Kathepsin C z krevniček rodu Schistosoma. Cathepsin C from blood flukes of the genus Schistosoma

Univerzita Karlova v Praze Přírodovědecká fakulta Studijní program: Biochemie Studijní obor: Biochemie Irena Oupicová Kathepsin C z krevniček rodu Schistosoma Cathepsin C from blood flukes of the genus Schistosoma Bakalářská práce Vedoucí závěrečné práce: Doc. RNDr. Jan Konvalinka, CSc Konzultant: RNDr. Michael Mareš, CSc. Praha, 2011 1

Prohlášení: Prohlašuji, že jsem závěrečnou práci zpracovala samostatně a že jsem uvedla všechny použité informační zdroje a literaturu. Tato práce ani její podstatná část nebyla předložena k získání jiného nebo stejného akademického titulu. V Praze, 2.6.2011 Podpis 2

Ráda bych poděkovala RNDr. Michaelu Marešovi, CSc. za cenné rady, vstřícnost a ochotu při vypracovávání bakalářské práce. Děkuji Mgr. Martinu Hornovi, CSc. a Mgr. Adéle Jílkové za pomoc při řešení praktických i odborných problémů, za jejich trpělivost a milý přístup. Dále pak Ing. Zdeňkovi Voburkovi za sekvenování proteinů a Doc. RNDr. Janu Konvalinkovi, CSc. za posouzení celé práce. Na závěr bych chtěla poděkovat své rodině za podporu a trpělivost během celého studia. 3

Abstrakt Krevničky rodu Schistosoma způsobují schistosomosu, jedno z nejzávažnějších parazitárních onemocnění. Kathepsin C (EC 3.4.14.1), trávicí enzym krevničky, je jedním z potenciálních cílů terapeutického zásahu. Tato cysteinová proteasa nebyla dosud detailně studována. V bakalářské práci byla detekována aktivita kathepsinu C v extraktu z dospělé krevničky střevní (S. mansoni) a krevničky jaterní (S. japonicum). Byla určena inhibiční specifita těchto enzymů s využitím sady selektivních inhibitorů savčích kathepsinů. Kathepsiny C byly vizualizovány na elektroforetických gelech pomocí proteomické fluorescenční značky. Dále byl připraven rekombinantní kathepsin C (SmCC) z krevničky střevní (S. mansoni) homologní expresí v kvasince Pichia pastoris. 4

Abstract Blood flukes of the genus Schistosoma cause schistosomiasis, one of the most serious parasitic diseases. Cathepsin C (EC 3.4.14.1) is a digestive enzyme of the blood flukes and a potential drug target. This cysteine protease has not been studied in detail yet. In this thesis, cathepsin C activity was detected in the extract of adult blood flukes S. mansoni and S. japonicum. Inhibitory specificity of these enzymes was determined using of set of selective inhibitors of mammalian cathepsins. Cathepsins C were visualized on SDS-PAGE gels with fluorescent proteomic probe. Furthermore, recombinant cathepsin C of S. mansoni (SmCC) was prepared by homologous expression in the yeast Pichia pastoris. (In Czech) 5

Seznam zkratek A 562 AMC BSA C1 C2 C3 CA-074 CHAPS cdna DMSO DNA dntp DTT absorbance při vlnové délce 562 nm 7-amido-4-methylkumarin hovězí sérový albumin Ala-Hph-VS-Ph Val-Phe-VS-Ph Nva-Hph-VS-Ph (L-trans-epoxysukcinyl(propylamid)-Ile-Pro-OH) 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propansulfonát DNA vzniklá zpětnou transkripcí mrna dimetylsulfoxid deoxyribonukleová kyselina deoxyribonukleotidtrifosfát dithiothreitol E-64 N-[N-(L-3-trans-karboxyoxirin-2-karbonyl)-L-leucin]-agmatin EDTA FY01 FY02 kda Hph LB MW NTA Nva pb ethylendiamintetraoctová kyselina Nva-Hph-VS-(CH 2 ) 10 -CO-Lys(Bodipy)-Tyr Pro-Hph-VS-(CH 2 ) 10 -CO-Lys(Bodipy)-Tyr kilodalton homofenylalanin Luria-Bertani molekulová hmota nitriltrioctová kyselina norvalin pár bazí 6

