MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA BAKALÁŘSKÁ PRÁCE

MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA BAKALÁŘSKÁ PRÁCE BRNO 2018 MARIE KOŠKOVÁ

Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav morfologie, fyziologie a genetiky zvířat Genetická determinace výskytu skvrnitosti u psů Bakalářská práce Vedoucí práce: doc. Ing. Tomáš Urban, Ph.D. Vypracovala: Marie Košková Brno 2018

ZADÁNÍ BAKALÁŘSKÉ PRÁCE

PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem práci: Genetická determinace výskytu skvrnitosti u psů vypracoval/a samostatně a veškeré použité prameny a informace uvádím v seznamu použité literatury. Souhlasím, aby moje práce byla zveřejněna v souladu s 47b zákona č. 111/1998 Sb., o vysokých školách a o změně a doplnění dalších zákonů (zákon o vysokých školách), ve znění pozdějších předpisů, a v souladu s platnou Směrnicí o zveřejňování vysokoškolských závěrečných prací. Jsem si vědom/a, že se na moji práci vztahuje zákon č. 121/2000 Sb., autorský zákon, a že Mendelova univerzita v Brně má právo na uzavření licenční smlouvy a užití této práce jako školního díla podle 60 odst. 1 autorského zákona. Dále se zavazuji, že před sepsáním licenční smlouvy o využití díla jinou osobou (subjektem) si vyžádám písemné stanovisko univerzity, že předmětná licenční smlouva není v rozporu s oprávněnými zájmy univerzity, a zavazuji se uhradit případný příspěvek na úhradu nákladů spojených se vznikem díla, a to až do jejich skutečné výše. V Brně dne:.. podpis

PODĚKOVÁNÍ Ráda bych poděkovala prof. Ing. Tomáši Urbanovi, Ph.D. za vedení při zpracování práce, ochotu pomoci a poradit. Děkuji své rodině a přátelům za podporu během celého studia.

ABSTRAKT Vzniku dnešních psích plemen a jejich zbarvení předcházela domestikace a následné šlechtění. Původní divoké zbarvení, jaké známe u předků psů vlků, se zachovalo pouze u několika málo plemen. Barva srsti byla a stále je jedním z nejvíce rozhodujících znaků při procesu selekce jedinců pro jednotlivé chovy. Bílá skvrnitost způsobená genem melanogenesis associated transcription factor (MITF) je předmětem zájmu mnoha odborníků a stále ještě není mechanismus vzniku tohoto zbarvení zcela objasněn. V současné době je známo několik mutací tohoto genu, které jsou s bílou skvrnitostí spojovány. Klíčová slova: bílá skvrnitost, MITF, zbarvení srsti, mutace ABSRACT The domestication and subsequent breeding preceded the formation of today's dog breeds and their coloring. The original wild coat color, which is known in ancestors of dogs - wolves, has been preserved in only a few dog breeds. The color of the coat has been and still is one of the most decisive signs in the process of selecting individuals for breeds. The white spotting is caused by the melanogenesis associated transcription factor (MITF), this gene is point of the interest to many experts, and the mechanism of this coat colour is not fully elucidated yet. In presence, several mutations of this gene are currently known, this mutations are associated with the white spotting. Key words: white spotting, MITF, coat colour, mutation

OBSAH 1 Úvod...9 2 Cíl práce... 10 3 Literární přehled... 11 3.1 Fyziologické základy zbarvení srsti a jejich vzorů... 11 3.1.1 Srst... 11 3.1.2 Pigmentace srsti... 11 3.2 Genetika zbarvení klasické lokusy... 12 3.2.1 A lokus (Agouti)... 13 3.2.2 B lokus (Brown)... 15 3.2.3 C lokus (Albinismus)... 16 3.2.4 D lokus (Dilute)... 17 3.2.5 E lokus (Extension)... 18 3.2.6 G lokus (Greying)... 19 3.2.7 H lokus (Harlequin)... 20 3.2.8 Tw lokus (Tweed)... 20 3.2.9 I lokus (Intensity)... 21 3.2.10 K lokus (Black)... 21 3.2.11 M lokus (Merle)... 22 3.2.12 R lokus (Roan)... 23 3.2.13 S lokus (White spotting)... 23 3.2.14 T lokus (Ticking)... 25 4 Gen skvrnitosti MITF... 26 4.1 Historie objevení genu MITF... 26 4.2 Funkce genu MITF... 27 4.3 Gen MITF u psů... 28 4.3.1 Sekvence... 28 7

4.3.2 Mutace a polymorfismus... 30 4.4 Diverzita genu MITF u plemen psů... 35 4.5 Porovnání genu MITF u dalších druhů zvířat... 35 5 Závěr... 37 6 Přehled použité literatury... 38 Seznam použitých zkratek Přílohy 8

1 ÚVOD Různorodost barvy srsti fascinovala lidstvo po celá staletí a následně se stala jedním z nejrozšířeněji studovaných znaků, zejména u myší, ale také u domácích zvířat. Existuje široká rozmanitost vzorů bílých skvrn u jednotlivých plemen psů způsobených genetickými faktory a stochastickými účinky během vývoje melanocytů. Bílé skvrny vznikají v důsledku nepřítomnosti melanocytů v chlupových folikulech a/nebo kůži v důsledku selhání migrace melanoblastů (vývojové stadium melanocytů), proliferace nebo přežití těchto buněk během vývoje. U psů existuje jeden hlavní lokus způsobující bílou skvrnitost - (S) lokus, jehož existenci předpokládal již v 50. letech 20. století Clarence Cook Little. 9

2 CÍL PRÁCE Cílem této práce je zpracování nejnovějších poznatků z oblasti molekulárně genetické determinace skvrnitosti u psů. Pozornost byla věnována především charakterizaci genetického založení zbarvení u psů a charakterizaci genu pro skvrnitost. Následně proběhla bioinformatická analýza sekvence genu pro skvrnitost, jeho charakterizace a fylogeneze. V neposlední řadě je zde zahrnuto srovnání genu skvrnitosti mezi plemeny psů a mezi druhy dalších zvířat a člověka. 10

3 LITERÁRNÍ PŘEHLED 3.1 Fyziologické základy zbarvení srsti a jejich vzorů 3.1.1 Srst Srst je tvořena chlupy, jež jsou kožními deriváty a vyrůstají z chlupových folikulů umístěných ve vrstvě kůže nazývané škára. Z jednoho chlupového folikulu vyrůstá jeden chlup a ústí do něj jedna mazová žláza. Každý chlup je napojen na sval, tzv. vzpřimovač chlupu, který způsobuje piloerekci, jež se uplatňuje při termoregulaci organismu. Chlupy rozdělujeme podle jejich anatomie a funkce na krycí chlupy, chlupy podsady a sinusové chlupy. Krycí chlupy, také pesíky, jsou nejdelší a nejsilnější, mají funkci ochrannou (především odvádění vody ze srsti) a jejich barva určuje celkové zbarvení psa. Jemné a mnohonásobně početnější chlupy podsady se uplatňují při udržování stálé tělesné teploty, chrání před nadměrným chladem i teplem. Sinusové chlupy se nacházejí pouze okolo čenichu a nad očima, jsou ze všech typů chlupů nejdelší a nejsilnější a mají hmatovou funkci (Dostál, 2007). 3.1.2 Pigmentace srsti Za zbarvení srsti zodpovídá pigment melanin, který se vytváří v pigmentových buňkách nazývaných melanocyty, jež se nacházejí v pokožce. Z melanocytů je pak melanin transportován na další potřebná místa v těle (chlupy, oči, oblasti mozku, míchy atd.). Melanin představuje polymer tyrosinu a dělíme jej na dvě formy eumelanin a feomelanin. Eumelanin způsobuje zbarvení kůže i srsti a jedná se o černý pigment. Působením jiných genů se mohou objevit i jiné barvy nebo jejich odstíny. Produkci eumelaninu řídí alela E. Eumelanin je tvořen buď v původní černé variantě, nebo je změněn na hnědou variantu působením genu b. Feomelanin se nachází pouze v srsti, nijak tedy neovlivňuje samotné zbarvení kůže. Tento pigment je žlutý nebo červený a jeho produkce je kontrolována alelou e. Možné je i podílení se tohoto pigmentu na zbarvení pálení (Dostál, 2007). 11

