Regulace translace Bílkoviny - aminokyseliny 1. Translační aparát 2. Translace 3. Bílkoviny a jejich posttranslační modifikace 4. Lokalizace bílkovin v buňce a jejich degradace 5. Translace v mitochondriích a chloroplastech Aminokyseliny Základní složení všech aminokyselin REGULACE TRANSLACE BÍLKOVINY A JEJICH POSTTRANSLAČNÍ MODIFIKACE 1
Alanin Arginin Glutamová kyselina Glutation Glycin Hydroxyprolin Leucin Methionin Phenylalanin Prolin Serin Tryptofan Tyrosin Valin Aminokyseliny druhá nejjednoduší, nejčastěji zastoupenou (hydrofobní) často v aktivních místech bílkoviny (basická, hydrofilní) negativně nabitá, na povrchu bílkoviny (kyselá, hydrofilní) malý peptid, podíl na likvidaci volných radikálů nejdnodušší aminokyselina součást stěny buněk tvoří kostru proteinu (hydrofobní) esenciální, iniciace proteosyntézy, nejméně zastoupenou aminokyselinou nejčastější aromatickou aminokyselinou (vedlmi hydrofobní) hromadí se za stresu v aktivních místech pro fosforylace velmi málo zastoupena součást stěnových bílkovin drží bílkoviny pohromadě Bílkoviny, typy aminokyselin hydrofilní a ostatní Esenciální aminokyseliny: : histidin, isoleucin, leucin, lysin, methioneni (cystein), phenylalanin (tyrosin), treonin, tryptofan Bílkoviny, vytváření polymerních řetězcú Bílkoviny, typy aminokyselin hydrofobní 2
Primární struktura bílkovin peptidové vazby mezi aminokyselinami 3. Bílkoviny - primární struktura Peptidové, pevné kovalentní vazby = řetězení aminokyselin určené geneticky Bílkoviny primární struktura Peptidové vazby: mezi 2 aminokyselinami 20-30 aminokyselin = peptid vetší počty aminokyselin uspořádaných do vyšších struktur = polypeptid N- a C- terminílní konce jsou ve fyziologickém ph ionizovány R=reaktivní místa = navazování vedlejších řetězců 3. Bílkoviny - sekundární struktura Sekvence aminokyselin samouspořádávání nascentní bílkoviny Voda je polárním roztokem 3
2. translace elongace Bílkoviny, typy vazeb v polymérech Vazby mezi aminokyselinami na základě fyzikálně chemických interakcí Syntéza bílkovin na polysomech Aminokyseliny Bílkoviny Aminokyseliny = velmi malé biomolekuly, mw. 135 daltonů Jsou stavebními kameny bílkovin Kostra aminokyselin určuje primární sekvenci bílkovin Vedlejší řetězce určují biochemické vlastnosti bílkovin Polární řetězce směřují na povrch bílkoviny a mohou reagovat s vodným prostředím buňky 20-30 aminokyselin = peptid vetší počty aminokyselin uspořádaných do vyšších struktur = polypeptid Bílkoviny = proteiny (z řeckého slova proto = primární důležitost) První popis bílkovin: Berzelius 1838 První důkaz bílkoviny ve funkci enzymu: urea Sumner 1926 První bílkovinná sekvenace: insulin Sanger 1958 První strukturní studie bílkovin: hemoglobin, myoglobin Perutz a Kendrew 1958 4
Bílkoviny Bílkoviny jejich lokalizace: Zviditelnění GFP Bílkoviny, jejich velikost Cytochrom - bílkovina není statickou strukturou 5
Bílkoviny, typy vazeb v polymérech Bílkoviny, sekundární uspořádávání Alfa + beta šroubovice, beta list sekundární uspořádání dáno sekvencí aminokyselin, tvorba vodíkových můstků Beta list Vytváření disulfidických vazeb mezi 2 cysteiny Bílkoviny, typy vazeb v polymérech Bílkoviny, sekundární uspořádávání kovalentní vazba: jednotlivé aminokyseliny mezi sebou do primární struktury bílkovín nekovalentní vazba sekundární uspořádávání bílkovin, vazba reversibilní Reversibilita reakcí: závisí na rychlostních konstantách reakcí poměr konstant=relativní míra produktů, směr reakce 6