PEG Ph SDS SmCC SjCC TEMED Tris Tween 20 YNB YPD VS polyethylenglykol fenyl dodecylsulfát sodný kathepsin C z krevničky střevní (S. mansoni) kathepsin C L z krevničky jaterní (S. japonicum) N,N,N,N -tetramethylethylendiamin tris(hydroxylmethyl)aminomethan polyoxyethylensorbitanmonolaurát směs živin pro růst kvasinek směs kvasinkového extraktu, peptonu a dextrosy vinylsulfon 7

Obsah 1 Teoretická část... 10 1.1 Krevničky rodu Schistosoma... 10 1.1.1 Taxonomické zařazení krevniček... 10 1.1.2 Životní cyklus... 11 1.1.3 Schistosomosa... 12 1.1.4 Trávení krevničky... 15 1.2 Proteasy... 16 1.2.1 Cysteinové proteasy... 16 1.2.1.1 Struktura cysteinových proteas rodiny papainu... 16 1.2.1.2 Biosyntéza a aktivace cysteinových proteas rodiny papainu... 17 1.2.1.3 Aktivita a specifita cysteinových proteas rodiny papainu... 17 1.2.1.4 Parazitární cysteinové proteasy... 18 1.2.2 Kathepsin C... 19 1.2.2.1 Výskyt a funkce kathepsinu C... 19 1.2.2.2 Struktura kathepsinu C... 19 1.2.2.3 Biosyntéza a aktivace kathepsinu C... 20 1.2.2.4 Aktivita, specifita a inhibitory kathepsinu C... 21 1.2.2.5 Kathepsin C z krevničky... 22 2 Cíl práce... 23 3 Materiál a metody... 24 3.1 Materiál... 24 3.1.1 Buněčný a biologický materiál... 24 3.1.2 Chemikálie... 24 3.1.3 Přístroje a vybavení... 25 3.2 Experimentální metody... 26 3.2.1 Příprava extraktu z dospělých krevniček... 26 3.2.2 Značení vzorků fluorescenční značkou... 26 3.2.3 Stanovení koncentrace proteinů... 26 3.2.4 Měření enzymových aktivit... 26 3.2.5 Stanovení účinnosti inhibice... 27 3.2.6 Transformace kvasinek Pichia pastoris... 27 3.2.7 Exprese SmCC v P. pastoris... 29 3.2.8 Gelová chromatografie... 29 3.2.9 Afinitní chromatografie... 29 3.2.10 Elektroforéza na polyakrylamidovém gelu v přítomnosti SDS... 30 3.2.11 Přenos proteinů z gelu na membránu a imunodetekce... 30 3.2.12 Určení N-koncové aminokyselinové sekvence... 31 4 Výsledky... 32 4.1 Identifikace kathepsinu C v extraktu z krevniček S. mansoni a S. japonicum... 32 4.1.1 Detekce aktivity kathepsinu C v extraktech z krevničky... 32 4.1.2 Inhibice aktivity kathepsinu C v extraktech z krevničky... 32 4.1.3 Vizualizace kathepsinu C afinitními značkami... 34 4.2 Příprava rekombinantního SmCC... 35 4.2.1 Transformace buněk P. pastoris a exprese SmCC... 35 4.2.2 Odsolení média pomocí gelové chromatografie... 36 4.2.3 Purifikace SmCC pomocí afinitní chromatografie... 37 4.2.4 Stanovení N-koncové sekvence SmCC... 38 5 Diskuze... 39 8