3.2 Genetika zbarvení klasické lokusy Nositelkou genetické informace je deoxyribonukleová kyselina (DNA), která spolu s histony (nukleoproteiny) vytváří strukturu chromozomů. DNA je složena ze čtyř dusíkatých sloučenin bází, kyseliny fosforečné a deoxyribózy. Typy bází jsou adenin (A), guanin (G), thymin (T) a cytosin (C). Báze jsou uspořádány v nejrůznějších kombinacích za sebou, přičemž tři báze kódují vždy jednu aminokyselinu. Určité úseky DNA se nazývají geny, které nesou informace o anatomických, morfologických i psychických vlastnostech jedince. Souhrn všech genů jednoho jedince se nazývá genotyp, souhrn vnějších projevů vlastností a znaků se nazývá fenotyp (Dostál, 2007). Každý gen má více variant, tyto varianty označujeme jako alely. Alel jednoho genu může být hned několik, nicméně každý jedinec ve své genetické informaci nese pouze dvě alely daného genu. Umístění genu na chromozomu se nazývá lokus. Geny nacházející se na stejném lokusu ovlivňují stejné vlastnosti, ale mohou je ovlivňovat různými způsoby, dle alel daného genu. Geny se dělí na majorgeny a minorgeny. Majorgeny silně ovlivňují fenotyp, prostředí má spíše nevýznamný účinek na projev (expresi) těchto genů. Tyto geny kódují tzv. kvalitativní znaky (barva očí, tvar ušního boltce apod.), každý znak je kódován zpravidla jedním až dvěma majorgeny. Minorgeny fenotyp ovlivňují jen málo a na rozdíl od majorgenů jsou významně ovlivnitelné životním prostředím. Tyto geny kódují tzv. kvantitativní znaky (dojivost, velikost těla apod.), znaky jsou většinou kódovány více minotgeny. Alely rozdělujeme na dominantní (značeny velkým písmenem) a recesivní (značeny malým písmenem). Dominantní alela se projeví vždy, a to i pokud je druhá alela recesivní. Recesivní alela se projeví jen tehdy, je-li v homozygotním stavu, tedy obě alely daného genu jsou recesivní. Podle přítomnosti dominantních a recesivních alel genu jedince rozdělujeme na dominantní homozygoty, recesivní homozygoty a heterozygoty. Dominantní homozygot má obě alely daného genu stejné a jedná se o dominantní alely. Recesivní homozygot má obě alely také stejné, ale jedná se o alely recesivní. Heterozygot má jednu dominantní a jednu recesivní alelu, v tomto případě se projeví alela dominantní. Známá je ale také kodominance alel, v případě projevu dvou různých dominantních alel genu (Ostrander a Ruvinsky, 2012). 12

Genetická informace se přenáší z rodičů na potomstvo. Potomek získá od každého z rodičů 50 % genetické informace, tedy jen jednu alelu daného genu. Genetika zbarvení srsti psů je předmětem zájmu již mnoho let. Rozvíjející se technika umožňuje postupovat dále ve zkoumání a identifikaci jednotlivých genů a alel zodpovědných za zbarvení. V současnosti je popsáno osm genů zodpovědných za zbarvení srsti a kůže psů: agouti signal peptide (ASIP), tyrosinase releated protein 1 (TYRP1), melanophilin (MLPH), melanocortin 1 receptor (MC1R), proteasome subunit beta 7 (PSMB7), beta-defension 103 (CBD103), premelanosome protein (SILV), melanogenesis associated transcription factor (MITF). Další geny ovlivňující zbarvení nebyly dosud přesně popsány, jsou zatím známy/předpokládány pouze jejich lokusy: C lokus, G lokus, I lokus, R lokus, T lokus. Zbarvení je určováno více geny současně, jedná se tedy o polygenní znak (Kaelin a Barsh. 2013). 3.2.1 A lokus (Agouti) A lokus se nachází na 24. chromozomu psa a má označení ASIP (agouti signal peptide). Agouti zbarvení odpovídá původnímu zbarvení, tedy zbarvení divokých předků. Tento lokus je zodpovědný za divoké zbarvení, zbarvení sable, pálení a recesivní černé zbarvení. Bylo popsáno pět alel genu ASIP: a y, a w, a t, a s, a. Alely a y, a w, a t, a s se někdy označují společně jako A (Agouti) a alela a (nonagouti). Projevení zbarvení lokusu A ovlivňuje lokus E, který, pokud nese funkční gen, tlumí projev proteinu Agouti a syntetizuje se více eumelaninu oproti feomelaninu (Schmutz and Berryere, 2007). Alela a y způsobuje zbarvení sable. Ze všech alel na tomto lokusu je tou nejdominantnější, tudíž jedna alela v genotypu stačí na projevení ve fenotypu. Alela a y je ale neúplně dominantní vůči alele a t. Jedinci s genotypem a y /a t jsou oproti jedincům s genotypem a y /a y tmavší. Sable zbarvení představuje červenou barvu srsti, za kterou je zodpovědný feomelanin, tuto červenou barvu překrývají chlupy s eumelaninovou pigmentací. Zbarvení sable rozdělujeme do dvou typů: clear sable (viz Obr. 1) a shaded sable (Bowling, 2000). 13

Obr. 1 Clear sable zbarvení u šeltie (http://vicjudges.com) Alela a w kóduje zbarvení agouti (viz Obr. 2), v českém jazyce zbarvení divoké, jež označuje původní divoké zbarvení kojotů a vlků, nachází se i u spousty dnešních plemen psů. Divoké zbarvení představuje žluto-černě pruhované chlupy, jejich pruhování vzniká střídavým působením eumelaninu a feomelaninu během tvorby chlupu. Obr. 2 Tamaskan s agouti zbarvením (http://www.doggenetics.co.uk/tan.html) Alela a je zodpovědná za černé zbarvení. Projev této alely nastává pouze u recesivních homozygotů. Genotyp a/a zapříčiňuje černé zbarvení srsti jen u několika málo plemen (např. akita inu, šeltie, německý ovčák), u většiny ostatních plemen odpovídá za černé zbarvení dominantní alela na K lokusu. Tato alela byla též nalezena u bílých plemen. Alela a t způsobuje pálení (viz Obr. 3), jež představuje tvorbu feomelaninu v typickém vzoru. I u této alely dochází k projevu ve fenotypu, jen pokud je jedinec recesivní homozygot. Pálení vzniká v různých odstínech hnědé až žluté barvy. 14

Obr. 3 Rotvailer s pálením (https://wagwalking.com/breed/rottweiler) Alela a s pravděpodobně vytváří zbarvení nazývané sedlo. Prozatím ale nebyla tato alela jednoznačně prokázána (Schmutz and Berryere, 2007). 3.2.2 B lokus (Brown) Tento lokus se označuje také jako gen TYRP1 (tyrosinase related protein 1), nachází se na 11. chromozomu. Tento gen zapříčiňuje zbarvení hnědé nebo černé. Jsou známy čtyři alely tohoto genu: B, b S, b d, b c, přičemž alely b S, b d, b c vznikly mutací alely b. Černé zbarvení vzniká, pokud je přítomna alespoň jedna alela B. Tato alela je dominantní, tudíž k jejímu projevu ve fenotypu dochází u dominantních homozygotů nebo u heterozygotů. Alela b dává v homozygotním stavu za vznik hnědému zbarvení. V tomto případě se hnědá barva projeví kromě srsti i na kůži, proto lze recesivní homozygoty poznat již na první pohled. Mutované varianty alely b (b S, b d, b c ) zapříčiňují různé odstíny hnědé barvy, jež dávají konkrétnímu zbarvení různé názvy, např. hnědá, čokoládová, červená, játrová (viz Obr. 4). Jelikož je TYRP1 asociován pouze s eumalninem, projeví se pouze, pokud má jedinec zároveň na E lokusu alely E/E nebo E/e. U psů s alelami e/e nebude mít gen TYRP1 žádný projev na barvě srsti, nicméně může stále ovlivnit barvu nosu a polštářků na tlapkách (Schmutz et al., 2002). 15

Obr. 4 Játrové zbarvení plemene Newfoundlandský pes (http://www.dogwallpapers.net) 3.2.3 C lokus (Albinismus) Existuje celá řada genů, které by mohly způsobovat albinismus. Ovšem nejčastěji albinismus vzniká působením genu pro tyrozinázu (TYR), který je pravděpodobně nesen C lokusem nacházejícím se na 21. chromozomu. Tyrozináza představuje enzym podílející se na syntéze melaninu z tyrozinu a je zodpovědná za albino zbarvení u mnoha druhů savců. Obecně zesvětluje nebo odstraňuje veškerý pigment na bázi melaninu. Může také omezit pigment pouze na určitých oblastech těla. Předpokládá se existence celkem sedmi alel tohoto genu: C, c a, c ch, c e, c h, c p, c b. Dominantní alela C je pravděpodobně genem pro tyrozinázu. Její přítomnost v genotypu zajišťuje projevení pigmentu ve fenotypu, a to jak u dominantních homozygotů, tak i u heterozygotů (Schmutz a Berryere, 2007). Recesivní alela c a v homozygotním stavu inhibuje syntézu melaninu. Takový jedinec má pak bílou srst, bez pigmentace je i kůže a oční duhovka, jedná se tedy o albína. c ch. Šedé nebo vlčí zbarvení nazývané jako zbarvení činčila způsobuje recesivní alela Alela c e zapříčiňuje extrémní ředění původního zbarvení jedince. Je přítomna i u některých bílých plemen psů. Alela c b dává za vznik albínům s modrýma očima (viz Obr. 5), (Dostál, 2007). Jednici s velmi slabou syntézou tyrozinázy vznikají přítomností alely c p. Tito jedinci mají lesklou srst a modré oči, zbarvení je známo pod názvem platinum. 16