Bílkoviny, sekundární uspořádávání Bílkoviny, terciární a quarterní uspořádávání 2 dvoušroubovice spojené smyčkou Motiv typický pro vápník a DNA vazebné bílkoviny 1 alfa helix spojen s beta šroubovicí Motiv typický pro DNA vazebné bílkoviny 2 alfa šroubovice ovinuté kolem sebe Motiv typický pro transkripční faktory Bílkoviny, terciární a quarterní uspořádávání Bílkoviny, terciální a quarterní struktura Molekula hemaaglutininu Bílkovina složena ze 3 domén, jako membránová bílkovina N- glykosylována kyselinou sialavou 7
Bílkoviny, funkční uspořádání Bílkoviny, funkční proměnlivost a) Myosin je dimer, tvořený 2 identickými těžkými řetězy (bílé) a 4 lehkými řetězy (zelené a modré) b) trojrozměrný model hlavové domény Calmodulin je bílkovina se 4 šroubovicemi (EF1 EF4) a v každé z nich je Ca 2+ -vazebné místo Při zvýšení koncentrace Ca 2+ nad 5 x 10-7 M, se navazuje Ca 2+ na Calmodulin, mění jeho konformaci a Calmodulin se stává funkční bílkovinou ve fosforylaci Bílkoviny, jejich pohyb Bílkoviny, funkční proměnlivost Různé podoby struktury Ras, guanin nukleotid-vazebné bílkoviny (bílkovina v inanktivní podobe, s navázaním GDP ( modrá) a)uhlíková kostra bílkoviny b) Lokalizace všech atomů c) Beta listy (azurová) alfa šroubovive (červená) d) Povrch bílkoviny ve vodném prostředí, pozitivně nabité částice (šedá), negativně nabité (červená) Model spojující hydrolýzu ATP s pohybem myosinu podél aktinového vlákna 8
Bílkoviny, funkční proměnlivost Uspořádávání nascentních bílkovin Model katalytické podjednotky kinázy A v uzavřené funkční konformaci glycin rich sekvence uloví ATP ve štěrbině mezi doménami (b) Schéma otevřené a zavřené konformace v nepřítomnosti substrátu je otevřená, po vazbě substrátu se uzavírá, konformační změny bílkoviny vyvolané vazbou na substrát 3. Bílkoviny a jejich posttranslační modifikace 3. Bílkoviny a jejich posttranslační modifikace Cesta od nascentní podoby bílkoviny k správně lokalizované a plně funkční bílkovině Nascentní protein endoplasmatické retikulum prostorové uspořádávání postranslační modifikace oligomerizace třídění translokace lokalizace Proteiny endoplasmatického retikula obsahují chaperony: zvyšují rychlost s jakou proteiny získávají konečnou podobu udržují protein v kompetentním stavu zabraňují nežádoucím interakcím stabilizují proteiny 9
3. Bílkoviny a jejich posttranslační modifikace Chaperony: Chaperony a chaperoniny GroEL: komplex 14 identických 60kDa podjednotek GroES: komplex 7 identických 10 kda podjednotek tight = -ATP+ADP = uzavřená struktura s navázanou bílkovinou relax = +ATP=uvolnění bílkoviny Skupina I HsP70 kda blokování nežádoucích interakcí mezi aminokyselinami bílkovinného řetězce Skupina II HsP60 kda nezbytná doprovodná součást putování a translokace bílkoviny na místo místo určení Chaperoniny: GroEL + GroES: uspořádávání bílkoviny odstraňování špatně uspořádané bílkoviny Nascentní bílkovina Ko-translační modifikace bílkovin Získání translokační kompetence GroES/GroEL systém kompetence udělena: ko-translační N-glykosylací skládáním polypeptidu tvorbou disulfidických vazeb vytvářením oligomerů odstraněním signální sekvence Získání funkčnosti po translokaci 10