6 Souhrn... 41 7 Seznam literatury... 42 9

1 Teoretická část 1.1 Krevničky rodu Schistosoma Krevničky jsou medicínsky významný druh motolic. Některé z krevniček jsou lidskými parazity a způsobují nemoc zvanou schistosomosa, která je hned po malárii druhým nejvýznamnějším parazitárním onemocněním na světě. Nejznámějšími druhy jsou krevnička močová (Schistosoma haematobium), krevnička střevní (Schistosoma mansoni, viz obrázek 1 na straně 11) a krevnička jaterní (Schistosoma japonicum). 1.1.1 Taxonomické zařazení krevniček Fylogeneze kmenu Platyhelminthes je aktivní oblastí výzkumu v biologii bezobratlých. Proto se i taxonomie se často mění, zejména díky rozvoji výzkumu DNA. V dnešní době je často citována taxonomie podle Brookse a McLennanové (1), která je založena na morfologických znacích. Novější zařazení čerpají hlavně z molekulárních dat (2). Taxonomické zařazení dle (1): Říše: Podříše: Kmen: Třída: Podtřída: Řád: Čeleď: Rod: Animalia Metazoa Platyhelminthes Trematoda Digenea Strigeiformes Schistosomatidae Schistosoma Podtřída Digenea se vyznačuje tím, že její zástupci jsou všichni parazité, kteří se orientují hlavně na zažívací trakt. Během životního cyklu mají minimálně dva hostitele, z nichž první bývá téměř vždy měkkýš, velmi vzácně jím může být kroužkovec. Krevničky z čeledi Schistosomatidae se od ostatních čeledí řádu Strigeiformes odlišují tím, že nemají druhého přechodného hostitele a dospívají v krvi konečného hostitele (3). 10

1.1.2 Životní cyklus Životní cyklus všech druhů krevničky, které parazitují na člověku, zahrnuje pohlavní generaci dospělců v krevním systému konečného hostitele člověka a nepohlavní fázi v přechodném hostiteli sladkovodním měkkýši. Cyklus je schematicky znázorněn na obrázku 1. Obrázek 1. Životní cyklus krevničky střevní Krevničky rodu Schistosoma se od ostatních motolic liší výrazným pohlavním dimorfismem. Dospělé krevničky žijí v kapilárách krevního řečiště člověka v párech větší samci přidržují tenké samice ve žlábku na břišní straně těla zvaném canalis gynecophorus. Samice produkují vajíčka, jejichž mikroskopické množství slouží k diagnose schistosomosy, nemoci způsobené krevničkami. Množství vajíček závisí na druhu, krevnička močová produkuje denně 20 200 vajíček, krevnička střevní i více než 300. Většina vajíček prochází skrz cévní stěny do močového měchýře nebo do střeva a jsou spolu s močí nebo exkrementy odnášena z organismu. Vajíčka, která jsou vylučována a dostanou se do sladké vody, pomocí osmózy prasknou a uvolní se pohyblivá obrvená larva zvaná miracidium. Během následujících 8-12 hodin vyhledává miracidium vhodného mezihostitele, kterým je pro krevničku střevní plž rodu Biomphalaria, pro krevničku močovou plž rodu Bulinus. Poté miracidia proniknou skrz měkkou tkáň plže. Penetrace je ovlivněna mnoha faktory, například chemotaxí, teplotou vody, poměrem množství larev a plžů i přítomností ultrafialového záření. 11

