Informace o produktu

Médium MarrowGrtDw CE Informace o produktu Médium MarrowGrow MGM-100 100 ml UPOZORNENí: Pri práci dodržujte zásady práce s biohazardním materiálem CytoGen GmbH, produktová informace verze 1.2 www.cyto!jen.info PentaGen s.r.o. tel. 606 787606 www.pentagen.cz Str. 1 z 8

MarrowGrow Medium Návod k použití Katal. C. MGM-100 (100 ml zmraženého roztoku) Popis produktu Médium MarrowGrow je urceno pro použití v in vitro diagnostice a bylo vyvinuto pro kultivaci bunek kostní drene a leukemických krevních bunek, které mohou být následne použity pri karyotypizaci, fluorescencní in situ hybridizaci (FISH) a dalších cytogenetických metodách. Médium MarrowGrow muže být použito jako nespecifické médium pro kultivaci ruzných hematopoetických bunek (myeloidní a Iymfoidní linie) prítomných v kostní dreni nebo leukemických krevních vzorku. Médium MarrowGrow muže být také použito spolu s migogenem specifickým pro B nebo T lymfocy':y, kde jsou tyto specifické linie vyšetrovány (viz podrobneji v oddíle Protokol). Médium MarrowGrow je dodáváno zmražené a kompletní, pri~'ravené k použití ve 100 ml lahvickách. Jeho základem je alpha-mem a obsahuje antibiotika, L-glutamin, zárodecné hovezí sérum (FBS), hormony a rustové faktory. Médium MarrowGrow je pufrováno bikarbonátem sodným a jako ph indikátor je použitél fenolová cerven. Kompletnost média snižuje možnost technické chyby a kontaminace kultury. Navíc toto médium podporuje pevnejší prisednutí bunek a bunecný rjst, címž je umožnená casná analýza chromozomu. Skladování Zmražené: Skladujte pri -20 C a v temnu až do konce exsplracní doby uvedené na nálepce. Chlazené: Uchovávejte pri 4 C až 2 týdny. CytoGen GmbH, produktová informace verze 1.2 www.cytonen.info PentaGen s.r.o. tel. 606 787 606 www.pentagen.cz Str. 2 z 8

Návod k použití Médium MarrowGrow je kompletní médium, dodávané zmraž né a sterilní. Filtrování média není potrebné. Úspešnot kultivace závisí na použití vhodných aseptických technik. Následující doporucení vám mužou být pri používání lv1arrowgrow užitecné. Rozmražení média MarrowGrow rozmražujte pred použitím ve vodní lázni s teplotou 37 C za obcasného míchání. Alternativne mužete rozmrazit médium v CO2 inkubé:toru pri 37 C s povoleným víckem, aby se umožnila normalizace ph. Teplé médium se správným ph je pro zahájení kultivace optimální. Kontrola ph MarrowGrow je dodáváno s optimálním ph 6,9-7,1, nekdy se ale muže ph lišit: MarrowGrow obsahuje ph indikátor fenolovou cerven: Ružová znamená vysoké ph. Fenolová cerven se mení na ružovou pri ph 7,4. Ružové médium (príliš alkalické) lze napravit pootevrer.ím vícka (asi o ~ otácky) a inkubací lahvick v 5% CO2 asi 1 hodinu. Médium zustane sterilní a samovolne upraví svoje ph na správnou hodnotu. Žlutá znamená nízké ph. Fenolová cerven se zmení na žlutou pri ph 6,7. Žluté médium (príliš kyselé) lze napravit stejným zpusobem, jako ružové médium. Alternativne lze lahvicku s médiem nebo kultivacní nádobku nasytit plynným 5% CO2 v laminárním boxu, dokud se nedosáhne cerve~nébarvy. Barvu lze v prípade potreby porovnat s lahvickou cerstvého rozmraženého média. Antibiotika MarrowGrow obsahuje gentamycin, který je méne inhibující pr::>rust bunek ve srovnání s penicilinem a streptomycinem. CytoGen GmbH, produktová informace verze 1.2 www.cytoqen.info PentaGen s.r.o. tel. 606 787 606 www.pentagen.cz Str. 3 z 8