Recesivní alela c h způsobuje syntézu eumelaninu v závislosti na teplotě kůže, u psů však zatím nebyla prokázána (Bowling, 2000). Je třeba dodat, že neexistují žádné známé mutace C lokusu u psů a dosud nebyly na tomto místě testovány pozitivní výsledky pro albino zbarvení. Nicméně je známo, že albino zbarvení je způsobeno také genem SLC45A2, který byl nedávno objeven u bílých dobrmanů. Podle Little se na lokusu C nachází právě gen SLC5A2. Tento gen způsobuje některé formy albinismu a světlé kůže i u lidí, stejně jako buckskin, palomino a cremello u koní. Jedinci s mutacemi genu SLC45a2 nejsou schopni správně syntetizovat pigment melanin (Winkler et al., 2014). Byla osekvenována cdna pro tyrozinázu od několika psů, včetně některých albinotických psů a nebyly nalezeny žádné polymorfizmy. To nevylučuje možnost mutace v promotoru, ale naznačuje, že se u psů tento gen na lokusu C spíše nenachází (Schmutz, 2016). Obr. 5 Bílý dobrman s modrýma očima (https://dogshunt.com) 3.2.4 D lokus (Dilute) D lokus byl zmapován na 25. chromozomu a nese označení MLPH (melanophilin). Gen je zodpovědný za ředění původní barvy jedince. Známy jsou alely D a d. Gen MLPH nejspíš působí na pigmentové granule vytvářející shluky, takto ovlivňuje následné zředění eumelaninu, na feomalenin působí ředění jen slabě. Pigmentové granule jsou přirozeně u kořene chlupu v hustším rozvrstvení a na konečcích chlupu jsou v řidším rozvrstvení, proto vypadají konečky chlupů světlejší a u kořene vypadají chlupy tmavší (Schmutz a Berryere, 2007). Dominantní alela D umožňuje normální hustotu pigmentových granulí v chlupech, její přítomnost tedy ředění barvy zabraňuje. 17

Alela d u recesivních homozygotů způsobuje řídké rozvrstvení pigmentových granulí, což má za následek ředění barvy. Alela má velký vliv na ředění eumelaninu, zároveň ovlivňuje i pigmentaci kůže. Dochází k zesvětlení základní barvy jedince, černá barva je ředěna na šedou modrou (viz Obr. 6), hnědá se ředí na světle hnědou až béžovou (Bowling, 2000). Obr. 6 Modrý dobrman s pálením (http://www.dobrmaniraj.estranky.cz/) 3.2.5 E lokus (Extension) E loku představuje gen MC1R (melanocortin 1 receptor) je nesen 5. chromozomem. MC1R se v genetice psů studoval molekulárními metodami jako první. Je zodpovědný za rozložení pigmentu v těle. Ztráta funkce tohoto genu pak dává za vznik čistě červenému nebo žlutému zbarvení srsti. Gen má čtyři alely: E, e, E M, E G. Alela E představuje původní dominantní divokou alelu a umožňuje normální rozložení pigmentu po těle (Schmutz a Berryere, 2007). Specifické vzory vznikají díky alelám E M a E G. Alela E M způsobuje melanistickou masku (viz. Obr. 6), což je charakteristická černá maska u žlutých, červených, plavých a světle hnědých psů. U jedinců, kteří mají bílý čumák, se maska neprojeví, i když jsou nositeli této alely. Alela E G je zodpovědná za zbarvení známe jako grizzle. Toto zbarvení je charakteristické světlou barvou způsobenou pigmentací feomelaninu, horní část těla překrývají barvy tmavé, které způsobuje eumalanin. Recesivní alela e svým omezování produkce tmavého pigmentu eumelaninu způsobuje normální rozložení v srsti pigmentu světlého. Touto alelou není řízena pigmentace kůže a sliznic. Alela vzniká důsledkem ztráty funkce genu MC1R, takový 18

jedinec je pak schopen produkovat pouze feomelanin. Barva srsti pak je červená, světle krémová až téměř bílá (Schmutz, 2009). Obr. 7 Melanistická maska u plemene belgický ovčák (http://www.dogwallpapers.net) 3.2.6 G lokus (Greying) G lokus se pravděpodobně nachází na 21. chromozomu psa, není ale zcela přesně znám gen, který se na tomto lokusu nachází. Neznámý gen zapříčiňuje šedivění různých částí těla psů různých plemen a různého věku a má dvě alely: G, g. V současné době není zcela jasné, zda je alela G úplně dominantní nad alelou g. Alela G nejspíše způsobuje šedivění v jakémkoli věku psa, ne pouze ve stáří přičemž recesivní alela g by mohla být zodpovědná za normální pigmentaci srsti, jedinec začíná šedivět až ve stařeckém věku (viz Obr. 8), (Schmutz a Berryere, 2007). Obr. 8 Stařecké šedivění u labradorského retrívra (https://www.thelabradorsite.com) 19

3.2.7 H lokus (Harlequin) Tento lokus byl nalezen na 9. chromozomu a nese gen PSMB7 (proteasome subunit beta 7). Gen vytváří zbarvení známé jako harlekýn (viz. Obr. 9), jež se nejčastěji vyskytuje u plemene německá doga. Známy jsou dvě alely: H, h. Alela H je dominantní vůči alele h, psi se zbarvením harlekýn mají vždy jen jednu dominantní alelu, jedná se totiž o dominantní embryonální letální gen, takže všechna embrya s genotypem H/H jsou resorbována do dělohy a narodí se pouze psi s genotypem H/h. Gen PSMB7 pigment nevytváří, jedná se o dominantní modifikátor merle zbarvení. Způsobuje, že šedé pozadí u merle je zředěno na bílou barvu, zanechává tmavé skvrny na bílém pozadí a může ovlivnit jakýkoli druh merle. Obyčejné merle se zředěnými oblastmi se někdy zaměňuje za zbarvení harlekýn. Harlekýn má ale jasný vzor, který udává například i standard plemene německá doga všechny barvy jsou silné, jasné a bohaté. Pravý harlekýn se vyskytuje pouze u německých dog (Clark et al., 2010). Obr. 9 Německá doga se zbarvením harlekýn (https://www.animalclinicatthorndale.com) 3.2.8 Tw lokus (Tweed) Existuje další zdokumentovaný dominantní modifikátor merle známý jako tweed, který vytváří vzor čtyř až pěti přechodových odstínů šedé a rezavě hnědé, nebo červené u red merle. Tweed vytváří skvrny náhodných barev (viz Obr. 10), které se objevují v merle srsti, někdy mohou také způsobit narušení oblasti pálení, takže se zdá, že překrývají základní plášť. Psi s takovým vzorem mohou připomínat africké divoké psy, i když jejich barva má jiný genetický základ. Tweed se vyskytuje většinou u australských ovčáků a Catahoulských leopardích psů. Je možné, že mutace tweedu se vyskytla pouze u jednoho 20

plemene, která se rozšířila, neboť křížení mezi oběma plemeny je v USA obvyklé, jinak se vyskytuje jako mutace, a to vždy u plemene, kde se vyskytuje merle (více merle jedinců zvyšuje možnost mutace, merle gen je známý jako křehký gen, který mutuje častěji než většina ostatních). Každopádně je to vzácný a nápadný vzor. Často je mu přidělován vlastní lokus Tw, a domnívá se, že je dominantní (Clark et al., 2010). Obr. 10 Tweedový vzor u plemene Catahoulský leopardí pes (http://www.doggenetics.co.uk) 3.2.9 I lokus (Intensity) Do nedávna se myslelo, že gen pro tyrozinázu na lokusu C je zodpovědný za intenzitu červeného pigmentu feomelaninu u psů, který například způsobuje rozdíl mezi bohatou červenou srstí irských setrů a téměř čistou bílou srstí, kterou můžeme vidět u plemen jako je samojed nebo německý ovčák. Ovšem ukázalo se, že psi s bílou srstí a psi se slonovinovou barvou nemají v lokusu C žádné mutace. Je tedy možné, že existuje lokus ovlivňující ředění feomelaninu, byl popsán jako I lokus. V současné době není známo, jak tento lokus funguje, kde se v genomu psa nachází, nebo jaké alely se na něm nacházejí. Obecná myšlenka je, že zapříčiňuje zesvětlení nebo ztmavení feomelaninu v srsti, nijak neovlivňuje eumelanin, ani zbarvení očí a nosu (Schmutz, 2016). 3.2.10 K lokus (Black) Na tomto lokusu, který je na 16. chromozomu, byl objeven gen způsobující černé zbarvení a má označení CBD103 (beta-defensin 103). Existují tři alely tohoto genu: K B, k br, k y. Alela K B je dominantní vůči alelám k br a k y a vytváří černé zbarvení srsti. Je známa interakce mezi alelami na K lokusu, A lokusu a E lokusu. Alela k br je dominantní nad alelou k y, dává za vznik žíhanému zbarvení (viz Obr. 11), které se objevuje po celém těle 21

