vzorků se známými serologickými výsledky pro IgG a IgM. Poté byla provedena porovnávací studie mezi Platelia TM Toxo IgA (OPD) (72733) a Platelia TM Toxo IgM TMB (72737). Studie specifičnosti Tato studie byla provedena se 430 vzorky od 405 pacientů mezi nimi bylo 23 vzorků z fetů a 73 vzorků od 50 novorozenců bez biologických nebo klinických příznaků toxoplasmózy, 143 vzorků od pacientů s chronickou infekcí a 191 vzorků od neimunních pacientů. Celková specifičnost u této populace byla 99,8% (429/430). Jeden vzorek od novorozence byl neurčitý na IgA, zatímco byl negativní na IgM. Studie citlivosti Studie byla provedena se 287 vzorky od 118 klinicky známých pacientů. 13 vzorků od 8 fetů, jejichž matky se nakazily toxoplasmózou během těhotenství 187 vzorků pocházelo od 23 novorozenců, jejichž matky byly infikovány během těhotenství (z místa 1) 87 vzorků od pacientů s akutní infekcí (45 z místa 1 a 42 z místa 2) IgA byl prokázán ve 4 případech u 8 fetů ( výskyt IgA ve fetu závisí na datu infekce matky a odběru fetální krve). U novorozenců byl IgA detekován u 15 případů při narození, u 2 případů v uteru a u 6 případů v následujících týdnech po narození. U 87 pacientů s akutní infekcí byl IgA detekován v 69 případech. Porovnávací studie Porovnávací studie byla provedena mezi Platelia TM Toxo IgA (72733) a Platelia TM Toxo IgA TMB (72737) se 252 vzorky od těhotných žen (negativní a pozitivní). Výsledky byly následující: Platelia TM Toxo IgA TMB (72737) Platelia TM Toxo IgA (72733) Negativní Neurčité Pozitivní Celkem Negativní 212 0 0 212 Neurčité 1* 0 0 1 Pozitivní 0 1* 38 39 Celkem 213 1* 38 252 * Po kontrole u obou testů vykázaly 2 vzorky stejné výsledky. Souhlas mezi těmito 2 testy byl 100%. PŘESNOST Opakovatelnost 3 pozitivní a 1 negativní vzorek byly testovány 30x v jenom běhu testu. Vzorek Negativní Pozitivní 1 Pozitivní 2 Pozitivní 3 Poměr Průměr 0,20 1,10 2,47 3,89 SD 0,03 0,04 0,06 0,10 CV% 14,77 3,36 2,30 2,57 Reprodukovatelnost Každý ze 4 vzorků (1 negativní a 3 pozitivní vzorky) byl testován dvojmo, ve dvou bězích denně, po 20 denním období. Vzorek Negativní Pozitivní 1 Pozitivní 2 Pozitivní 3 Poměr Průměr 0,28 1,33 2,50 3,48 SD 0,05 0,12 0,27 0,50 CV% 17,75 8,98 10,61 12,99 6
KŘÍŽOVÁ REAKTIVITA 136 sérologicky pozitivních vzorků (CMV, EBV, HSV, VZV, příušnice, spalničky, zarděnky) a 39 vzorků pozitivních na reumatoidní faktory, autoprotilátky a heterofilní protilátky a stejně tak vzorky od pacientů s myelomem byly testovány soupravou Platelia TM Toxo IgM TMB. Všechny vzorky byly negativní (175/175). 11 LITERATURA 1. ANDERSON S.E. and REMINGTON J.S. : The diagnosis of toxoplasmosis. Southern Med. J. 1975; 68, 1433-1443 2. BELANGER F., DEROUIN F., GRANGEOT-KEROS L., MEYER L. and the HEMOCO and SEROCO Study Groups : Incidence and risk factors of toxoplasmosis in a cohort of Human immunodeficiency virus-infected patients (1988-1995). Clinical Infectious Diseases 1999; 28, 575-581 3. BULLOCK S.L., and WALLS, K.W. : Evaluation of some of the parameters of the enzyme-linked immunospecific assay. J. Inf. Dis. (Suppl.) 