Využití HPLC v analýze potravin HPLC aplikace 1
HPLC aplikace 2
HPLC aplikace 3
Stanovení přirozených složek potravin HPLC aplikace 4
Lipidy Nasycené a nenasycené triacylglyceroly zpracování potravin Nízká stabilita triacylglycerolů obsahujících nenasycené mastné kyseliny Reakce se světlem a kyslíkem vznik hydroperoxidů ovlivnění chuti a kvality tuků Falšování přídavkem jiných tuků, použití ztužených tuků stanovení obsahu triacylglycerolů (př. falšování olivového oleje) Stanovení triacylglycerolů, hydroperoxidů, sterolů a vitaminů UV-DAD spektra stopy hydroperoxidů nasycené x nenasycené triacylglyceroly Př. nenasycené triacylglyceroly v olivovém oleji charakteristické spektrum Příprava vzorku extrakce petroletherem, rozpuštění v THF HPLC aplikace 5
Profil triacylglycerolů Starý slunečnicový olej Odezva při 240 nm hyroperoxidy HPLC aplikace 6
Analýza olivového oleje 280 nm konjugované dvojné vazby špatná kvalita oleje HPLC aplikace 7
Profil triacylglycerolů v olivovém oleji HPLC aplikace 8
Mastné kyseliny Stanovení nenasycených mastných kyselin C 4 -C 22 Př. máslo a margariny se liší v zastoupení kyseliny máselné v triacylglycerolech Stanovení jednotlivých mastných kyselin Hydrolýza (horký metanol a KOH), online derivatizace (bromid fenacylbromidu - zavedení chromoforu) -HPLC/UV HPLC aplikace 9
Složení tuku HPLC aplikace 10
Sacharidy Glukosa, galaktosa, rafinosa, fruktosa, mannitol, sorbitol, laktosa, maltosa, cellobiosa, sacharosa Nepřítomnost chromoforu nebo fluoroforu: nelze UV-VID nebo FLD RID hladiny mg/kg Elektrochemická detekce - hladiny µg/kg Příprava vzorku (dle matrice): odplynění, filtrace, extrakce, SPE přečištění HPLC aplikace 11
Stanovení sacharidů HPLC aplikace 12
Vitamíny Přírodní i syntetické Zlepšení nutriční hodnoty potravin Ve vodě rozpustné vitaminy: C, B 6, B 2, B 1, B 12 V tuku rozpustné vitaminy: E, D, A Hladiny µg/kg Labilní (světlo, teplo) UV, DAD kvalitativní i kvantitativní stanovení Elektrochemická detekce HPLC aplikace 13
UV detekce HPLC aplikace 14
Elektrochemická detekce Vitaminový přípravek HPLC aplikace 15
V tuku rozpustné vitaminy UV detekce HPLC aplikace 16
V tuku rozpustné vitaminy Elektrochemická detekce HPLC aplikace 17
Tokoferoly normální fáze HPLC aplikace 18
Stanovení tokoferolů v extraktu margarinu FLD detekce HPLC aplikace 19
Biogenní aminy Stanovení biogenních aminů Volné aminy přítomny v potravinách a nápojích (ryby, sýry,víno, pivo) Maximální přípustné hladiny MRL derivatizace HPLC aplikace 20
UV detekce Víno - po derivatizaci (dansyl chlorid) HPLC aplikace 21
Aminokyseliny Primární a sekundární aminokyseliny v jednom stanovení Stanovení původu masných výrobků falšování potravin Chirální stacionární fáze stanovení D a L formy Automatická online derivatizace -předkolonová, FLD detekce Příprava vzorku: hydrolýza (HCL, enzym) HPLC aplikace 22