jedince při současné přítomnosti alely a y, nebo pouze na břišní oblasti, a to za přítomnosti genotypu a t /a t. Recesivní alela k y je pak zodpovědná za žlutou barvu srsti, která je stejná jako u jedinců s genotypem e/e (Kerns et al., 2007). Obr. 11 Žíhaný německý boxer (http://www.vetstreet.com) 3.2.11 M lokus (Merle) Gen pro merle zbarvení, který nese označení SILV (premelanosome protein), se nalézá na 10. chromozomu. Gen vytváří skvrny zředěné základní barvy kombinující se s plně pigmentovanými oblastmi, jedinec má tedy na základní barvě (černá, červená, hnědá, světlá) nepravidelné zesvětlené skvrny (šedá, béžová). Gen SILV působí v závislosti na alelách lokusů B, D, K, A a E. Merle zbarvení (viz Obr. 12) způsobuje dominantní alela M, homozygotní jedinci pro recesivní alelu m nemají merle zbarvení. Normální merle vzniká u heterozygotů (M/m), dominantní homozygoti (M/M) mají tzv. double merle (srst bývá čistě bílá). Zředěné skvrny se mohou objevit kdekoliv na těle psa, jsou libovolně velké a nemusí mít jasné ohraničení, okraje se zdají být zubaté. Gen SILV působí pouze na eumelanin, může tedy ovlivnit i barvu očí a nosu, nebo způsobit jejich nedostatečnou pigmentaci. Eumelanin je na srsti produkován v tzv. plotnách. Gen pro merle zbarvení je známý tím, že způsobuje řadu zdravotních problémů, mezi nejzávažnější patří hluchota, slepota, citlivost na sluneční záření a tím riziko vzniku rakoviny kůže. Tyto zdravotní problémy jsou u genotypu M/M velmi časté, u genotypu M/m se objevují zřídka, z tohoto důvodu by se neměli připouštět dva merle jedinci (Clark et al., 2006). 22

Obr. 12 Zbarvení red merle u plemene border kolie (foto Michaela Táflová) 3.2.12 R lokus (Roan) Předpokládá se existence lokusu, který vytváří grošované zbarvení (viz Obr. 13). Označuje se jako R lokus a je pravděpodobně příbuzný lokusu T. Byl považován za lokus způsobující smíchání bílých a barevných chlupů v oblastech, které jsou alelami pro piebald zbarvení podmíněny jako bílé. Je možné, že se jedná pouze o projev extrémního tečkování, v němž jsou malé tečky velmi početné a spletité natolik, že připomínají spíše barevné skvrny na bílé základní barvě (Kaelin a Barsh, 2013). Obr. 13 Grošovaný australský honácký pes (http://apdyfrig.com) 3.2.13 S lokus (White spotting) S lokus byl objeven na 20. chromozomu a je označen jako MITF (melanogenesis associated transcription factor). Je klíčovým regulátorem pigmentace srsti u psů a vytváří bílé skvrny (plochy) na určitých místech těla (např. tlapy, ocas, hrudník). Skvrny mohou být různě velké, jedna skvrna může dokonce pokrývat téměř celé tělo, nejedná se ovšem 23

o albinismus. Little (1957) popsal čtyři různé alely na tomto lokusu: S, s p, s w, s i. Alela S vytváří minimální nebo žádné bílé znaky, alela s p dává za vznik zbarvení piebald, alela s i je zodpovědná za tzv. Irish spotting, alela s w způsobuje u homozygotů fenotyp extrémní bílé skvrnitosti, kdy jedinci mají vždy bílou srst a i většina kůže je bez pigmentu, ale mohou mít po těle několik barevných skvrn. Irish spotting se vyznačuje bílými skvrnami často přítomnými jako bílý límec a bílé břicho, jak je možno vidět u plemen jako je například bernský salašnický pes a basenji (viz Obr. 14), (Schmutz, 2016). Obr. 14 Irish spotting u plemene basenji (http://dogtime.com) Piebald zbarvení je omezeno na rozsáhlé bílé skvrny a fenotyp je pozorován u několika plemen, včetně bígla (viz Obr. 15) a fox teriéra. U jedinců s genotypem S/s w vzniká zbarvení flash, které je podobné zbarvení Irish spotting, proto je často nazýváno také jako pseudo-irish (Schmutz a Berryere, 2007). Obr. 15 Bígl se zbarvením piebald bílé oblasti (https://www.petsworld.in) 24

3.2.14 T lokus (Ticking) Specifický gen, který kóduje skvrnitost, nebyl dosud přesně identifikován. Na T lokusu se pravděpodobně nacházejí dvě alely: T, t. Alela T vytváří srst skvrnitou nebo grošovanou, recesivní alela t tečky nevytváří. Vznikající skvrny nebo fleky se objevují pouze na bílé srsti, pokud má tedy pes alelu pro skvrnitost, ale nemá žádné bílé plochy na těle, nebude viditelný žádný fenotypový efekt. To samé platí pro jedince, kteří jsou bílí působením genu pro intensitu barvy (I lokus), ani u nich nebudou viditelné žádné skvrny. Jedinci s alelami v genotypu pro tečkování se narodí bez skvrn, jsou tedy bílí, skvrny se objevují během prvních týdnů života. T lokus také vytváří typické skvrny dalmatinů, konečný vzor tečkování závisí na modifikacích přítomných alel vytvářejících skvrnitost. Tečkování je běžné i u anglických setrů, kde je tento vzor nazýván jako belton (viz Obr. 16), dále u německých krátkosrstých a německých drátosrstých ohařů a u australských honáckých psů (Schmutz, 2014). Obr. 16 Zbarvení belton u plemene anglický setr (http://petcollectionworld.com) Přehled všech výše uvedených lokusů a jejich působení na fenotyp je shrnutý v příloze (Tab. 1). 25

4 GEN SKVRNITOSTI MITF U druhů domácích zvířat byla barva srsti selektována převážně lidmi, a to především pro svůj líbivý vzhled, v přírodě působila evoluce. Zbarvení je ovlivněno geny, z nichž některé působí přímo na zbarvení, jiné působí nepřímo tím, jak jsou ovlivňovány faktory životního prostředí. Mnoho znalostí o tom, jak fungují tyto geny, pochází z analýzy spontánních nebo indukovaných mutací. Mnohé z těchto mutací ovlivňují pouze pigmentaci, ale některé vedou ke kombinacím fenotypů v několika různých tkáních, dokonce i ve tkáních odlišného embryologického původu. Právě tyto pleiotropní mutace obzvláště zajímají genetiky, kteří se zabývají pigmentací (Arnheiter, 2010). 4.1 Historie objevení genu MITF Ačkoli první mutace lokusu mikroftalmie (nyní je lokus nazýván jako MITF) byla objevena mezi potomky myši, která byla ozářena za účelem mutageneze, vzniklá mutace pravděpodobně nebyla vyvolána radiací, ale spontánně nastala u jednoho z rodičů pozdějšího chovu. MITF byl nejprve klonován z náhodného transgenního inzertu v lokusu mikroftalmie, i když mohl být identifikován jinými molekulárně genetickými technikami. A ačkoli bylo zjištěno, že MITF kódoval transkripční faktor z již velmi známé rodiny transkripčních faktorů, jeho analýza by mohla být ještě na počátku, kdyby nebyl MITF prokázán jako klíčový pro fyziologii a patologii mnoha různých orgánů, včetně oka, ucha, imunitního systému, kosti a kůže, a zejména melanomu. Tím ve skutečnosti téměř sedm desetiletí výzkumu MITF vedlo k mnoha poznatkům o vývoji, funkci, degeneraci a malignitách řady specifických buněčných typů a je snaha o to, aby tyto poznatky jednoho dne vedly k terapiím prospěšným pro ty, kteří trpí onemocněními těchto typů buněk (Arnheiter, 2010). Jedním z prototypických pleiotropních pigmentačních lokusů je lokalizace mikroftalmie, která se stala důležitou pro mnoho odlišných polí vědy. Mikroftalmie ve skutečnosti hraje významnou roli například v biologii a patologii pigmentace kůže a jejích derivátů, při vývoji a degeneraci očí a při výzkumu sluchu. První mutace na tomto lokusu objevila Paula Hertwig v Berlíně mezi potomky ozářené myši a byla poprvé publikována v roce 1942 (Hertwig, 1942). Později byla nalezena řada dalších mutantních alel lokusu u myší a jiných obratlovců (Steingrimsson et al., 2004). Odpovídající gen, MITF, byl klonován v roce 1992 a nejprve publikován v roce 1993 (Hodgkinson et al., 1993). 26

