Protilátky třídy IgG proti Treponema pallidum v mozkomíšním moku Návod na použití ELISA testu Objednací číslo Protilátky proti Třída Ig Substrát Formát EI 2111-9601-LG Treponema pallidum IgG Ag-potažené mikrotitrační jamky 96 x 01 (96) Indikace: Nemoci spojované s Treponema infekcí: syfilis neboli lues. Princip testu: ELISA test umožňuje kvantitativní in-vitro stanovení lidské protilátky třídy IgG proti Treponema pallidum v mozkomíšním moku (cerebrospinal fluid-csf). Test pracuje na stejném principu jako pro určeni protilátek proti Treponema pallidum v lidském séru, ale kromě toho obsahuje kalibrační séra pro CSF diagnostiku. Diagnostický kit (souprava) obsahuje oddělené proužky mikrotitrační desky, každý s osmi jamkami, které jsou potaženy rekombinantními antigeny Treponema pallidum. V prvním reakčním kroku se paralelně v jamkách inkubují ředěné vzorky séra a mozkomíšního moku pacientů. V případě pozitivních vzorků, se specifické IgG (také IgA a IgM) protilátky navážou na antigeny. K detekci navázaných protilátek slouží druhá inkubace provedená s protilátkou proti lidským IgG značenou enzymem (enzymový konjugát), která je schopna vyvolat barevnou reakci. Určení koncentrace protilátek proti Treponema pallidum v mozkomíšním moku a sérech se měří pomocí kalibrační křivky vytvořené pomocí CSF kalibračních sér A až D. Jestliže jsou protilátky proti Treponema pallidum detekovány pouze v lidském séru, použijí se k vyhodnocení kalibrační séra 1 až 3 (viz kit EUROIMMUN Anti-Treponema pallidum ELISA(IgG); objednací číslo EI 2211-9601 G). Obsah kitu: EI 2211-9601-LG Testovací systém pro určení protilátek proti Treponema pallidum v mozkomíšním moku sestává z: - Kit Anti-Treponema pallidum ELISA (IgG); objednací číslo EI 2211-9601 G) - CSF kalibrační sérum A; 100 U (lidské IgG): 1 x 1,0 ml, připravené k použití, značeno tmavě fialově. - CSF kalibrační sérum B; 40 U (lidské IgG): 1 x 1,0 ml, připravené k použití, značeno fialově. - CSF kalibrační sérum C; 8 U (lidské IgG): 1 x 1,0 ml, připravené k použití, značeno světle fialově. - CSF kalibrační sérum D; 1 U (lidské IgG): 1 x 1,0 ml, připravené k použití, značeno slabě fialově. - Návod k provedení testů - Instrukce pro výpočet relativních CSF/sérum kvocientů. Uskladnění a stabilita: Diagnostický kit musí být skladován při teplotě mezi +2 o C až + 8 o C, nesmí být zmražen. Souprava, obsahuje-li všechny součásti neotevřené, vydrží až do vyznačeného data expirace. Upozornění: Užitá kontrolní séra jsou testována pomocí enzymoimunologických testů a nepřímých imunofluorescenčních metod na nepřítomnost HBsAG, anti-hcv, anti- HIV-1 a anti-hiv-2. Nicméně, se vším uvedeným materiálem se musí zacházet jako s potenciálně infekčně nebezpečným a musí se s ním zacházet velmi opatrně. Některé reagencie jsou
jedovaté (pufr, roztok chromogen/substrát). Vyvarujte se kontaktu s kůží. V případě kontaktu, omyjte kůži mýdlem a velkým množstvím vody. Příprava a stabilita reagencií Všechny reagencie se musí nechat před použitím vytemperovat na pokojovou teplotu. Potažené jamky: Připravené k použití. Uchopte zabalenou desku nad lepícím švem a trhnutím otevřete lepící ochranný obal. Neotvírejte dříve, než je mikrotitrační deska vytemperovaná na pokojovou teplotu, zabráníte tím zvlhnutí jednotlivých proužků. Ihned přemístěte jamky mikrotitrační desky, které nebudete používat, zpět do ochranného zalepovacího obalu a obal stiskem lepícího švu uzavřete. Zbylé jamky v již jednou otevřeném ochranném obalu se musí skladovat na suchém místě v rozmezí teplot +2 o C až + 8 o C, lze je použít po dobu nejméně dvou měsíců. Kalibrační séra: Připravena k použití. Séra