STANOVENÍ AMINOKYSELIN Příprava hydrolyzátu pro stanovení aminokyselin - převedení aminokyselin, které jsou převážně vázané v bílkovinách, do formy volných aminokyselin Analytická koncovka přesnost, správnost, rychlost HPLC Separace - ionexy (automatické analyzátory aminokyselin) reverzní fázi - oktadecyl (C18), gradientová eluce Detekce a kvantifikace po předchozí deprivatizaci Derivatizace před i za kolonou, UV i fluorescenční detekce interní standard kompenzuje: nižší výtěžky derivatizační reakce ztráty při přípravě vzorku variabilní objem při nástřiku vzorku Jako vnitřní standardy se používají: norleucin, norvalin, α- aminomáselná kyselina, β-aminomáselná kyselina, γ-aminomáselná kyselina a homoserin, mohocystin, ethanolamin aj. HPLC aplikace 23
Derivatizační činidla o-phthaldialdehyd (OPA) 9-fluorenyl-methyloxycarbonyl chlorid (FMOC-Cl) Ninhydrin Dansylchlorid AQC (6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamát) Phenylisothiokyanát (PITC) HPLC aplikace 24
o-phthaldialdehyd (OPA) Reakce o-phthaldialdehydu za přítomnosti merkaptoethanolu s primárními aminokyselinami - rychlá, za laboratorní teploty Výhoda - sám nefluoreskuje, deriváty s aminokyselinami mají vynikající fluorescenci excitační maxima 340 nm, emisní maxima 450 nm Nevýhoda - reaguje pouze s primárními aminokyselinami HPLC aplikace 25
Separace OPA derivátů aminokyselin Chromatografické podmínky Gradient: solvent A: 15 mm Na2HPO4 ph 7,2/tetrahydrofuran (96+4); solvent B: 15 mm Na2HPO4/CH3OH/CH3CN (40+36+24). Průtok: 3,5 ml/min; program: 0-100 % B/A, 27 min. Kolona: Radial Pak 5 µm C18 cardtridge. HPLC aplikace 26
Porovnání vlastností jednotlivých derivatizačních činidel používaných k derivatizaci aminokyselin Charakteristika OPA FMOC-Cl Ninhydrin Dns-Cl AQC PITC Detekce FLD FLD UV UV (FLD) FLD UV Citlivost fmol fmol µmol pmol (nmol) fmol pmol Stabilita derivátu špatná dobrá -- dobrá dobrá střední Rychlost derivatizace rychlá rychlá malá malá rychlá střední Sekundární aminokyseliny ne ano ano ano ano ano Interference reagentu ne ano ne ano ano ano Interference matrice malý střední ne malý ne vysoký HPLC aplikace 27
Stanovení aminokyselin v pivu po derivatizaci (OPA) HPLC aplikace 28
Stanovení aminokyselin v bramborách (HPLC/FLD v reverzní fází, derivatizace OPA) %F 30 25 20 asparagin glutamin homoserin 15 10 kyselina asparagová kyselina glutamová 5 4 6 8 10 12 min Podmínky stanovení: analytická kolona: MERCK, LichroCART (250x4 mm), LiChrospher 100 RP-18 (5µm) analytická předkolona: MERCK, LichroCART (4x4 mm), LiChrospher 100 RP-18 (5 µm) teplota kolony: 30 C mobilní fáze: 0,01 M Na2HPO4; 0,013 mm Na2EDTA; methanol (Merck); ph 6,4 gradientová eluce: 0 15 min. 28-50 % methanolu 15-20 min. 50 % methanolu průtok: 0,7 ml/min nástřikový program: 10 μl derivatizačního činidla a 10 μl vzorku bylo vnástřikové smyčce desetkrát promícháno a po minutové prodlevě byl proveden nástřik na kolonu FLD detektor: λex = 340 nm; λem = HPLC 455 nm aplikace 29
D,L-alanin Chirální separace optických izomerů kolona : 25 cm x 4 mm stac. fáze : Nucleosil Chiral-1 eluent : 1 mm vodný roztok (CH3COO)2Cu (ph = 5,6) průtok eluentu : 1,2 ml/min teplota : 60 C detekce : UV 240 nm 1. D-alanin 2. L-alanin HPLC aplikace 30