Jak bylo zmíněno, první mutaci na lokusu mikroftalmie popsala Paula Hertwig. Genetický výzkum byl v Německu velmi podporován, když v roce 1942 vydala Hertwig první zprávu o bílých myších s malýma očima (mikroftalmie) spolu s pěti dalšími novými mutanty. Mikroftalmické myši se objevily mezi potomstvem vzniklým inbredním křížením albino myší se samcem označeným 944, který byl potomkem ozářeného samce. Samec 944 však nebyl sám považován za zmutovaného, protože jeho potomci s pěti vlastními dcerami měli opět normální potomstvo (Hertwig, 1942). Přesto toto potomstvo při inbredním křížení mělo ve vrhu i albino jedince. Hertwig si nejdříve myslela, že všichni bílí jedinci jsou jen albíni, později si ale všimla, že oči některých z nich byly velmi malé a jejich víčka neotevřená. V následujících pokusných chovech si uvědomila, že objevila nový recesivní gen s pleiotropními účinky. Dospěla k závěru, že mutace pravděpodobně vznikla u jedné z gamet samce 944, nebo byla alternativně odvozena od albino samice. Heterozygoti vykazovali při narození pouze sníženou pigmentaci očí, ale žádný důkaz o defektech barvy srsti. Z těchto důvodů mohla Hertwig nazvat nový gen "Microphthalmus" (symbol "m") a proto jej pojmenovat podle očního fenotypu, spíše než fenotypu srsti. V roce 1948 Hans Grüneberg, který v roce 1946 získal tři mikroftalmické myši a analyzoval je nezávisle, navrhl použít symbol mi, protože písmeno m bylo dříve použito pro jinou mutaci (Grüneberg, 1948). V letech 2006 a 2007 tři skupiny vědců nezávisle na sobě mapovaly některé nebo všechny fenotypy bílých skvrn do lokusu MITF (Rothschild et al., 2006; Karlsson et al., 2006; Leegwater et al., 2007). 4.2 Funkce genu MITF Gen je exprimován ve většině typů buněk a má hlavní roli v pigmentových buňkách nesoucích melanin odvozených od neurálního hrudníku a neuroepitelia. Melanocyty jsou regulovány genem MITF například na úrovni specifikace, proliferace, přežití, migrace, diferenciace, doplnění během přepeřování a výměny srsti a maligní transformace. Buňky epitelu sítnicového pigmentu jsou regulovány MITF na úrovni vývojové specifikace a proliferace a následně ovlivňuje jejich funkci ve fyziologii sítnice u dospělých jedinců. Dále také reguluje vývoj a funkci žírných buněk, které mohou zajišťovat ochranu před mikrobiálními infekcemi a reguluje osteoklasty v jejich úloze při remodelování kostí. 27

To vše MITF ovlivňuje díky kódování klasického transkripčního faktoru helixotočka-helix leucinového zipu, který vytváří dimery schopné vázat specifické sekvence DNA v regulačních oblastech velkého počtu cílových genů, které zase řídí různé buněčné procesy. MITF však nejen že tvoří homodimery, ale může také heterodimerizovat s TCFEB, TCFE3 a TCFEC, třemi příbuznými bílkovinami, se kterými tvoří malou podskupinu. Společný předchůdce odpovídajících genů se vyskytuje u bezobratlých včetně Tripedalia (Kozmik et al., 2008) a Drosophila (Hallsson et al., 2004), kde může ovlivňovat vývoj očí a u Caenorhabditis elegans (Rehli et al., 1999), kde jeho funkce není dosud známa (Arnheiter, 2010). Byla také zaznamenána hluchota u bílých psů, u kterých je přibližně 2 % bílých psů (s w /s w ) s bilaterální hluchotou a 18 % jednostranně hluchých (Strain, 2004). 4.3 Gen MITF u psů Genom psa obsahuje 39 párů chromozomů a jeho celková délka činí 2 385 199 138 párů bazí (bp). MITF se nachází na 20. chromozomu, ten má délku 58 130 000 bp. Samotný gen MITF disponuje délkou 101 399 bp a jeho počátek se nachází v pořadí na 21 772 147. bp a konec na 21 873 545. bp 20. chromozomu (NCBI Reference Sequence: NC_006602.3). 4.3.1 Sekvence Na serveru Ensemble je možné nalézt základní sekvenci genu MITF (viz Obr. 18), zobrazeny jsou celé exony (9), naznačeny jsou i introny (8), které jsou kvůli své délce v náhledu zkráceny. Exony jsou části genů, podle kterých se při procesu translace DNA tvoří proteiny. Introny jsou oblasti genů mezi exony, ale jsou nekódující, proto při translaci dochází k jejich vystřižení ze sekvence tzv. splicing. 28

Obr. 18 Sekvence exonů genu MITF (http://www.ensembl.org) V databázi existují dvě varianty transkriptů genu MITF. Varianty transkriptů se rozdělují podle toho, kolik aminokyselin kódují. První varianta je označena jako MITF- 201, má délku 5 292 bp s 11 exony a kóduje celkem 479 aminokyselin. Druhý transkript, MITF-202, má délku 1 590 bp, 9 exonů a kóduje 419 aminokyselin. Na webové stránce NCBI jsem pomocí nástroje Align Sequences Nucleotide BLAST porovnala nukleotidovou sekvenci mrna transkriptu MITF-202 s nukleotidovou sekvencí 20. chromozomu psa (viz. Obr. 18 a Příloha č. 2). Porovnání obou sekvencí ukázalo, kde se gen MITF na 20. chromozomu psa nachází a které úseky sekvencí se shodují. Shodných úseků bylo nalezeno 9, tyto úseky odpovídají exonům. Shodnost některých exonů ovšem nebyla stoprocentní, nejspíše proto, že sekvence 20. chromozomu byla získána z plemene německý boxer, naproti tomu sekvence mrna genu MITF pravděpodobně pochází od jiného plemene. 29

Obr. 19 Výsledek porovnání nukleotidové sekvence mrna transkriptu MITF-202 s nukleotidovou sekvencí 20. chromozomu psa plemeno německý boxer (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov - upraveno) 4.3.2 Mutace a polymorfismus Hypotézu o tom, že by mohl v genomu psa existovat lokus vytvářející bílé skvrny, vyslovil již roku 1957 Clarence Cook Little, nazval jej jako S lokus a zároveň uvedl čtyři možné alely tohoto genu: S, s i, s p, s w. Největší výsledky přinesl výzkum Karlsson et al. (2007), kteří mapovali S lokus do oblasti o velikosti 1 Mb na 20. chromozomu. Mapování bylo založeno na studii genomové asociace porovnávající 10 bílých homozygotních bílých (s w /s w ) jedinců a 10 homozygotních jedinců bez bílých skvrn (S/S) u plemene německý boxer. Jemného mapování do oblasti 100 kb, které zahrnovalo i gen MITF, bylo dosaženo zahrnutím druhého plemene, bull teriér, segregující pro stejné dvě alely (Karlsson et al., 2007). Srovnání haplotypů alel S a s w s kandidátní oblastí pro bílou skvrnitost o velikosti 100 kb odhalilo 124 sekvenčních polymorfismů, z nichž všechny byly lokalizovány v nekódujících oblastech (Karlsson et al., 2007). To prokázalo, že fenotyp extrémně bílé srsti je kontrolován jednou nebo několika regulačními mutacemi. Tato hypotéza je silně podpořena skutečností, že barevné plotny na bílých skvrnitých psech vykazují normální pigmentaci. To naznačuje, že varianty MITF u psů primárně ovlivňují migraci a přežití melanocytů během vývoje, ale nemají žádné nebo pouze malé účinky na zralé melanocyty ve vlasovém folikulu; pigmentace chlupů tedy vyžaduje expresi proteinu MITF (Widlund, 2003). Další analýza těchto 124 polymorfismů vedla k vytvoření krátkého seznamu čtyř kandidátních mutací v promotoru MITF-M nebo v jeho okolí a jeden v exonu MITF-1B umístěném před MITF-M. 30