136: 2, S279-S285 4. DAFFOS, FORESTIER F., CAPELLA-PAVLOVSKY M., THULLIEZ P., AUFRANT C., VALENTI D. and COX L. : Prenatal management of 746 pregnancies at risk for congenital toxoplasmosis. New Eng. J. Med. 1988; 318, 271-275 5. DECOSTER A., DARCY F., CARON A., VINATIER D., HOUZE DE L AULNOIS D., VITTU G., NIEL G., HEYER F., LECOLIER B., DELCROIX M., MONNIER J.C., DUHAMEL M. and CAPRON A. : Anti-P30 IgA antibodies as prenatal markers of congenital Toxoplasma infection. 1992; 87, 310-315 6. DEROUIN F., LEPORT C., PUEYO S., MORLAT P., LETRILLART B., CHENE G., ECOBICHON J.L., LUFT B., AUBERTIN J., HAFNER R., VILDE J.L., SALAMON R. and ANRS 005/ACTG 154 Trial Group Predictive value of Toxoplasma gondii antibody titres on the occurrence of toxoplasmic encephalitis in HIV-infected patients.aids 1996; 10, 1521-1527 7. DESMONTS G., COUVREUR J., THULLIEZ Ph., SAINT JOIGNY G. and COLIN J. : Sérodiagnostic de la Toxoplasmose, des méthodes simples, pour des questions précises. Le concours médical 1985; 107-03, 227-234 8. DUBEY J.P. and BEATTIE C.P. : Toxoplasmosis of animal and man. CRC Press (1988) 9. JENUM P.A., STRAY-PEDERSEN B., MELBY K.K., KAPPERUD G., WHITELAW A., ESKILD A. and ENG J. : Incidence of Toxoplasma gondii infection in 35 940 pregnant women in Norway and pregnancy outcome for infected women. J. Clin. Microbiol. 1998; 36, 2900-2906 10. JENUM P.A. and STRAY-PEDERSEN B. : Development of specific immunoglobulins G, M, and A following Toxoplasma gondii infection in pregnant women in Norway and pregnancy outcome for infected women. J. Clin. Microbiol. 1998; 36, 2907-2913 11. JENUM P.A., STRAY-PEDERSEN B. and GUNDERSEN A.G. : Improved Diagnosis of primary Toxoplasma gondii infection in early pregnancy by determination of anti-toxoplasma immunoglobulin G avidity. J. Clin. Microbiol. 1997 ; 35, 1972-1977 12. LAPPALAINEN M., KOSKELA P., KOSKINIEMI M., AMMALA P., HILESMAA V., TERAMO K., RAIVIO K.O., REMINGTON J.S., HEDMAN K.: Toxoplasmosis acquired during pregnancy: improved serodiagnosis based on avidity of IgG. J. Infect. Dis. 1993; 41, 155-158 13. LECOLIER B. and PUCHEU : Usefulness of IgG avidity analysis for the diagnosis of toxoplasmosis. Path. Biol. 1993; 42, 2 155-158 14. LEBECH M., JOYNSON D.H.M., SEITZ H.M. THULLIEZ P., GILBERT R.E., DUTTON G.N., OVLISEN B. and PETERSEN E., : Classification system and case definition of Toxoplasma gondii infection in immunocompetent pregnant women and their congenitally infected offspring. Eur. J. Microbiol. Infect. Dis. 1996; 15, 799-805 15. LUFT B.J. and REMINGTON J.S. : Toxoplasmic encephalitis. Clinical Infectious Diseases 1992; 15, 211-222 16. NAESSENS A., HEUNINCKX W., FOULON W. and LAUWERS S. : Evaluation of seven commercially available enzyme immunoassays for immunoglobulin G and M antibody detection of Toxoplasma gondii. Immunol. Infect. Dis. 1993; 3, 258-262 17. PETITHORY J.C., REITER-OWONA I., BERTHELOT F., MILGRAM M., DE LOYE J. and PETERSEN E. : Performance of European laboratories testing serum samples for Toxoplasma gondii. Eur. J. Microbiol. Infect. Dis. 1996; 