Stabilita MarrowGrow je ve zmraženém stavu stabilní až do datel expirace vyznaceného na štítku. Nepoužívejte po vyznaceném datu exspirace. MarrowGrow mužete používat až 2 týdny po rozmražení, pokud ho uchováte pri 4 C, následne ale glutamin degraduje. Mužete ho doplnit (ale pouze jednou) L-glutaminem až do 2,0 mm (1/100 objemu 20C mm glutaminového zásobního roztoku). Vyvarujte se opakovaného zahrívání a chlazení, stejne jako expozici svetlu. Test kvality MarrowGrow je testováno na ph, osmolaritu, a kontaminace bakteriální, mykoplazmatickou i plísnovou. Vedle techto standardních specifikací je každá výrobní šarže testována na bunecný rust prední evropskou cytogenetickou laboratorí a kvalita produktu je porovnána s referencním standardem. Certifikát kvality vám na požádání zašleme. Upozornení Kontaktujte prímo Sales & Marketing Department výrobce CytoGen GmbH pro jakékoli pochybnosti o kvalite média. Nepoužívejte médium, jestliže je Obal jakkoli porušen. Médium kalné, nebo obsahuje viditelný precipitát. Pokud obdržíte produkt rozmražený. nebo cástecne rozmražel}ý, okamžite ho zamražte na -20 C a kontaktujte distributora. Limitace Každá laborator si musí médium sama otestovat ve vlastním ~,rovozu a v návaznosti na vlastní zavedené postupy pred zaclenením do systému in vitro diagnostiky. Príspevkem firmy CytoGen je pouze kultivace bunek, respektive dodávka kvalitního média. CytoGen nemuže zodpovídat za výsledky testu, které ~;epo kultivaci následne provádejí. CytoGen GmbH, produktová informace verze 1.2 www.cyto!jen.info PentaGen s.r.o. tel. 606 787606 www.pentagen.cz Str. 4 z 8

Kultivacní protokoly Výber metody (podle Rooney D.E. aj.) K dispozici je nekolik metod a výber té nejvhodnejší závisí na odzkoušených podmínkách a v následující tabulce nabízíme doporucené pm;tupy: PHA Diagnóza ONC, Minimální 24h, S 3d +/- kultury Vzorek S PHA LN/BM PB/BM BM/PB PMA S 3d 24h,48h D,48h Poznámka S, 72h 5d 24h,48h 48h, +/- ONC PMA 3d APL - akutní promyelotická leukémie, MPD - myoloproliferativní onemocnení, PB periferní krev, BM - kostní dren, LN - lymfatické uzliny, ONC -- expozice colcemidu pres noc, S - synchronizovaná kultura, PHA - fytohemaglutini'l, PMA - 4-forboI12 myristát 13-acetát Následující protokol je návodem k provádení kultivací bunek k'jstní drene s použitím MarrowGrow. Muže být použit dle uvážení zákazníka k náhrace bud cásti nebo celého kultivacního protokolu. Vetšina cytogenetických laboratorí má vlastní protokoly a MarrowGrow muže být ve vetšine prípadu použito 1/ rámci techto protokolu. Nejbežnejší kultivacní metody používají "otevrený" systém. CytoGen GmbH, produktová informace verze 1.2 WWW.cytO!1en.info PentaGen s.r.o. tel. 606 787606 www.pentagen.cz Str. 5 z 8

Velmi duležité upozornení: Definice "otevreného" systému: kultury pestované v Petriho miskách s mírne zdviženým víckem nebo v lahvickách s povoleným víckem v 5<},0 CO2 atmosfére (C02 inkubátor), kde je umožnena ventilace plynu. Definice "uzavreného" systému: kultury rostoucí ve standardním suchém inkubátoru v hermeticky uzavrených nádobách. Doporucení pro použití "otevreného" systému Reagencie MarrowGrow kompletní médium Roztok colcemidu (10!Jg/ml) Roztok hypochloritu sodného NaCIO (2,5%) Protokol pro zakládání kultur a kultivaci bunek kostní drene1 1. Když obdržíte vzorek kostní drene v transportním médiu nebo od pacienta na chemoterapii, centrifugujte 10 minut pri 150-170 g. Pro kostní dren dodanou v heparinu jdete prímo na krok 3. 2. Odstrante supernatant vcetne veškerého tuku a necistot plovoucích na povrchu vzorku. Postupujte opatrne, at nepoškodíte pelet.2 3. Pridejte 5 ml MarrowGrow média do každé zkumavce ve stojánku. 4. Zaockujte príslušným množstvím kostní drene s využitím sterilní Pasteurovy pipety (v závislosti na koncentraci bl:nek). Konecná koncentrace bunek v kulture by mela být 106/ml. 5. Upravte kultury podle predbežné diagnózy: a) Prímé kultury: pridejte 100!JI roztoku colcemidu na 1-2 hodiny. b) Krátkodobé kultury: inkubujte pres noc. Následující ráno pridejte 100!JI roztoku colcemidu na 1-2 hodiny. c) Expozice colcemidu pres noc: pridejte 50!JI roztoku colcemidu co nejpozdeji odpoledne. Inkubujte pres noc pri 37 C. 1 Provedte všechny kroky v biohazardním boxu trídy II, používejte sterilní ~ipety, pokud není receno jinak. Nefixovaný materiál shromaždujte v nádobce s hypochloritem sodným. Používejte pipety a špicky s príslušným objemem. 2 Pokud má vzorek velký pocet bílých krvinek, pelet muže být velmi snadno poškozen. Postupujte v tomto kroku velice opatrne. CytoGen GmbH, produktová informace verze 1.2 www.cytoqen.info PentaGen s.r.o. tel. 606787606 www.pentagen.cz Str. 6 z 8