První z nich je pro psy specifický krátký rozptýlený nukleotidový element (SINEC-Cf element), který se nachází asi 3 kb proti směru od počátečního místa transkripce MITF-M. Vložení SINE se vyskytovalo pouze u psů, kteří vykazovali extrémně bílou skvrnitost (s w /s w ) nebo zbarvení piebald (s p /s p ), a chybělo u psů se zbarvením Irish spotting (s i /s i ) a u psů bez bílých skvrn (S/S), (Karlsson et al., 2007). Tato velká souvislost mezi vložením SINE a extrémní bílou skvrnitostí a ostatními fenotypy byla potvrzena v následné studii založené na 324 psech ze 45 plemen, ačkoli bylo zaznamenáno několik výjimek (Schmutz, 2009). Druhá mutace má označení SNP#21 a je umístěna zhruba 1,2 kb proti směru od počátečního místa transkripce MITF-M, což je vysoce konzervovaná oblast. S alelami pro bílou skvrnitost na tomto lokusu je spojena alela A. Kandidátní třetí mutací je variabilní délkový polymorfismus (Lp) nacházející se přibližně 100 bp proti směru od počátečního místa transkripce MITF-M. Lp představuje řetězec alel, které se opakují, lišící se v délce u různě skvrnitých psů, zároveň je Lp u plemen s bílými znaky delší, proto se Lp dělí na LpWhite, ten se vyskytuje u psů s alelami sp, si a sw, a LpSolid vyskytující se u psů bez bílých skvrn. Poslední čtvrtou mutací je delece 12 bp v exonu 1B (Exon1B_del), která byla nalezena u všech jedinců s extrémní bílou skvrnitostí a u psů se zbarvením piebald, ovšem nalezla se i u 4 ze 76 heterozygotních psů bez bílých skvrn. Tato studie ukázala, že alely pro extrémní bílou skvrnitost a zbravení piebald sdílejí stejné varianty sekvencí pro polymorfismy SINE, SNP#21, Lp i Exon1B_del, což znamená, že fenotypové rozdíly mezi oběma alelami musí vysvětlit další varianty sekvencí (Karlsson et al., 2007). MITF byl zřejmý kandidátský gen, protože kóduje transkripční faktor, který kontroluje vývoj a migraci melanocytů (Levy et al., 2006; Steingrímsson et al., 2004). MITF má devět alternativních promotorů, které produkují více isoforem exprimovaných v různých tkáních. Isoformy jsou známy čtyři: MITF-M, MITF-A, MITF-C, MITF-H. Jednotlivé isoformy se navzájem od sebe liší v poslední aminoskupině na exonu 1, působí na vazbu DNA a ovlivňují aktivaci transkripce. Častější MITF-A obohacuje retinální pigmentový epitel oka, MITF-M inhibuje funkci melanocytů, MITF-C a MITF-H mají minimální výskyt a není zcela přesně jasná jejich funkce. Všechny isoformy sdílejí sekvenci zakódovanou exony 2-9, ale mají jedinečné aminokyseliny v jejich N-koncích, které jsou určeny odlišnými prvními exony. Existuje jasná konzervace u savců u tohoto genu, neboť některé z izotopů MITF exprimovaných 31

u člověka a myši byly rovněž identifikovány u psů (Tsuchida et al., 2009), včetně isoformy MITF-M specifické pro melanocyty. Výzkum Karlsson et al. (2007) prokázal, že genetické markery v blízkosti promotoru MITF-M specifického pro melanocyty vykazují největší souvislost se skvrnami. MITF-M, obsažený v buňkách specifických pro melanocyty, má alternativně sestřižený exon 6A, který se skládá z inzerce 6 aminokyselin (18 bp) alanin, cystein, isoleucin, fenylalanin, prolin a threonin (Amae et al., 1998, Yasumoto a kol., 1998). Existují dva typy MITF-M a jsou shodné s výjimkou přítomnosti nebo nepřítomnosti inzerce těchto aminokyselin (Yasumoto et al., 1998). Označení použité pro rozlišení mezi těmito dvěma formami je MITF-M+ pro formu s inzercí a MITF-M- pro formu bez inzerce (Goding, 2000). Bismuth et al. (2007) předpokládají, že MITF-M+ a MITF-Mmají různé účinky. Zdá se, že MITF-M+ inhibuje syntézu DNA nebo je antiproliferativní, zatímco MITF-M- má malý nebo žádný takový účinek. Obr. 20 Agarózový gel vykazující produkt PCR formy MITF-M, která zahrnuje exony 5 a 6 mrna připravené z kůže psů. Všechny tři vzorky od různých psů (2 australští ovčáci a 1 samojed) zahrnují 18 bp známý jako exon 6A, který rozlišuje formu M +, stejně jako formu M, ve které chybí. (https://academic.oup.com/jhered/article/100/suppl_1/s66 /889589) Existoval předpoklad, že alely s p, s i a s w nebyly vytvořeny třemi nezávislými mutacemi, ale že představovaly haplotypové účinky v důsledku různých kombinací kauzálních polymorfismů. Jednoduchý opakovaný polymorfismus ukázal rozsáhlou rozmanitost u psů s bílými skvrnami, ale nevyskytoval se u psů bez bílých skvrn. Toto zjištění bylo neočekávané, neboť se předpokládalo, že alela S je divokého typu. Data naznačují, že jednoduchý opakovaný polymorfismus byl cílený při selekci psů během 32

domestikace a formování plemen. Také byl hodnocen význam tří polymorfizmů asociovaných s MITF-M s Luciferázovým testem a byl nalezen přesvědčivý důkaz, že jednoduchý opakovaný polymorfismus ovlivňuje aktivitu promotoru. Alely s p, s i a s w spojené s bílými skvrnami vykazovaly nižší aktivitu promotoru ve srovnání s alelou S. Následně vyvstala otázka, zda jednoduchý opakovaný polymorfismus ovlivňuje kooperativitu mezi transkripčními faktory, které se váží na obou stranách opakování. Genetický i funkční důkaz tak ukazuje, že jednoduchý opakovaný polymorfismus je klíčovým regulátorem bílých skvrn u psů (Baranowska Körberg et al., 2014). Výsledky výzkumu v kombinaci s předchozím charakterizováním MITF lokusu u psů silně naznačují, že alely s p, s i a s w nevznikají třemi nezávislými mutacemi, ale spíše odrážejí haplotypové účinky způsobené různými kombinacemi několika příčinných regulačních mutací vzniklých během domestikace a formování plemen. Tato interpretace je podpořena poznatkem, že existuje rozsáhlejší sekvenční podobnost mezi haplotypy alel s p, s i a s w než mezi kterýmkoli z nich a haplotypy spojenými s alelou S (Karlsson et al., 2007). Například alely s w a s p mohou sdílet všechny čtyři zkoumané kandidátní mutace. MITF u psů je dalším příkladem evoluce alel následnou akumulací více kauzálních mutací, ke kterým dochází u domácích zvířat na lokusech vlivem silné selekce (Andersson, 2013). Studie rovněž poskytla genetické a funkční důkazy, že Lp v promotoru MITF-M je jedním z příčinných polymorfismů. Jedná se pravděpodobně o nejdůležitější regulační mutaci, která způsobuje snížení transkripce MITF-M a následně ovlivňuje bílé skvrny u psů, jelikož ještě nebyl nalezen žádný překryv mezi Lp alelami pro bílou skvrnitost nebo plnou barvu u psů. Alely pro bílé skvrny měly delší C mononukleotidové opakování a všechny, s výjimkou těch, které se nacházely u dalmatinů, měly delší celkovou opakovanou oblast. Na počátku domestikace se jednalo o výběr proti divokým barvám, zatímco během formování plemene se jednalo o výběr pro barvu specifickou pro plemeno, jako jsou bílé skvrny u německých boxerů, nebo celoplášťová černá barva u labradorských retrívrů (Baranowska Körberg et al., 2014). Existuje také možnost, že delece 12 bp v exonu 1B je odvozená alela, která podporuje vznik bílých skvrn. Současná studie však ukázala, že žádný polymorfismus genu MITF nevykazuje úplnou shodu s fenotypem, ve skutečnosti inzerce v exonu 1B společně s Lp prokazuje nejvyšší spojitost se vznikem bílých skvrn. Zdá se, že delece je fixována u psů s extrémně bílou skvrnitostí a zbarvením piebald, ale vzácná nebo 33