se musí před použitím řádně promíchat. Enzymový konjugát: Připraven k použití. Konjugát se musí před použitím řádně promíchat. Vzorkový pufr: Připraven k použití Promývací pufr: Promývací pufr je dodáván 10 x koncentrovaný. Požadované množství pufru se čistou pipetou odebere ze zásobní lahve a zředí se 1 : 10 destilovanou vodou. Například, zřeďte 5 ml pomocí 45 ml vody pro 8 mikrotitračních jamek. Naředěný pufr je stabilní pro použití maximálně po dobu čtyř týdnů, je-li skladován při teplotě +2 o C až + 8 o C. Poznámka. Jestliže se v koncentrovaném pufru objeví krystaly, zahřejte ho na 37 o C a před ředěním ho promíchejte. Chromogen/substrátový roztok: Připravený pro užití. Uzavřete láhev ihned po použití, obsah je citlivý na světlo. Zastavovací roztok: Připravený pro užití Ředění séra a vzorků plasmy Vzorky séra a plazmy pro analýzu se ředí 1: 401 vzorkovým pufrem. Například, nejdříve vzorky sér pořádně promíchejte, potom přidejte 10 µl séra k 1,0 ml vzorkového pufru a dobře promíchejte (ředění 1 : 101). Poté přeneste 250 µl takto ředěného vzorku do 750 µl vzorkového pufru a opět řádně promíchejte (ředění 1 :401). Vzorky CSF: pro analýzu se ředí ve vzorkovém pufru. Například, nejprve vzorky CSF řádně promíchejte. Poté přidejte 100 µl CSF do 100 µl vzorkového pufru a opět řádně promíchgejte. (ředění 1 :2). Poznámka: Kalibrační séra jsou již naředěna a připravena pro přímé použití. Neřeďte je znovu.
Inkubace Inkubace vzorku: 1. Krok. Podle pipetovacího protokolu naneste 100µl CSF kalibračního séra nebo mozkomíšního moku do jednotlivých mikrotitračních jamek a inkubujte 60 minut při pokojové teplotě. Promývání: Vyprázdněte jamky a následně každou jamku promyjte třikrát pomocí 300µl naředěného promývacího pufru. Aby došlo k promytí, nechejte pufr v jamce působit alespoň třicet vteřin během každého promývacího cyklu, teprve potom jamky vyprázdněte. Po proběhnutí všech promývacích cyklů (provedených ručně nebo automaticky) kapalinu z jamek řádně odstraňte, vyklepejte promývací pufr poklepem desky otočené dnem vzhůru na filtrační papír. Inkubace konjugátu: 2. Krok. Napipetujte 100 µl enzymového konjugátu (peroxidasou značené anti-lidské IgG) do každé jamky mikrotitrační desky. Inkubujte po dobu 60 minut při pokojové teplotě. Promývaní: Vyprázdněte jamky. Promývání je popsáno výše Inkubace substrátu: 3. Krok. Napipetujte 100 µl roztoku chromogen/substrát do každé mikrotitrační jamky. Inkubujte po dobu 15 minut při pokojové teplotě ve tmě. Zastavení reakce: Napipetujte 100 µl zastavovacího roztoku do každé jamky mikrotitrační desky a to v tom samém pořadí, jako byl kapán chromogen/substrátový roztok. Měření: Fotometrické měření intenzity barvy by mělo být prováděno při vlnové délce 450 nm a referenční vlnové délce větší než 620 nm do 30 minut od přidání zastavovacího roztoku. Před měřením je nutné mikrotitrační desku pečlivě protřepat, tím se zajistí homogenní distribuce roztoku. Pipetovací protokol A B C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 CSF S3 S7 S11 A CSF CSF3 CSF7 CSF11 B CSF S4 S8 S12 C D E F CSF D S1 CSF1 CSF4 S5 CSF5 CSF8 S9 1:101 CSF9 CSF12