15, 45-49 18. REMINGTON J.S. and DESMONTS G. : Toxoplasmosis in infectious disease of the fetus and newborn infant. JS Remington and JO Klein, eds. WB Saunders Co., Philadelphia 1976; 191-332 19. SABIN A.B., and FELDMAN H.A. : Dyes as microchemical indicators of a new immunity phenomenon affecting a protozoan parasite (Toxoplasma), Science 1948; 108: 660 663 20. SANTORO F., AFCHAIN D., PIERCE J.R., CESBRON J.Y., OVLAQUE G. and CAPRON A. : Serodiagnosis of Toxoplasma infection using a purified parasite protein P30. Clin. Exp. Immunol. 1985; 62, 262-269 21. SHARMA S.D., MULLENAX J., ARAUJO F.G., ERLICH H.A. and REMINGTON J.S. : Western Blot analysis of the antigens of Toxoplasma gondii recognized by human IgM and IgG antibodies. J. Immunol. 1983; 131: 977-983 22. SULHANIAN A., NUGUES C., GARIN J.F., PELLOUX H., LONGUET P., SLIZEWICZ B. and DEROUIN F.: Serodiagnosis of toxoplasmosis in patients with acquired or reactivating toxoplasmosis and analysis of the specific IgA antibody response by ELISA, agglutination and immunoblotting. Immunol. Infect. Dis. 1993; 3, 63-69 23. SULZER A.J. and HALL EC. : Indirect fluorescent antibody tests for parasitic diseases : IV Statistical study of variation in the indirect fluorescent antibody (IFA) test for toxoplasmosis. Amer. J. Epidemiol. 1967; 86: 401-407 24. WILSON M., REMINGTON J.S., CLAVET C., VARNEY G., PRESS C., WARE D. and the FDA TOXOPLASMOSIS AD HOC WORKING group : Evaluation of six commercial kits for detection of human immunoglobulin M. antibodies to Toxoplasma gondii. J. Clin. Microbiol. 1997; 35, 3112-3115 25. WONG S.Y. and REMINGTON J.S. : Biology of Toxoplasma gondii. AIDS 1993; 7, 299-316 7
SHRNUTÍ PRACOVNÍHO POSTUPU 1. Termostat inkubátoru nastavte na teplotu 37 1 C. 2. Nařeďte chromogen R9 substrátovým pufrem R8 v poměru 1/11 (substrátový roztok). 3. Nařeďte 10x koncentrovaný promývací roztok R2 destilovanou vodou (R2d) v poměru 1/10. 4. Všechny jamky 1x promyjte naředěným promývacím roztokem (R2d). 5. Kontroly a vzorky nařeďte v R7 v poměru 1/101. 6. Podle následujícího schématu napipetujte do jamek 200 l naředěných kontrol a vzorků: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A R3 S5 B R4a S6 C R4a S7 D R4b S8 E S1 S9 F S2 S10 G S3 S11 H S4 S12 7. Inkubujte 1 hodinu při 37 C. 8. Připravte nezbytné množství pracovního roztoku konjugátu (R6a + R6b). 9. Odsajte obsah jamek a 3x promyjte naředěným promývacím roztokem (R2d). 10. Do všech jamek napipetujte vždy 200 l pracovního roztoku konjugátu. 11. Inkubujte 1 hodinu při 37 C. 12. Odsajte obsah jamek a 4x promyjte naředěným promývacím roztokem (R2d). 13. Do všech jamek přidejte vždy 200 l substrátového roztoku (R8 + R9). 14. Inkubujte 30 minut při pokojové teplotě (+18 30 C) ve tmě. 15. Do všech jamek přidejte vždy 100 l zastavovacího roztoku (R10). 16. Změřte absorbance na spektrofotometru při vlnové délce 450/620 nm. 8
9
Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincare 92430 Marnes-la-Coquette - France Tel. : +33 (0) 1 47 95 60 00 2014/06 Fax : +33 (0) 1 47 41 91 33 881129 www.bio-rad.com 10