nepřítomná u psů bez bílých skvrn a psů se zbarvením Irish spotting. Pro tento polymorfismus nebyly provedeny žádné funkční testy, protože se vyskytují v exonu a v předchozí studii padl závěr, že není zcela jasné, zda je tento exon funkční u masožravců (Karlsson et al., 2007). Nicméně nedávno zveřejněné údaje RNA sekvence (leden 2014, Broad CanFam3.1 / canfam3, http://genome.ucsc.edu) ukazují, že MITF exon 1B je transkribován u psů a byl nalezen v jednom transkriptu z krve a v jednom z plíce. Oba transkripty pocházejí z odvozené alely spojené extrémní bílou skvrnitostí a zbarvením piebald. To poukazuje na možnost, že delece 12 bp v exonu 1B může velmi dobře ovlivnit funkci genu MITF během vývoje melanocytů. Bílé skvrny u psů s extrémní bílou skvrnitostí a zbarvením piebald mohou být způsobeny kombinovaným účinkem mutací ovlivňujících transkripci MITF-M a kódující mutaci v exonu 1B (Baranowska Körberg et al., 2014). Luciferázový test ukázal, že varianty Lp spojené se zbarvením Irish spotting měly ještě nižší aktivitu promotoru MITF-M než varianty spojené s extrémní bílou skvrnitostí a piebald zbarvením, ačkoli tyto dvě alely způsobují rozsáhlejší bílé skvrny. To je však v souladu s interpretací, že alely genu MITF u psů nejsou vytvářeny jednotlivými mutacemi, ale kombinovaným účinkem více mutací v oblasti MITF. Důležitým rozdílem mezi Irish spotting a extrémní bílou skvrnitostí/zbarvením piebald je to, že pouze dvě poslední alely mají inzerci SINE před MITF-1M a deleci 12 bp v MITF-1B. Dalším zajímavým rozdílem mezi těmito dvěma skupinami alel je to, že homozygoti s i /s i vykazují vysoký stupeň symetrických bílých skvrn, zatímco homozygoti s p /s p a s w /s w vykazují asymetrické bílé skvrny. To pravděpodobně není způsobeno povahou základních mutací, ale spíše tím do jaké míry je funkce MITF ovlivněna během vývoje melanocytů, protože heterozygoti S/s w také vykazují symetrii bílých skvrn (Baranowska Körberg et al., 2014). Je pravděpodobné, že je původní klasifikace čtyř alel podle Little (1957) podceněna. Kombinace variability na Lp s jinými sekvenčními variantami v oblasti MITF možná vytváří větší alelickou rozmanitosti. Je stále otevřenou otázkou, zda je tato variabilita způsobena genetickou heterogenitou na MITF lokusu nebo genetickou variací na jiných lokusech ovlivňujících vývoj melanocytů. Bude nezbytné provést další genetické studie plemen psů, u kterých je velmi dobře charakterizován fenotyp bílé skvrnitosti. Oblasti chromozomů psů se zbarvením piebald nebo Irish spotting mohou obsahovat i jiné sekvenční varianty kromě těch, které byly vyhodnoceny v současných výzkumech (Karlsson et el., 2007). 34

4.4 Diverzita genu MITF u plemen psů Barsh (2007) naznačuje, že molekula MITF je pravděpodobně regulační mutací, která mění embryogenezi a vývoj plodu a potenciálně přežívání melanocytů. Karlsson et al. (2007) zahrnul do výzkmu u dalmatiny, u kterých se charakteristické malé skvrny/ tečky objevují teprve v prvních týdnech po narození a zjistilo se, že jsou homozygotní. Tyto údaje by naznačovaly, že alespoň některé melanocyty v bílých oblastech přežily až do dospělosti, ale dočasně jim bylo zabráněno nebo se jen se zpožděním projevuje pigmentace. Gen MITF byl zkoumán především u plemene kolie, australský ovčák, dobrman, německý boxer a bígl. Avšak výzkum Schmutz et al. (2009) objevil několik plemen například barzoj, anglický setr, papillon, Jack Russell teriér, velký i malý münsterlandský ohař a mnoho dalších, kde se vyskytují homozygoti pro SINE inzerci a mají náhodné bílé skvrny. Podle tohoto výzkumu se gen MITF projevuje u celé řady psích plemen, jsou ale potřeba další výzkumy. Dnes jsou již běžně dostupné komerční testy pro bílou skvrnitost. Testují se alely S a s p, test pro zbarvení Irish spotting se prozatím neprovádí, protože nejsou zcela známy varianty DNA, které způsobují tento typ skvrnitosti. Testování probíhá na základě hledání přítomnosti SINE inzerce. Jedinec homozygotní pro tuto inzerci se označuje jako ins/ins, heterozygoti se označují jako ins/del a jedinci bez inzerce del/del. Testy provádí například společnosti Paw Print Genetics, Animal Genetics UK a AnimaLabs. 4.5 Porovnání genu MITF u dalších druhů zvířat Existuje několik homologů k tomuto genu i u jiných druhů zvířat makak rhesus, tur domácí, myš domácí, potkan, kur bankivský, drápatka tropická, šimpanz učenlivý a člověk. Nejvíce prozkoumané jsou u myší a u lidí. U savců obecně MITF způsobuje hluchotu, u lidí škodlivé mutace MITF způsobují poruchy vidění a sluchu, včetně Waardenburgových a Tietzových syndromů, očního albinismu se senzorineurální hluchotou a kožních melanomů (Steingrímsson et al., 2004). Většina mutací hlášených u myší a lidí, které způsobují závažné pleiotropní účinky, jsou obecně mutace ztráty funkce ovlivňující kódovací oblasti. U laboratorních myší mají alely, které narušují protein MITF, obvykle vliv jak na melanocyty, tak na retinální pigmentový epitel; druhý typ buňky je důležitý pro správný 35

vývoj oka, což je důvod, proč u mnoha myší alely způsobují i mikroftalmii, kromě bílé skvrnitosti. Dále také u myší způsobuje Camurati-Engelmannovu chorobu, Waardenburgův a Tietzův syndrom a osteopetrózu. Zatím bylo u myší identifikováno 29 mutací MITF, které ovlivňují vývoj a funkci melanocytů v kůži, oči a vnitřním uchu. Některé varianty ovlivňují zrak tím, že snižují velikost očí (mikroftalmie) nebo způsobují poruchy sluchu v raném věku (Blake et al., 2011). 36

5 ZÁVĚR Pokrok ve vědě a potenciální přínos pro lidstvo často závisí na náhodných událostech. V biologii mezi náhodné příhody patří i mutace, které jsou již známé a neměnné nebo se spontánně objevují. Mezi ty spontánně se objevující patří i mutace genu MITF. Přestože výzkum tohoto genu trvá téměř sedm desetiletí, je zřejmé, že o tomto genu ještě není známo vše. Pravděpodobně existují nám neznámé mechanismy toho, jak MITF působí v mnoha buněčných typech, jejichž vývoj a funkce reguluje. Gen kóduje nejen jeden MITF protein, ale velkou rodinu isoforem, které se liší v sekvenci, posttranslačních modifikacích a expresi. Existuje domněnka, že MITF nevytváří dimery pouze se sebou, ale také se třemi příbuznými geny TCFE3, TCFEB a TCFEC, a že každý z nich má vlastní isoformy. Znalosti jsou stále omezeny na jiné partnerské proteiny nebo kofaktory interagující s MITF a jak tyto interakce mohou být ovlivněny posttranslačními modifikacemi. Odpovědi na to, jak jsou modifikace MITF regulovány aktivací signalizačních cest v různých typech buněk, vyžadují také další studie. Kromě toho je známo relativně málo informací o transkripční regulaci promotorů MITF, zejména těch, které fungují mimo linii melanocytů. Každý z výše uvedených parametrů řídí aktivitu MITF a na konci určuje, které cílové geny budou regulovány, a to zase určuje, zda buňky proliferují, migrují nebo se rozlišují během vývoje a provádějí své fyziologické funkce na konci svého buněčného vývoje. Mnoho těchto nevyřešených otázek nepochybně vyvolají další desetiletí výzkumu genu MITF. 37

6 PŘEHLED POUŽITÉ LITERATURY Andersson L. 2013. Molecular consequences of animal breeding. Curr Opin Genet Dev 23: 295 301 Anheiter H. The discovery of the microphthalmia locus and its gene, Mitf [online]. 2010 Sep 2. Dostupné z: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/pmc2964 399/ Baranowska Körberg, I., Sundström, E., Meadows, J.R.S., Rosengren Pielberg, G., Gustafson, U., Hedhammar, A., Karlsson,E. K., Seddon, J., Söderberg, A., Vila, C., Zhang, X., Akesson, M., Lindblad-Toh, K., Andersson, G., Andersson L. 2014. A Simple Repeat Polymorphism in the MITF-M Promoter Is a Key Regulator of White Spotting in Dogs. PLoS ONE 9(8): e104363. doi: 10.1371/journal.pone.0104363. Blake J.A., Bult C.J., Kadin J.A., Richardson J.E., Eppig J.T. 2011. The Mouse Genome Database (MGD): premier model organism resource for mammalian genomics and genetics. Nucleic Acids Res 39: D842 D848 Bowling S.A. Genetika psí barvy [online]. 2000 [cit. 2017-08-27]. Dostupné z: http://bowlingsite.mcf.com/genetics/genetics.html Clark L.A. et al. Genetic Basis for the Harlequin Coat Patterning in the Great Dane. Advances in Canine and Feline Genomics and Inherited Disease in Baltimore, MD from Sept. 23-25, 2010 Clark L.A., Starr A.N., Tsai K.L., Murphy K.E. Genome-wide linkage scan localizes the harlequin locus in the Great Dane to chromosome 9. Gene. 2008 Jul 15; 418(1-2):49-52.