d) Krátkodobá kultura + expozice colcemidu pres noc: inkubujte pri 37 C 24, 48 nebo 72 hodin. Potom jako v kroku 5c. e) Kultury se stimulovanými Iymfocyty B: pridejte 100!JI PMA a/nebo PWM a inkubujte 2-4 dny pi'i 37 C. Pridejte 100!JI roztoku colcemidu a inkubujte pres noc pri 37 C. f) Kultury se stimulovanými Iymfocyty T: pridejte 100!JI PHA a inkubujte 72 hodin pri 37 C. Pridl~jte 100!JIcolcemidu na 1-2 hodiny. Protokol pro sklizen bunek kostní drene 1. Bunky jsou následne centrifugovány 5 minut pri 1500 ol.lmin. 2. Odstrante supernatant. 3. Resuspendujte pelet. 4. Pridejte 6 ml predehrátého KCI a inkubujte zkumavky pi'i 37 C. 5. Centrifugujte zkumavky pri 1500 otáckách 5 minut. 6. Odstrante supernatant. 7. Pridejte do zkumavky 5 ml fixativa (3 díly methanolu, 1 díl kyseliny octové). Pomalu pridávejte za stálého jemného míchání vždy nekolik kapek fixativa. Pridávejte fixativum, dokud se všechny shluky bunek nerozdelí a bunecná suspenze je maximálne homogenní. 8. Centrifugujte pri 1500 otáckách 5 minut. 9. Opakujte kroky 9-10 dvakrát. 10. Po posledním promytí odstrante supernatant co nejblíže k peletu bez jeho poškození. Následne pelet rozpustte v príslušném mno.~ství fixativa pro vytvorení mikroskopického preparátu. CytoGen GmbH, produktová informace verze 1.2 www.cytonen.info PentaGen s.r.o. tel. 606 787 606 www.pentagen.cz Str. 7 z 8

Doporucení pro uzavrený systém MarrowGrow lze využít pro kultivaci bunek v "uzavreném" systému, pokud je ph ve fyziologické oblasti (ph je mezi 6,9 a 7,4). Uzavrené systémy závisejí na vnitrní pufrovací kapacite média bez výhody vyplývající z rovnováhy mezi uhlicitany v médiu a 5% CO2 prítomnému v otevreném systému inkubátoru. Uzavrené systémy fungují nejlépe pri kultivacích s nízkou koncentrací bunek, jelikož vyšší koncentrace produkuje kyselé metabolity, které mužou okyselit médium nad jeho fyziologickou pufrovací kapacitu. Udržování ph muže být dosaženo v uzavreném systému jednou z následujících 3 metod: 1. Metoda 1: Pridejte k MarrowGrow 2% (v/v) sterilního zásobního roztoku 1,0 M HEPES. Sterilní 1,0 M HEPES muže být opraveno na ph 7,0 pri 20 C pridáním 1,0 M NaOH. Upravené médium HEPES je následne smícháno s bunkami a inkubováno pri 37 C v uzavrených kultivacních bankách. 2. Metoda 2: Predinkubujte kultivacní banky s MarrowGrow a bunkami v 5% CO2 inkubátoru 1 hodinu pred uzavrením vícka a kultivací pr: 37 C. 3. Metoda 3: Probublejte jednotlivé kultivacní banky obsahující MarrowGrow a bunky smesí 5% CO2-95% vzduchu sterilní pipetou 20 s. Poté uzavrete vícko a kultivujte v uzavreném systému pri 37 C. Nejlépe je pripojit ke zdroji CO2 sterilní zazátkovanou Pasteurovu pipetu, címž se zajistí sterilita vstupujícího plynu. Bibliografie: Rooney D.E. a Czepulkowshi B.H. Human Chromosome Preparation. (1997). Výrobce: CytoGen GmbH, Bienenweg 28, 0-35764 Sinn, Némecko Distributor pro Ceskou republiku: PentaGen s.r.o., www.pl~ntagen.cz CytoGen GmbH, produktová informace verze 1.2 www.cytonen.info PentaGen S.LO. tel. 606 787606 www.pentagen.cz Str. 8 z 8