3. Bílkoviny a jejich posttranslační modifikace 3. Bílkoviny a jejich posttranslační modifikace modifikace bílkovin ko-translační nebo post-translační adice nebo delece stabilizují strukturu regulují enzymatické aktivity modifikují strukturu a tím i schopnost translokace slouží pro transport a lokalizaci proteinu v buňce ( pozor na možnost nežádoucích modifikací rekombinantních proteinů v heterologní buňce) nelze je odvodit z DNA sekvence modifikace typu deaminace, acetylace, fosforylace, glykosylace a oxidace mění molekulovou hmotnost proteinu a jsou detekovatelné na elektroforéze (srovnáním s nascentním nebo de-modifikovaným proteinem) 3. Bílkoviny a jejich posttranslační modifikace 3. Bílkoviny a jejich posttranslační modifikace N- a C- terminální modifikace = acylace, methylace, amidace Acylace (acetyl-, formyl-, pyroglutamyl-, myristyl-) ochrana proti aminopeptidázám Acetylace: Ser, Ala, Met na N-konci charakterizuje většinu rozpustných proteinů Formylace: Met, typická pro prokaryota Myristylace: modifikace N-terminálního glycinu nezbytnou součástí funkčnosti většiny signálních proteinů Nejčastější příčinou zablokování N-konce při charakterizaci proteinů N-terminální mikrosekvenací (postupným odbouráváním jednotlivých AMI z N- konce degradací podle Edmana, kdy je třeba volit metodu hmotnostní spektrometrie) 11
3. Bílkoviny a jejich posttranslační modifikace 3. Bílkoviny a jejich posttranslační modifikace N- a C- terminální modifikace = methylace, amidace Methylace charakteristické pro ribosomální proteiny metylovány jsou alfa-amino skupiny ala, met, lys různé metyltransferasy pro jednotlivé bílkoviny často metylace omezeny jen na část proteinové molekuly (u histonů, u DNA-vazebných bílkovin) Amidace modifikace AMI na C-terminálním konci Glykosylace glykoprotein = polypeptid + glykan N- a O-glykosylace, obě rozhodují o funkčnosti proteinů N-glykosylace glykan připojen na amid kyseliny asparagové Ko-translačně = začíná na nascentním proteinu v ER přesně regulovaným procesem významnou regulační funkci u rostlin, jejich exprese se podílí na nástupu jednotlivých etap ontogenese N-glykoproteiny nedílnou součástí strukturálních bílkovin stěny buňky 0-glykosylace glykan připojen na hydroxyl serinu / treoninu post-translační glykosylace až v Golgi a je reversibilní, cukerným zbytkem glukosaminem C-glykosylace, S-glykosylace velice řídké 3. Bílkoviny a jejich posttranslační modifikace N-glykosylace modifikace jednotlivých AMI v celém řetězci prenylace, adenylace, hydroxylace, oxidace, fosforylace, glykosylace Hydroxylace významná u stěnových proteinů -hydroxyproliny Polyglykanový komplex = glykosid dolicholdifosfátu Dolicholy: polyisoprenoly s řetězcem (n=14-24), tvořené nasycenými jednotkami alfa isoprenolu Fosforylace a glykosylace mají největší podíl na funkčnosti proteinu Fosforylace nejvíce zastoupeny O-fosforylace serinu, threoninu, tyrosinu až 1/3 cytosolických bílkovin fosforylována řada klíčových enzymů je funkčních ve formě fosforylované a neaktivní po obsazení téhož tripletu AMI O-glykosylací 12
3. Posttranslační modifikace - N-glykosylace I N-glykosylace úloha dolicholu 3. Postranslační modifikace- N-glykosylace II 3. Posttranslační modifikace bílkovin N-glykosylace N-glykosylace Mnohostupňový proces: Probíhá ko-translačně a UDP-aktivované cukry přiváděny do membránového systému pomocí lipidového nosiče dolicholu Dolichol je dlouhý řetězec isoprenů = polyisoprenoid, výrazně hydrofobní a víc jak jednou smyčkou je zanořen do membrány Po navázání dolicholu do membrány pevnou vazbou je fosfátovým můstkem navázán první glykan Tato makroergická vazba umožní vazby s asparaginem nascentní bílkoviny Syntéza oligosacharidu začíná na cytosolické straně a pokračuje na straně hrubého ER 13