Bílkoviny kolona : 25 cm x 9,4 mm stac. fáze : Zorbax GF-250 eluent : 130 mm NaCl + 20 mm KCl + 50 mm Na2HPO4 (ph = 7,0) průtok: 1 ml/min detekce : UV 210 nm 1. myší IgM, Mh = 900 000 2. hovězí thyroglobulin, Mh = 669 000 3. β-amylasa z brambor, Mh = 200 000 4. hovězí serum albumin, Mh = 66 000 5. kuřecí albumin, Mh = 45 500 6. hovězí RNAasa, Mh = 13 700 7. azid (tmax), Mh = 65 HPLC aplikace 31
Stanovení peptidů fytochromu V semenech ovsa rostoucích ve tmě HPLC/UV a MS detekce UV mapování HPLC aplikace 32
Stanovení peptidů fytochromu semena ovsa rostoucí ve tmě LC-MS TIC MS spektrum T12 a T58 HPLC aplikace 33
Deriváty purinu kolona : 30 cm x 4 mm stac. fáze : Nucleosil 50-5 eluent : methanol-voda-dichlormethan 47:17:936 (v/v/v) průtok: 0,8 ml/min detekce: UV 280 nm 1. kofein 2. theofyllin 3. theobromin HPLC aplikace 34
HPLC/UV analýza fytoestrogenů (po SPE přečištění) mau 25 20 A) Daidzein Genistein přečištění SPE 15 10 5 4 5 6 7 8 9 10 11 min mau B) 25 20 B) Daidzein Genistein bez přečištění 15 10 5 4 5 6 7 8 9 10 11 min HPLC aplikace 35
Stanovení glykoalkaloidů v rajčatech LC-MS/MS VWD1 A, Wavelength=205 nm (C:\HPCHEMLC\1\DATA\GA2005\02280023.D) VWD1 A, Wavelength=205 nm (C:\HPCHEMLC\1\DATA\GA2005\02280019.D) mau 250 Porovnání HPLC-UV a LC-MS/MS metody R40 56,8mg/kg RT:0,00-14,99 SM:15G 100 90 80 Tomatin 77,01 mg/kg RT: 11,30 MA: 190273064 SN: 1333 NL: 1,04E7 m/z= 1016,0-1017,0 F: + c ESI SRM ms2 1034,60@34,00 [ 1015,60-1017,60] MS R40 200 Relative Abundance 70 60 50 40 30 150 ST 37 µg/ml 20 10 0 100 90 80 Dehydrotomatin 2,51 mg/kg RT: 9,84 MA: 3442329 SN: 439 NL: 1,94E5 m/z= 1014,0-1015,0 F: + c ESI SRM ms2 1032,90@38,00 [ 1013,50-1015,50] MS R40 100 70 60 50 40 50 30 20 10 0 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Time(min) 1 2 3 4 5 6 7 8 min HPLC-UV a LC-MS/MS chromatogram vzorku R40 (zelené rajče) LC-MS/MS 20x nižšího LOD, lepší opakovatelnost a výtěžnost ve srovnání s HPLC-UV (vhodná pro zralá rajčata) Parametry metody HPLC-UV LC-MS/MS Analyty Tomatin Dehydrotomatin Tomatin Dehydrotomatin Opakovatelnost 4% 2,6% 3,1% Výtěžnost Detekční limit (LOD) Mez kvantifikace (LOQ) 85,0% (100 mg/kg) 2 mg/kg 6 mg/kg 94,4% (9 mg/kg) 82,9% (0,9mg/kg) Nelze stanovit 0,1 mg/kg HPLC aplikace 0,05 mg/kg 36 0,3 mg/kg 0,15 mg/kg
Potravinářská aditiva HPLC aplikace 37
Acidulanty a regulátory kyselosti Kyselina sorbová a citrónová Octová, propionová, jantarová, adipová, mléčná, fumarová, jablečná, vinná kyselina Ochucovadla - zintenzivnění chuti, maskování nežádoucích pachutí Pufrování kontrola ph (zpracování potravin, finální výrobky) Konzervační prostředky, zamezení růstu mikroorganismů Prevence žluknutí a hnědnutí antioxidační účinky Úprava viskozity pečených výrobků Přídavky při tavení - tavené sýry, cukrovinky Zlepšení barvy a chuti při konzervování masa Destilace s vodní parou, SPE HPLC UV/DAD HPLC aplikace 38
Bílé víno HPLC aplikace 39
Citrónová kyselina ve vodce HPLC aplikace 40
Antioxidanty HPLC aplikace 41
HPLC/UV-VIS (DAD) antioxidantů Žvýkačka HPLC aplikace 42
Konzervační prostředky Benzoová kyselina Sorbová kyselina Propionová kyselina Methyl-, ethyl-, propyl- estery p-hydroxy benzoové kyseliny (PHB.methyl, PHB-ethyl, PHB-propyl Inhibice růstu mikroorganismů Prodloužení životnosti potravin HPLC aplikace 43
HPLC/UV-VIS (DAD) HPLC aplikace 44
Umělá sladidla Acesulfam Aspartam Sacharin Nízkokalorická sladidla: nápoje Regulace hladin legislativa Možný toxický účinek HPLC aplikace 45
Aspartam On-column derivatizace, PR chromatografie Srovnání spektra derivatizovaného (OPA) a nederivatizovaného aspartamu HPLC aplikace 46
Syntetická barviva Použití: při zpracování potravin ve farmaceutickém průmyslu v chemickém průmyslu Zakrytí kazů, zvýraznění barvy potravin, zamaskování vlivů zrání a stárnutí Zlepšení přitažlivosti potravin Kontrola kvality, stanovení stopových koncentrací původních látek a degradačních produktů vývoj citlivých a selektivních analytických metod HPLC/UV-VIS -charakteristická maxima 400 nm (žlutá) 500 nm (červená) 600 700 nm (zelená, modrá, černá ) HPLC aplikace 47
Syntetická barviva v limonádě Spektra žlutého, červeného, modrého a černého barviva HPLC aplikace 48
Ochucovadla Zlepšení chuti potravin Nejčastěji použité látky: Esenciální oleje (silice), hořké látky, ostré pálivé látky Příklady: Lupulon a humuklon (hořké látky chmele) Vanilin Naringenin a hesperidin (hořké látky) Nejčastěji používaná metoda: GC (head-space, SPME) HPLC málo těkavé látky, tepelně nestabilní látky HPLC aplikace 49
Vanilin HPLC/UV, RP Kvalita extraktu vanilinu HPLC aplikace 50
Stanovení vanilinu v koňaku Identifikace srovnáním spekter HPLC aplikace 51
Hořké látky: hesperidin a naringenin Pomerančový džus HPLC/UV, RP HPLC aplikace 52
Rezidua a kontaminanty HPLC aplikace 53
Aplikace v reziduální analýze Analýza stopových množství sledovaných látek: -vysoká citlivost analytické metody -nízké meze stanovitelnosti (závisejí na citlivosti a šumu použitého detektoru, na zředění látky při průchodu kolonou a na rušivých vlivech daných složkami mobilní fáze či kontaminanty v mobilních fázích nebo v analyzovaném vzorku. Pro ideální (gaussovský) profil píku lze odvodit vztah mezi výškou píku, zaznamenaného detektorem, a koncentrací látky ve vzorku, dávkovaném do chromatografu, Zlepšení citlivosti -ovlivnění faktorů na pravé straně rovnice, tak aby byla výška píku maximální. Snížení mezí detekce -zvýšení odstupu signálu od šumu Snížení šumu - termostatovaná kolona a cela detektoru, použití čerpadel se stabilním hladkým průtokem, mobilních fází připravených z velmi čistých složek (zejména při gradientové eluci), důkladně odplyněných a přečištěním vzorku HPLC aplikace 54
Nejčastější aplikace Stanovení reziduí léčiv (stanoveny MRL) (dobytek drůbež, maso, mléko, vejce ; působení rezistence) Chemoterapeutika (sulfonamidy, antibiotika ) Antiparazitika hormony Mykotoxiny Polyaromatické uhlovodíky Pesticidy Příklady: HPLC aplikace 55
Rezidua léčiv ve vzorcích vajec HPLC/UV-VIS (DAD); RP HPLC aplikace 56
Stanovení reziduí tetracyklinů v mase HPLC/UV-VIS (DAD); RP LOD 0,1 mg/kg HPLC aplikace 57
Mykotoxiny: Fumonisiny - Fusarium monoliformae LC/MS MS spektra fumonisinu B1, 2, 3 HPLC aplikace 58
Identifikace fumonisinů ve vzorcích kukuřice, Následná konfirmace dle fragmentových iontů HPLC aplikace 59
Mykotoxiny HPLC aplikace 60
Mykotoxiny HPLC aplikace 61
Mykotoxiny Aflatoxiny HPLC UV/FLD HPLC aplikace 62
HPLC/FLD stanovení zearalenonu Porovnání přečištění pomocí SPE a GPC LU 250 FLD1 A, Ex=235, Em=440 (ZEARAL~1\ZEARAL~1\MNZ60302\SPIKE1A.D) A P Ř E Č IŠTĚNI SPE IMUNOAFINITNÍ SORBENT ZEA (32 ng) 16.181 200 150 100 50 1.1 91 2.5 62 LU 250 200 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 FLD1 A, Ex=235, Em=440 (ZEARAL~1\ZR200202\SARKA-I.D) B PŘEČIŠTĚNI GPC Bio Beads S-X3 16.072 ZEA (25 ng) Area: 1821.58 min 150 100 50 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 min Zearalenon manuálně x ASPEC SPE -výtěžnost 109 % 92 % SPE -opakovatelnost 31 % 3 % HPLC aplikace 63
Bisphenol A diglycidyl-ether (BADGE) LC/MS CID (collision induced dissociation) Extrakt z tuňáka; 0,2 mg/kg; 1 μl nástřik HPLC aplikace 64
Bisphenol A diglycidyl-ether (BADGE) LC/MS CID (collision induced dissociation) Extrakt ze sardinek; 20 mg/kg; 1 μl nástřik HPLC aplikace 65
Pesticidy Rezidua pesticidů ve vzorku salátu Carbendazim výtěžnost pouze 40% HPLC aplikace 66
Stanovení reziduí pesticidů ve vzorcích papriky HPLC aplikace 67
Karbamáty Nesystémové insekticidy HPLC/FLD Pokolonová derivatizace (OPA/NaOH) Materiál: ovoce, zelenina HPLC aplikace 68
Karbamáty Analýza standardů HPLC aplikace 69
Glyfosát systémový herbicid HPLC/FLD Pokolonová derivatizace Standard HPLC aplikace 70
FUNGICIDY oextrace z ovoce: dichlormetan Kolona: Nucleosil 7 C18 eluent : 5 g/l kys. mravenčí + NaOH o (ph 7,5) 40 % se 60 % methanolu o 1. thiabendazol 2. o-fenylfenol 3. Difenylamin 4. Ethoxychin 5. bifenyl HPLC aplikace 71
PAH HPLC/DAD UV spektrum HPLC aplikace 72
Parametry DAD a FLD stanovení HPLC aplikace 73
LOD: DAD, FLD HPLC aplikace 74
IDENTIFIKACE / KVANTIFIKACE - HPLC/FLD (po GPC přečištění) LU 180 160 140 120 100 80 60 FLD1 A, Ex=248, Em=374, TT (C:\DATAHP~1\DATA98\MT98OLEJ\025-2201.D) olej, 10 mg matrice v nástřiku l ex/em 216/336 nm 7.947 - Naph 10.457 10.658 - - Ace Fln 11.632 - Phe 12.625 - Ant 13.710 - Flt 14.623 - Pyr 17.147 - B[a]A 17.752 - Chr 19.858 - B[b]F 20.790 - B[k]F 21.852 - B[a]P 23.034 - DB[ah]A 24.182 - B[ghi]P 24.711 - I[cd]P 40 20 LU 500 0 0 5 10 15 20 25 30 FLD1 A, Ex=248, Em=374, TT (C:\HPCHEM\FLD154-4\DATA\MT00X904\043-4201.D) l ex/em 216/336 nm jablka, 250 mg matrice v nástřiku min 400 300 200 7.685 - Naph 10.281 - Ace 10.543 - Fln 11.616 - Phe 12.754 - Ant 13.915 - Flt 14.919 - Pyr 17.604 - B[a]A 18.499 - Chr 20.972 - B[b]F 21.810 - B[k]F 22.933 - B[a]P 24.274 - DB[ah]A 25.606 - B[ghi]P 26.294 - I[cd]P 100 HPLC aplikace 75 0 0 5 10 15 20 25 min