G H S2 CSF2 S6 CSF6 S10 CSF10 Výše uvedený pipetovací protokol je příkladem analýzy sér od 12 pacientů (S1 až S12) a 12 odpovídajících vzorků mozkomíšních moků CSF (vzorky C1 až C12). Pro CSF kalibrační séra (CA až CD) a vzorky sér od pacientů bylo provedeno jedno stanovení pro jedno ředění. Spolehlivost kalibrační křivky lze zvýšit užitím měření duplikátů každého vzorku. Jamky se mohou po jedné odlamovat z proužku. To umožňuje sestavit test s minimálními spotřebami všech reagencií. CSF kalibrační séra se musí inkubovat v každém novém testu a musí se určit nová kalibrační křivka. Séra a odpovídající CSF musí být testovány spolu v jednom testu. Výpočet výsledků: Pomocí tohoto testu lze stanovit kvocient CSF/sérum pro patogen-specifické protilátky LSQ path.-spec. (IgG). Další podrobnosti a požadavky na určení patogen- specifických protilátek v CSF se zjistí v kapitole Základy CSF diagnostiky. Křivka standardů, ze které se odečítá koncentrace protilátek ve vzorcích CSF a párových sér, se sestrojí vynesením hodnot extinkce získaných z měření 4 kalibračních sér, bod po bodu, proti odpovídajícím jednotkám. Následující vynesení je příkladem typické kalibrační křivky. Prosím, neužívejte tuto kalibrační křivku k určení koncentrací protilátek v sérech pacientů. Jestliže hodnoty určené pro vzorky leží vně měřeného rozsahu, postup je následující: 1) Jestliže hodnota získaná pro vzorek séra a/nebo CSF vzorek leží pod měřeným rozsahem (extinkce vzorku < extinkce vzorku kalibračního séra C D): ve vzorku nejsou detekovány žádné specifické protilátky a proto nelze vypočítat kvocient CSF/sérum 2) Jestliže hodnota získaná pro vzorek séra a/nebo pro vzorek CSF leží nad měřeným rozsahem (extinkce vzorku >extinkce kalibrátoru LA): vzorek musí být testován podle stejného schématu ve vyšším ředění. Například, použijte ředění séra 1 : 801 a ředění CSF 1 : 4. Nový ředící faktor musí být zakomponován i do výpočtu kvocientu CSF/sérum. 3) Výpočet kvocientu CSF/sérum lze získat pouze tehdy, jestliže hodnoty extinkce obou vzorků leží v měřeném rozsahu.
Kvocient CSF/sérum pro patogen-specifické protilátky LSQ path.-spec. (IgG) se vypočítá z následujícího vztahu: LSQ path.-spec. (IgG) = jednotky (CSF) x ředící faktor (CSF ) jednotky (sérum) x ředící faktor (sérum) Příklad výpočtu: - CSF kalibrační sérum A; 100 E: extinkce 1,053 - CSF kalibrační sérum B; 40 E: extinkce 0,468 - CSF kalibrační sérum C; 8 E: extinkce 0,116 - CSF kalibrační sérum D; 1 E: extinkce 0,023 - CSF 1:2; Extinkce 0,675,: 55 U - Sérum ; Extinkce 0,530 42 U LSQ path.-spec. (IgG) = 55 jednotek (CSF) x 2) = 6,531.10-1 42 jednotek(sérum) x 401 Základy CSF diagnostiky Během infekce centrální nervové soustavy Treponema pallidum narůstá množství patogenspecifických protilátek v mozkomíšním moku. Jestliže není infekce omezena na mozek a není-li disfunkce bariéry mezi krví a CSF, patogen-specifické protilátky jsou distribuovány jak v mozkomíšním moku, tak séru jako celkové IgG. V tomto případě, všechny imunoglobulíny v mozkomíšním moku pocházejí z krve. Pro detekci neurologické infekce je nezbytné rozlišit mezi intratekálně produkovanými protilátkami a protilátkami, které se do mozkomíšního moku dostaly z krve. Hodnota intratekálně produkovaných patogen-specifických protilátek je dána relativním kvocientem CSF/sérum LSQ rel. (synonymum pro index specificity protilátky). Tato hodnota je dána kvocientem části patogen-specifických protilátek v celkovém množství IgG protilátek v mozkomíšním moku a části patogen-specifických protilátek v celkovém IgG v séru. patogen-specifické IgG v CSF patogen-specifické IgG v CSF LSQ rel = celkové IgG v CSF patogen-specifické IgG v séru = patogen-specifické IgG v séru celkové IgG v CSF celkové IgG v séru celkové IgG v séru LSQ rel = LSQ path-spec (IgG) LSQ celkové (IgG)