N-glykosylace proměnlivost glykanové struktury 3. Postranslační modifikace - N-glykosylace manozové typy glykoproteinů: man5-9(glcnac)2 také u živočišnýcu buněk a u kvasinek komplexní typy glykoproteinů odlišné u rostlin: neobsahují kyselinu sialovou vazba xylozy a fukozy na manozovou kostru jen u rostlin a bezobratlých vazba fukozy je poslední úpravou a neexistuje bez xylozy vazba xylozy může být jedinou konečnou úpravou 3. Postranslační modifikace - N-glykosylace Asn X Ser/Thr: napojení oligosacharidového řetězce na nascentní bílkovinu 1. stupeň glykosylace na ER, 2. stupeň v Golgi 2. stupeň = konečná podoba: manozové nebo komplexní typy Komplexní typy: fukozy, xylozy, (ne kyselinu sialovou) Konečná podoba = anténové glykany 14
3. Postranslační modifikace - N-glykosylace 3. Postranslační modifikace typy n-glykoproteinů napojení glykanu má: nepřímý účinek stabilita proteinu přesnost prostorové orientace ochrana před agregací ochrana před proteolyzou transport buňkou přímý účinek syntéza biologicky aktivní molekuly = syntéza biologicky aktivních glykanových anten Výskyt: glykoproteiny buněčné stěny sekreční proteiny Funkce: rozpoznávací, receptorová, signální? stěnové bílkoviny - arabinogalaktany (AGP) molekuly obsahují až 95% glykanových zbytků druhově specifická vysoká rozdílnost v relativním obsahu i složení repetice Pro(Hyp), Ala, Ser(Tyr) funkce nejasná, jeví se jako nespecifická, prostředník mnoha vzájemných vazeb polymerů 3. Postranslační modifikace - N-glykosylace výskyt a funkce 3. Postranslační modifikace typy n-glykoproteinů stěnové bílkoviny exprese regulována vývojově, kódovány mnohočetnými genovými rodinami jejich relativní množství tkáňově a druhově specifické jsou kotranslačně N-glykosylovány, mají signální peptid 4 hlavní typy: glykoproteiny bohaté na hydroxyprolin (HRPG) glykoproteiny bohaté na prolin (PRPG) Lektiny glykoprotyeiny bez glykanu Lokalizovány ve vakuole v lipidových raftech na Golgi Mají schopnost se vázat na glykany jiných glykoproteinů Komplex glykoprotein-lektin- glykolipid = důležitá složka v procesu cell-cell-recognition 15
3. Postranslační modifikace - N-glykosylace 3. Posttranslační modifikace reversilní: O-glykosylace - fosforylace inhibitory syntézy N-glykoproteinů: inhibice napojení primárního oligosacgaridu TUNICAMYCIN (antibiotikum) DEOXYJIRIMYCIN (alkaloid) O-glykosylace a fosforylace: inhibice glukozidázy I a II CASTANOSPERMIN (alkaloid) inhibice manozidáz SWAINSONIN (alkaloid) Ser/Tre/Tyr Vratné, rychlé, funkční modifikace 3. Postranslační modifikace - N-glykosylace Účinek inhibitoru tunicamycinu = postupná deglykosylace castasnosperminu = přeglykosylováno 3. Posttranslační modifikace O-glykosylace - fosforylace 1. nejčastěji zjištěny 2 molekuly GLcNAc navázány na Ser/Thr 2. polypeptid mnohem stabilnější než glykan 3. O- glykosylace je dynamickým procesem 4. O a N glykosylace probíhají zřejmě na stejném místě v cis-golgi 5. nejznámější příklady: arabinogalaktany proteiny bohaté hydroxyprolinem RNA-polymeráza II (O-glykosylovaná --- fosforylovaná) extensiny: obsahují repetice Ser-(HYP)4 a Tyr-Lys-Tyr lektiny 16
Glykanové řetězce určují krevní skupiny Děkuji za pozornost Přijďte zase příště na kus řeči o translaci 17