Clark L.A., Tsai K.L., Starr A.N., Nowend K.L., Murphy K.E. A missense mutation in the 20S proteasome β2 subunit of Great Danes having harlequin coat patterning. Genomics. 2011 Apr; 97(4):244-8. Clark L.C., Wahl J.M., Rees C.A., Murphy K.E. Retrotransposon insertion in SILV is responsible for merle patterning of the domestic dog. The National Academy of Science, 2006 January, 103 (5) : 1376-81. Color Coat Genetics 101. CHAMPAGNE KENNELS [online]. 2014 [cit. 2018-01-02]. Dostupné z: http://champagnekennels.com/color-coat-genetics-101/ Dostál J., 2007: Genetika a šlechtění plemen psů. Dona, České Budějovice, 261s. Hedan, B, S. Corre, S. Dreano, T. Vilboux, B. Denis, F. Galibert, M.D. Galibert, C. Andre. 2005. Coat color in dogs: a powerful model for mammalian pigmentation. Pigment Cell Research 18 ( Supp. 1):65. Hertwig P. Neue Mutationen und Kopplungsgruppen bei der Hausmaus. Z. Indukt. Abstammungs- u. Vererbungsl. 1942;80:220 246. Hodgkinson C.A., Moore K.J., Nakayama A., Steingrimsson E., Copeland N.G., Jenkins NA, Arnheiter H. Mutations at the mouse microphthalmia locus are associated with defects in a gene encoding a novel basic-helix-loop-helix-zipper protein. Cell. 1993;74:395 404. Kaelin, C. B., Barsh, G.S. 2013. Genetics of Pigmentation in Dogs and Cats. Annual Review of Animal Biosciences 1: 125 156. DOI: 10.1146/annurev-animal-031412-103659.

Karlsson E.K., Baranowska I., Wade C.M., Salmon Hillbertz N.H., Zody M.C., Anderson N., Biagi T.M., Patterson N., Pielberg G.R., Kulbokas E.J. 3rd, Comstock K.E., Keller E.T., Mesirov J.P., von Euler H., Kampe O., Hedhammar A., Lander E.S., Andersson G., Andersson L., Londblad-Toh K. Efficient mapping of mendelian traits in dogs through genome-wide association. Nat Genet. 2007 Nov; 39(11):1321-8. Kerns J.A., Cargill E.J., Clark L.A., Candille S.I., Berryere T.G., Olivier M., Lust G., Schmutz S.M., Murphy K.E., Barsh G.S. Linkage segregation analysis of black and brindle coat color in domestic dog. Genetics, 2007 July, vol. 176, no. 3, str. 1679-89 Leegwater P.A., van Hagen M.A., van Oost B.A. 2007. Localization of White Spotting Locus in Boxer Dogs on CFA20 by Genome-Wide Linkage Analysis with 1500 SNPs. Journal of Heredity 98: 549 552 Levy C., Khaled M., Fischer D.E. 2006. MITF: master regulator of melanocyte development and melanoma oncogene. Trends Mol Med 12: 406 414 Ostrander E. A., Ruvinsky A. The Genetics of the Dog. 2nd Edition. CABI, 2012. ISBN 9781845939403. Schmutz S.M. Spots and White Markings [online]. 2014 [cit. 2017-05-01]. Dostupné z: http://homepage.usask.ca/~schmutz/dogspots.html. University of Saskatchewan. Schmutz S.M. White Coat Color in Dogs [online]. 2016 [cit. 2017-05-01]. Dostupné z: http://homepage.usask.ca/~schmutz/white.html. University of Saskatchewan. Schmutz S.M., Berryere T.G.. 2007. Genes affecting coat colour and pattern in domestic dogs: a review. Anim Genet., 38 (6): 539-49.

Schmutz, S. M., Berryere, T. G., Dreger D. L. 2009. MITF and White Spotting in Dogs: A Population Study. J. Hered., 100 (suppl 1): S66-S74. DOI:10.1093/jhered/esp029. Schmutz S.M., Berryere T.G., Goldfinch A.D. TYRP1 and MC1R genotypes and their effects on coat color in dogs. Mammalian genome, 2002 July, vol. 13, no. 7, str. 380-7 Sponenberg P.D., Lamoreux L.M. Inheritance of tweed, a modification of merle, in Australian sphepherd dogs. Journal of heredity. Volume 76, Issue 4, 1 July 1985, Pages 303 304. DOI: 10.1093/oxfordjournals.jhered.a110097 Steingrimsson E., Copeland N.G., Jenkins N.A. Melanocytes and the microphthalmia transcription factor network. Annu Rev Genet. 2004;38:365 411. Strain G.M. 2004. Deafness prevalence and pigmentation and gender associations in dog breeds at risk. The Veterinary Journal 167: 23 32. Testování psů: Lokus M (Merle). GENOMIA: Genetic laboratory [online]. 2008 [cit. 2017-04-11]. Dostupné z: https://www.genomia.cz/cz/test/merle/ Tsuchida S., Takizawa T., Abe K., Okamoto M., Tagawa M. 2009. Identification of microphthalmia-associated transcription factor isoforms in dogs. The Veterinary Journal 182: 283 293 Wayne R.K., Ostrander E.A. 2007. Lessons learned from the dog genome. Trends Genet., 23(11): 557-67. Widlund H.R., Fisher D.E. 2003. Microphthalamia-associated transcription factor: a critical regulator of pigment cell development and survival. Oncogene 22: 3035 3041

Winkler P.A., Gornik K.R., Ramsey D.T., Dubielzig R.R., Venta P.J., Petersen-Jones S.M., et al. 2014. A Partial Gene Deletion of SLC45A2 Causes Oculocutaneous Albinism in Doberman Pinscher Dogs. PLoS ONE 9(3): e92127. DOI: 10.1371/journal.pone.0092127

PŘEHLED POUŽITÝCH ZKRATEK ASIP MC1R Agouti signal peptide Melanocortin 1 receptor CDB103 beta-defensin 103 TYRP1 Tyrosinase related protein 1 MLPH Melanophilin PSMB7 Proteasome subunit beta 7 SILV MITF Premelanosome protein Melanogenesis Associated Transcription Factor SLC45A2 Solute carrier family 45 member 2 TCFEB TCFE3 TCFEC bp kb Mb DNA cdna mrna SINE Lp Transcription factor EB Transcription factor E3 Transcription factor EC páry bází kilobáze megabáze deoxyribonukleová kyselina komplementární DNA mediátorová ribonukleová kyselina short interspersed nuclear elements (krátký rozptýlený nukleární element) length polymorphism (délkový polymorfismus)

PŘÍLOHY Příloha č. 1: Příloha č. 2: Tab. 1 Lokusy zbarvení srsti u domestikovaných psů Obr. 1 Výsledek porovnání nukleotidové sekvence mrna transkriptu MITF-202 s nukleotidovou sekvencí 20. chromozomu psa plemeno německý boxer (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov) Obr. 2 Pokračování Obr. 1 Výsledek porovnání nukleotidové sekvence mrna transkriptu MITF-202 s nukleotidovou sekvencí 20. chromozomu psa plemeno německý boxer (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov)

Příloha č. 1 Tab. 1 Lokusy zbarvení srsti u domestikovaných psů Lokus Gen Alela Fenotyp Skvrnitost S (Spotting) MITF S s i s p s w T (Ticking)? T t R (Roan)? R r Žádné skvrny Irish spotting Piebald spotting Extrémní bílá Tečkování Bez teček Kombinace bílých a barevných chlupů ve skvrnách Žádné pigmentované chlupy v bílých skvrnách Ředění barev A (Agouti) ASIP a y a w a t a s a B (Brown) TYRP1 B b s, b d, b c C (Tyrozináza) TYR C c Zbarvení žluté, sable, plavé Agouti zbarvení Pálení Zbarvení sedlo Recesivní černá Žádné ředění eumelaninu (černá srst) Ředění eumelaninu (srst játrová, hnědá, čokoládová) Žádné ředění feomelaninu (srst žlutá, sable, plavá) Albinismus D (Dilute) MLPH D Žádné ředění eumelaninu černé zbarvení

d E (Extension) MC1R E M E E G e G (Greying)? G g H (Harlequin) PSMB7 H h Ředění eumelaninu stříbrné, šedé zbarvení Melanistická maska Rovnoměrné rozložení eumelaninu v srsti, divoký typ zbarvení Zbarvení grizzle Recesivní žluté zbarvení Šedivění eumelaninu v důsledku stáří Žádné šedivění Vzor harlekýn na merle pozadí Žádný vzor harlekýn pouze merle zbarvení I (Intensity)?? Zesvětlení nebo ztmavení feomelaninu v srsti K (Black) CBD103 K B k br k y M (Merle) SILV M m Tw (Tweed)? Tw T tw + Černá srst Žíhání Žluté zbarvení Zbarvení merle Žádné merle Velké, jemné barevné plotny na merle pozadí Malé, vroubkované barevné plotny na merle pozadí

Příloha č. 2 Obr. 1 Výsledek porovnání nukleotidové sekvence mrna transkriptu MITF-202 s nukleotidovou sekvencí 20. chromozomu psa plemeno německý boxer (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov)