Cvičení
Určení molekulové hmotnosti: ESI a nanoesi ) 1)( ( ) ( H m z H m z M k j j j m z z zh M Molekula o hmotnosti M se nabije z-krát protonem, pík iontu ve spektru je na m z : ) ( H m z M z Pro dva sousední píky ve spektru (j,k) platí: j k k j m m H m z j k j k m m H m z vzorce pro výpočet nábojového stavu dvou sousedních iontů ve spektru = určení nábojového stavu (z) u některého iontu z lze určit z izotopického klastru ze vzdálenosti sousedních píků tj. 2
Interpretace MSMS spekter peptidů
Přehled aminokyselin v číslech AK Mono. Immoniové ionty Gly G 57.0215 30 Ala A 71.0371 44 Ser S 87.0320 60 Pro P 97.0528 70 Val V 99.0684 72 Thr T 101.0477 74 Cys C 103.0091 76 Leu L 113.0840 86(72) Ile I 113.0840 86(72) Asn N 114.0429 87(70) Asp D 115.0269 88 Gln Q 128.0586 101 (84,129) Lys K 128.0910 101 (129, 112, 84, 70) Glu E 129.0426 102 Met M 131.0405 104 (61) His H 137.0589 110 (166,138,123,121,82) Phe F 147.0684 120 (91) Arg R 156.1011 129 (112, 100, 87, 73, 70, 59) Tyr Y 163.0633 136 (107, 91) Trp W 186.0793 159 (171, 170, 130, 117)
Jak spočítat hmotnost iontu? MW Σ(AK zbytek) + 18 b-ionty 1+b1+b2+b3+b4+ y-ionty 1+18+y1+y2+y3+y4+ A-ionty b-28 (CO) Immoniové ionty AK zbytek - 27
Cvičení I T F W Y N I L G E D K Určete MW, [M+H] +, [M+2H] 2+, [M+3H] 3+ Ionty: b5, y7
TFWYNILGEDK Monoisotopic (M) 1384.66636 (M+H) + 1385.67363 (M+2H) 2+ 693.34048 (M+3H) 3+ 462.56276 (M+4H) 4+ 347.17390 Seq # B Y # T 1 102.055 1385.674 11 F 2 249.1234 1284.626 10 W 3 435.2027 1137.558 9 Y 4 598.2661 951.4782 8 N 5 712.309 788.4149 7 I 6 825.393 674.372 6 L 7 938.4771 561.2879 5 G 8 995.4986 448.2039 4 E 9 1124.541 391.1824 3 D 10 1239.568 262.1398 2 K 11 1367.663 147.1129 1 http://db.systemsbiology.net:8080/proteomicstoolkit/index.html http://db.systemsbiology.net:8080/proteomicstoolkit/fragionservlet.html
Cvičení II Určete MW peptidu, který nese současně následující modifikace Pyroglutamát na N-konci Amidace C-konce Fosforylace T4 Acylace C10 Disulfid C5-C7 Esterifikace MeOH Q D F T C I C Y I C N D K Dále spočítejte hodnoty m/z těchto fragmentů: a8, b4, y4
De novo sekvenování QTOF DDA experiment, CID fragmentace Určete sekvenci peptidu
Pravidla pro čtení peptidové sekvence Zjisti nábojový stav a spočítej M peptidu Zjisti jaká AK bude C- nebo N-koncová na základě štěpení a diagnostických markerů Tryptický štěp na C-konci R nebo K diagnostický y1 ion 175 pro R, 147 pro K Začni de novo od velkých m/z hodnot Zjisti pořadí AK dle rozdílu mezi fragmentačními ionty sekvenční Tag Dopočítej komplementární ionty, použij: y + b 1= [M+H] + y = (M+H) 1+ - b +1 b = (M+H) 1+ - y +1 Hledej komplementátrní ionty ve spektru, pozor na chybné kombinace sérií Hledej a- / b-iontové páry (rozdíl 28) Ztráta vody a amoniaku y a b ionty fragmentů obsahujících R, K, Q, N mohou ztrácet amoniak -17 y a b ionty fragmentů obsahujících S, T, E mohou ztrácet vodu -18. E (Glu) musí být na N-konci fragmentu Přítomnost immonioých iontů napovídá přítomnosti aminokyseliny v sekvenci (ale nemusí se nutně objevit) Nehledej b1 fragment, najdeš ho zřídka. Díky tomu je obtížnější určit pořadí prvních dvou aminokyselin na N-konci. Oblast o 60 m/z pod hodnotou m mateřského iontu může obsahovat ionty ztrácející vodu a amoniak. Opatrně na G, může být první v sekvenci Fragmenty mohou být vícenásobně nabité - zjisti dle isotopické obálky
Isobarické hmoty Leucine vs. Isoleucine isobarické. Nerozlišitelné v nízkoenergetických srážkách Lysine vs Glutamine si jsou blízké hmotností - 128.09496 a 128.05858 (Rozdíl - 0.03638 ) High res MS přístroj nutný (Q-TOF, orbitrap, ICR) Řešení - Acetylace Lys posune hmotnost peptidu a příslušných fragmentů o 42u Dipeptidy vs samotné aminokyseliny 114 (GG=N), 128(AG=Q,K), 156 (VG=R), 186 (EG, AD, SV=W) http://www.ionsource.com/tutorial/denovo/denovo_tables.htm http://www.ionsource.com/tutorial/denovo/denovotoc.htm
Specifická fragmentace Zvýšená fragmentace v místě AK Histidine, Proline, kys. asparagová, kys. glutamová Výsledek nekompletní b-, y- série komplikace pro manuální nebo automatickou interpretaci
Vliv prolinu na MSMS spektrum Selektivní štěpení na N-konci Pro Vysoké intenzity y- a b- iontů z místa štěpení na C-konci ke štěpení nedochází P preferované místo pro zachycení náboje Jednosměrná fragmetnace Interní fragmenty s Pro na N-konci PROLINOVÉ Hyperštěpení
Vliv Histidinu na MSMS spektrum Zvýšení štěpení na obou koncích H Protonace postranního řetězce His + Arg, 1+ - NE His + Arg, 2+ - ANO His bez Arg - ANO His - preferované místo pro zachycení náboje Dvousměrné štěpení Interní fragmenty
Vliv Asp/Glu na MSMS spektrum Interakce mezi postraními řetězci Asp/Glu a Arg Specifické štěpení na C-konci Asp/Glu - y- ionty Počet Arg v sekvenci = počet přidaných protonů Lys nemá tento efekt