Kvocient CSF/sérum patogenních specifických protilátek LSQ path.-spec (IgG) je v relaci k CSF/sérum kvocientu celkové IgG koncentrace LSQ total (IgG). Relativní LSQ hodnota nad 1,3 indikuje, že se v centrálním nervovém systému neprodukují žádné specifické protilátky. Relativní LSQ hodnota nad 1,5 indikuje, že se v centrálním nervovém systému produkují patogen specifické protilátky, jako odpověď na lokální infekci. Tvorba protilátek v centrálním nervovém systému se může vyskytovat za různých patologických podmínek, například při mnohočetném zánětu kostní dřeně nebo při encephalomyelitis disseminata (roztroušená skleróza). Jestliže tedy jexistuje důkaz o intratekální tvorbě IgG nebo o poruše bariéry krev-mozek, lze aplikovat na tyto případy Reiberův diagram (Reiber,1991) pro CSF/sérový kvocient. Tento ELISA test obsahuje instrukce k provedení testu: Protilátky IgA, IgG a IgM tříd v mozkomíšním moku: Instrukce pro výpočet relativních kvocientů CSF/sérum CSQ rel. Klinický význam Treponema pallidum je bakterie patřící do rodiny spirochaetaceae. Do této rodiny patří pět rodů: borelie, spirocheta, cristispira, treponema a leptospira. Treponema pallidum je infekční patogenní agens způsobující syfilis (lues), chronickou infekční chorobu. Přenos choroby se děje hlavně sexuálním kontaktem, ačkoli přenos krevní transfuzí či přes poranění, či diaplacentálně nelze vyloučit. Infekce se šíří mízními cévami a lymfatickými uzlinami do krve a krví dále do orgánů. Syfilis patří mezi všeobecně známé choroby a její průběh lze rozdělit do několika různých stadií. Primární a sekundární stádium je známo jako časná syfilis a terciární a kvarterní stádium jako pozdní stádia syfilis. Primární stádium: Typickým primárním projevem exogenní infekce Treponema pallidum je ohraničený výskyt vláknité eroze, či ztvrdliny v místě infekce, která se objeví tři týdny po infekci. Potom se může vyvinout vřed, či se zhorší vzniklé leze, vznikne tzv.tvrdý vřed.do týdne se zvětší mízní uzliny. Sekundární stádium: Kromě zvětšení mízních uzlin se u 90 % pacientů ukazují tzv. lokální či po celém těle rozmístěná poranění kůže, která mohou být symetrická, či se mohou projevit ve formě skvrn, pupínků, odlupující se kůže a/nebo vřídků. Převládající jsou projevy ve formě bradavičnatých útvarů. Dále se mohou vyvinout další poškození orgánů, například keratitida, irititida, hepatitida, vaskulitida a potíže myokardu. Sekundární stádium syfilitidy následuje klinicky se neprojevující (klidové) stádium (syphylis latens). Toto stádium může trvat i několik let. Terciární stádium: Typickými projevy syfililitidy ve třetím stádiu jsou velké pupeny a vředy na kůži a sliznicích. Vnitřními projevy syfilitidy jsou změny na různých orgánech, které se mohou projevit ve formě gumatózních a intersticiálních zánětů, perivaskulitidy, kardiovaskulární syfilis, neurosyfilis (v asymptomatické, či symptomatické formě), osteitis (zánět kostní dřeně) a periosteitis. Kvarterní stádium: Kvarterní projevy infekce Treponema pallidum ve formě neurosyfilitidy se mohou projevit až 30 let po nakažení. Neurosyfilis se projevuje v tomto stadiu nejprve vznikem primární formy progresivní paralýzy a tabes dorsalis (onemocnění míchy následující po infekci neléčené syfilitidy). Diagnóza syfilitidy je založená na klinických příznacích, odpovídajících stádiu nemoci, mikroskopické detekci infekčního agens (tmavé pole) a sérologických detekcích pomocí protilátek proti Treponema pallidum. Literární odkazy:
1. Oschmann P., Nuckel M., Wellensiek H.J., Hornig C.R., Dorendorf W.: Immunoblot as a Diagnostic Tool in Neurosyphilis. J.Lab.Med. 1997; 21(1):037-042. 2. Meyer P.M., Eddy T. Baughn R.E.: Analysis of Western Blotting (Immunoblotting) Technique in Diagnosis of Congenital Syphilis. J.Clin.Microbiol. Mar. 1994:629-633. 3. Lewis L.L., Taber L.H., Baughn R.E.: Evaluation of Immunoglobulin M Western Blot Analysis in the Diagnosis of Congenital Syphilis. J.Clin. Microbiol.Fed. 1990:296-302.