Uvnitř plže ztrácí miracidium brvy a stane se z něj mateřská sporocysta, která dá vzniknout několika dceřiným sporocystám. Ty putují do trávicí žlázy plže, kde z nich po inkubační době vzniknou larvy cerkárie. Cerkárie mají rozeklaný ocásek a volně plavou ve vodě po dobu nejvýše 48 hodin. Při kontaktu s člověkem pronikají neporušenou kůží nebo sliznicí. Po vstupu do lidského těla ztrácí cerkárie ocásek a mění se na stadium zvané schistosomula. To proniká přes tkáně do žilního systému a dále je pasivně přenášeno krevním oběhem do plic. Z plic se dostává do jaterní portální žíly, kde roste a dospívá. Spárovaní dospělí červi se usazují v žilách v oblasti tenkého a tlustého střeva nebo urogenitálního traktu, kde samice kladou vajíčka (4). 1.1.3 Schistosomosa Schistosomosa, také nazývaná bilharziosa, je jedno z nejzávažnějších parazitárních onemocnění na světě. Je způsobeno zástupci rodu krevnička, nejčastějšími původci nemoci jsou krevnička střevní, krevnička močová a krevnička jaterní. Rozšíření těchto druhů je znázorněno na obrázku 2. A) B) C) Obrázek 2. Geografické rozšíření A) krevničky střevní (S. mansoni) B) krevničky močové (S. haematobium) C) krevničky jaterní (S. japonicum). Převzato z (5). Schistosomosou bylo v roce 2010 nakaženo více než 207 milionů lidí, zejména z chudých oblastí Afriky, Asie a Jižní Ameriky, kam byla nemoc zavlečena. Dalších 700 milionů lidí je 12

vystaveno riziku nakažení (6). Od ostatních parazitických infekcí se schistosomosa liší tím, že patogeneze je způsobena téměř výhradně vajíčky, nikoliv dospělými jedinci. Vajíčka se mohou hromadit v játrech, plicích a jiných orgánech, kde vyvolávají imunitní odezvu. Průběh onemocnění je obvykle možné rozdělit na tři fáze: Migrační, akutní a chronickou. Migrační fáze zahrnuje časový úsek od penetrace cerkárie až po produkci vajíček dospělce. Tato fáze je často bez symptomů, jen na počátku (cca po 24 hodinách) se může objevit vyrážka v místě průniku cerkárie, která však brzy zmizí. Akutní fáze se projeví, když krevničky začnou produkovat vajíčka (asi po 4-10 týdnech). Hostitelský organismus je vystaven různým schistosomálním antigenům, na což reaguje imunitní odezvou. Symptomy této fáze jsou zimnice a horečka, únava, bolest hlavy a svalů a průjmy. Chronická fáze je způsobena masivní produkcí vajíček. Usazují se a umírají v cílových orgánech, kde kalcifikují. V močovém měchýři způsobují vajíčka krevničky močové zánět, který je doprovázený krvácením. Vajíčka krevničky střevní a jaterní se usazují ve střevě, kde způsobují fibrózu střev následovanou bolestmi břicha a krvácivým průjmem. Po několika letech se objevují příznaky jako hromadění vody v těle, portální hypertenze a cirhóza jater (3). Příznaky schistosomosy se mohou snadno zaměnit se symptomy jiných nemocí. Přímá diagnosa se provádí zejména určením vajíček ve stolici nebo pomocí biopsie. Jako nepřímá diagnostická metoda se využívá imunoanalýza, rentgen nebo ultrazvuk. K léčbě se nejčastěji používá lék praziquantel, jehož struktura je znázorněna na obrázku 3. U červů vyvolává masivní příjem Ca 2+, kontrakce svaloviny a rozklad tegumentu. Je účinný proti všem druhům schistosomos a je dobře snášen lidským organismem vedlejší účinky nejsou významné a trvají jen krátce. Výhodou je i nízká cena léku. Nepříjemným trendem posledních let je stále častější resistence parazitů na léčivou látku (4,7). Obrázek 3. Chemická struktura praziquantelu. Dražší alternativou k praziquantelu je oxamniquine, který je účinný pouze proti krevničce střevní. Další možností jsou deriváty artemisinu, které se používají i jako lék proti malárii. Příprava této látky je ale dražší. Proto se hledají léky, které by šly snadno a levně syntetizovat. Experientuje se s trioxolany a alkyl-amino-alkan-thiosulfáty (8). 13

Jiným směrem se ubírá výzkum léků zacílených na konkrétní enzymy nezbytné pro přežití parazita. Tento výzkum je postaven na pochopení metabolických dějů v organismu parasita. Příkladem nové účinné látky je K11777 (viz obrázek 4), inhibitor kathepsinu B1, trávicí cysteinové proteasy krevničky (9). Obrázek 4. Chemická struktura K11777. Důležitým krokem k omezení šíření schistosomosy je prevence. Ta spočívá jednak v likvidaci mezihostitelů - plžů, tak i ve zlepšení hygienických podmínek a návyků lidí žijících v místě výskytu parazita (4). 14

1.1.4 Trávení krevničky Stádia krevničky, která parazitují na člověku, schistosomula a dospělí jedinci, získávají živiny z krve hostitele. Trávení probíhá ve střevě parazita a je zahájeno rozkladem erytrocytů pomocí hemolysinu. Uvolněné proteiny, zejména hemoglobin, jsou dále štěpeny kaskádou proteas obsažených ve střevě krevničky (10). Na rozkladu hemoglobinu se podílí hlavně proteasy cysteinové a aspartátové třídy. Nejdříve je hemoglobin rozštěpen na oligopeptidy pomocí endopeptidas (cysteinové proteasy kathepsin B1 a L1, L2, L3, aspartátová proteasa kathepsin D), oligopeptidy jsou dále štěpeny na dipeptidy a jednotlivé aminokyseliny pomocí exopeptidas (cysteinové proteasy kathepsin B a C, metaloproteasa leucinaminopeptidasa (LAP)). Zástupcem rodiny cysteinových peptidas je i asparaginyl endopeptidasa, která aktivuje kathepsin B1 (11). Proces trávení hemoglobinu je schematicky znázorněn na obrázku 5. Asparaginyl endopeptidasa Hemolysin Kathepsin B, L, D LAP, Kathepsin B a C hemoglobin oligopeptidy aminokyseliny a dipeptidy Obrázek 5. Schéma trávení červených krvinek enzymovou výbavou ve střevě krevničky. Upraveno z (11). Výše jmenované enzymy jsou obecně syntetizovány jako neaktivní zymogeny, což umožňuje regulovat jejich aktivitu a omezit ji na požadované místo působení. Jejich ph optimum leží ve slabě kyselé oblasti, což odpovídá ph v žaludku krevničky (11). 15

1.2 Proteasy Proteasy, také nazývané peptidasy, jsou enzymy katalyzující štěpení peptidové vazby. Štěpení může probíhat buď uvnitř polypeptidového řetězce (endopeptidasy), nebo na N- či C-konci (exopeptidasy) (12). Dle mechanismu účinku jsou peptidasy rozděleny do sedmi tříd: cysteinové, serinové, threoninové, aspartátové, asparaginové, glutamátové a metalopepridasy (13). 1.2.1 Cysteinové proteasy Cysteinové proteasy se vyznačují tím, že v aktivním místě mají katalytický pár aminokyselinových zbytků cysteinu a histidinu. Na základě sekvenční homologie se cysteinové proteasy dělí do rodin. Nejpočetnější a nejlépe prozkoumaná rodina je C1, známá také jako rodina papainu. V současné době je známo asi tři a půl tisíce homologických sekvencí těchto proteas (13). 1.2.1.1 Struktura cysteinových proteas rodiny papainu Proteasy rodiny papainu mají v aktivním místě vysoce konzervovanou dvojici aminokyselinových zbytků cystein Cys25 a histidin His159 (číslování papainu). Imidazol histidinu a thiolová skupina cysteinu tvoří thiolát-imidazolový pár. Obrázek 6 ilustruje, jak histidin, donor protonu, podporuje nukleofilitu thiolové skupiny cysteinu (12). Stabilizaci iontového páru dále podporuje například asparagin Asn175, asparagová kyselina Asp 158 nebo tryptofan Trp177 (14,15). Základem katalytického mechanismu je nukleofilní atak thiolové skupiny cysteinu na karbonylovou skupinu štěpené amidové vazby proteinu (16). Obrázek 6. Histidin podporuje nukleofilitu thiolové skupiny. Upraveno z (12). Proteasy papainové rodiny jsou většinou monomery s molekulovou hmotností mezi 20 a 35 kda. Výjimku tvoří savčí kathepsin C, který je homotetramer se složitější strukturou o molekulové hmotnosti kolem 200 kda, viz kap. 1.2.2.2 (17). Monomer je obecně složen 16

ze dvou domén, které jsou navzájem orientovány do tvaru písmene V. V L doméně převažují α-helixy, R doména je svinutá do β-soudku (18). Katalytický Cys25 se nachází v aktivním místě v dutině uprostřed obou domén. His159 je umístěn v pravé doméně naproti Cys35 (19). 1.2.1.2 Biosyntéza a aktivace cysteinových proteas rodiny papainu Kathepsiny jsou většinou syntetizovány jako preproenzymy. Tyto prekurzory se skládají z N-koncové signální sekvence, propeptidu a zralého enzymu. Signální sekvence umožňuje transport syntetizovaného proteinu přes membránu endoplasmatického retikula a poté je odštěpován. Propeptid je také zodpovědný za správné sbalení enzymu při syntéze a slouží jako přirozený inhibitor, který brání enzymu v hydrolýze během transportu. Během proteolytické aktivace je propeptid odštěpen (20) a to buď autokatalyticky v kyselém prostředí lysozomů, nebo trans-aktivací pomocí jiných enzymů, např. kathepsinu D (21). 1.2.1.3 Aktivita a specifita cysteinových proteas rodiny papainu Cysteinové proteasy rodiny papainu potřebují k dosažení optimální aktivity redukční, mírně kyselé prostředí (22). Většinou jsou endopeptidasy (kathepsin L, V, F, S, K, B); ačkoliv kathepsin B působí také jako dipeptidyl karboxypeptidasa. Kathepsiny s čistě exopeptidasovou aktivitou jsou kathepsin C, který působí jako dipeptidyl aminopeptidasa, kathepsin H s aminopeptidasovou aktivitou a nedávno popsaný kathepsin X (23), působící jako karboxypeptidasa nebo didpeptidyl karboxypeptidasa v závislosti na typu substrátu (24). Aktivní místo papainových proteas obsahuje čtyři vazebná podmísta, S2, S1, S1 a S2 (viz obrázek 7 na straně 18), kde dochází ke vzniku komplexu enzym substrát (24). Pouze S2 tvoří vazebnou kapsu, ostatní místa fungují jako vazebné povrchy, se kterými substrát reaguje postranními aminokyselinovými zbytky i hlavním polypeptidovým řetězcem (25). 17

Obrázek 7. Schematické znázornění interakce peptidového substrátu s vazebnými podmísty aktivního centra cysteinových proteas rodiny papainu. Upraveno z (12). 1.2.1.4 Parazitární cysteinové proteasy Do rodiny papainu patří i většina parazitárních cysteinových proteas, které hrají důležitou roli jak při vývoji a výživě parazitů, tak při průniku parazitů skrz tkáně a při jejich obraně proti imunitnímu systému hostitele (26). Vzhledem k tomu, jak jsou cysteinové protasy klíčové pro přežití parazita, stávají se slibným chemoterapeutickým cílem. Inhibicí těchto enzymů je možné dosáhnout úmrtí parazita a tím zabránit dalšímu šíření infekce (27). Trávicí cysteinové proteasy parazitů rodu Schistosoma jsou vzhledem k sekvenční homologii s lidskými lysozomálními kathepsiny nazývány rovněž kathepsinové proteasy (krátce kathepsiny) (28). 18

1.2.2 Kathepsin C Kathepsin C (EC 3.4.14.1) je také známý jako dipeptidyl peptidasa I (DPP-I). Tento enzym byl u savců objeven v roce 1948 vědci Gutmanem a Frutonem, nicméně sekvence cdna lidského enzymu byla popsána až v roce 1995 (28). 1.2.2.1 Výskyt a funkce kathepsinu C Kathepsin C je lysozomální cysteinová peptidasa rodiny papainu (29). Tento enzym je exprimovaný v řadě tkání, nejvíce ho obsahují plíce, ledviny, játra a placenta (30). Primární funkcí kathepsinu C je obecná degradace proteinů (31). Kromě toho se kathepsin C podílí také na aktivaci řady serinových peptidas. V cytotoxických T lymfocytech a NK buňkách kathepsin C aktivuje granzymy A a B, které jsou důležité pro zneškodnění buněk napadených virem (32). Důležitou roli při zánětlivých procesech hraje enzym žírných buněk chymasa, který je aktivovaný kathepsinem C (33). Neutrofilní granulocyty obsahují kathepsin G, pro jehož aktivaci je kathepsin C také nezbytný (34). Mutace DPP-I genu, které vedou keztrátě funkce enzymu, způsobují Papillon-Lefèvrův a Haim-Munkův syndrom. Nefunkčnost kathepsinu C vede k předčasné ztrátě chrupu pacienta (35). 1.2.2.2 Struktura kathepsinu C Kathepsin C je jediný zástupce papainové rodiny, který je aktivní ve formě tetrameru. Celková molekulární hmotnost tetrameru se pohybuje mezi 160 a 230 kda v závislosti na původu enzymu. Tetramer se skládá ze čtyř identických podjednotek. Každá podjednotka je složena z doplňkové domény, těžkého řetězce a lehkého řetězce (36). Krystalová struktura je uvedena na obrázku 8 na straně 20. Těžký a lehký řetězec tvoří katalytické jádro s L a R doménou, což je typické pro rodinu papainu. Doplňková doména však nemá v této rodině obdobu. Tato doména má strukturu β-soudku, který se skládá z osmi antiparalelních β-listů uspořádaných kolem hydrofobního jádra. Předpokládá se, že právě doplňková doména je zodpovědná za tvorbu tetrameru (37) 19

Vlásenková smyčka Aktivní místo Papainová doména Glykosylace Doplňková doména Obrázek 8. Krystalová struktura tetramerního uspořádání lidského kathepsinu C (kalotový model). Barevně jsou zobrazeny: doplňkové domény (červeně), katalytické (papainové) domény (modře), glykosylační místa (oranžově). Vlásenková smyčka (žlutě) je součástí doplňkové domény. Převzato z (17). 1.2.2.3 Biosyntéza a aktivace kathepsinu C Kathepsin C je syntetizován jako jednořetězcový neaktivní zymogen. Mezi N-koncovou doplňkovou doménou a těžkým řetězcem zymogenu se nachází aktivační peptid, který blokuje přístup do aktivního místa (38). Přenos do lysozomů se uskutečňuje manosa-6-fosfátovou cestou (39). Aktivace proenzymu je vícekrokový proces, který začíná odštěpením N-koncové doplňkové domény. Následuje odštěpení řetězce aktivačního peptidu a fragmentace na lehký řetězec a těžký řetězec. Po odstranění aktivačního peptidu je zpřístupněno aktivní místo enzymu. Aktivace prokathepsinu C je znázorněna na obrázku 9 na straně 21. Proteolytické aktivace kathepsinu C se účastní jiné proteasy, například endopeptidasy kathepsiny L a S (38). Tvorba oligomerní struktury probíhá nejprve vznikem dimerů ze dvou monomerních jednotek proenzymu; tyto dimerní podjednotky následně během aktivace dimerizují za vzniku homotetrameru (17). Interakce dimer-dimer se účastní volný cysteinový zbytek Cys331 (40). 20

Obrázek 9. Schéma aktivace kathepsinu C Při aktivaci zymogenu dochází k vyštěpení oblasti zvané aktivační peptid. Oblast zvaná doplňková doména zůstává součástí aktivního enzymu. 1.2.2.4 Aktivita, specifita a inhibitory kathepsinu C Kathepsin C vykazuje dipeptidyl aminopeptidasovou aktivitu a odštěpuje dipeptidy z N-konce peptidového nebo proteinového substrátu. Objemná doplňková doména blokuje vazebné podmísto S3, čímž zabraňuje endopeptidasové aktivitě. Doplňková doména zároveň působí jako kotva pro N-koncovou aminokyselinu substrátu (17). Substrátová specifita kathepsinu C je poměrně široká. Enzym odštěpuje dipeptidové fragmenty, pokud substrát neobsahuje pozitivně nabité aminokyselinové zbytky (arginin a lysin) na N-konci či prolin na kterémkoli konci štěpené vazby (29). Kathepsin C má ph optimum v rozsahu ph 5,0-6,0, aktivní je v rozmezí ph 3,5-7,0. Kathepsin C je jediný enzym rodiny papainu, který kromě redukčních podmínek vyžaduje pro optimální aktivitu také přítomnost chloridových iontů (41). Kathepsin C je inhibován látkami blokující thiolové skupiny, například kyselinou jodoctovou. Z proteinových inhibitorů cysteinových proteas je silně inhibován stefiny (42) a cystatiny (43). Specifickým inhibitorem je Gly-Phe-diazomethan (44). Nově vyvíjené inhibitory jsou například dipeptidylnitrily (45), tripeptidylfosfonáty (46) a dipeptidylvinylsulfony (47). 21

1.2.2.5 Kathepsin C z krevničky Kathepsin C krevniček zatím nebyl dostatečně prozkoumán. První cdna sekvence enzymu z krevničky střevní byla publikována v roce 1995. Sekvence vykazuje homologii s jinými papainovými proteasami. Ze srovnání se savčím kathepsinem C vyplývá, že kathepsin C krevničky také obsahuje doplňkovou doménu (48). Kathepsin C z krevničky střevní a jaterní ale neobsahuje cysteinový zbytek (Cys331), o němž se předpokládá, že napomáhá tvořit tetramerní strukturu (40). Aktivita kathepsinu C z krevničky střevní má ph optimum při ph 5,5 a je modulována chloridovými ionty (49). Aktivita kathepsinu C byla lokalizována v gastrodermis a gonádách dospělé krevničky (50). Kathepsin C z krevničky jaterní byl exprimován jako zymogen v hmyzích buňkách (51). Během exprese nedošlo k aktivaci enzymu, čímž připomíná lidský kathepsin C, který také není schopen se sám aktivovat. Kathepsin C z krevničky střevní bude dále označován jako SmCC, kathepsin C z krevničky jaterní bude označován jako SjCC. 22

2 Cíl práce Bakalářská práce se zabývá cysteinovou proteasou kathepsinem C, která slouží jako trávicí enzym krevničky střevní (S. mansoni) a krevničky jaterní (S. japonicum). Proteasy jsou perspektivním terapeutickým cílem při vývoji chemoterapeutik pro léčbu schistosomosy založených na inhibici trávení a metabolismu krevničky. Dílčí cíle praktické části bakalářské práce: 1. Detekovat kathepsin C v extraktu z krevničky střevní a krevničky jaterní, 2. Analyzovat inhibiční specifitu kathepsinu C v extraktu z obou druhů krevniček, 3. Vizualizovat kathepsin C pomocí fluorescenční afinitní značky, 4. Vypracovat postup pro expresi a purifikaci rekombinantního kathepsinu C z krevničky střevní. 23

3 Materiál a metody 3.1 Materiál 3.1.1 Buněčný a biologický materiál Buňky kvasinek Pichia pastoris, kmen X-33 Invitrogen, USA Lyofilizované dospělé červy krevničky poskytl Dr. C. Caffrey,ze Sandler Center for Drug Discovery, University of California San Francisco (USA). Vektor ppiczαa obsahují úsek DNA kódující kathepsin C krevničky střevní poskytla Mgr. A. Jílková z ÚOCHB AV ČR. 3.1.2 Chemikálie Enzymy: New England BioLabs, USA: Restrikční endonukleasa Sac I Peptidové substráty: Bachem, Švýcarsko: Gly-Arg-AMC Inhibitory: Ala-Hph-VS-Ph, Val-Phe-VS-Ph, Nva-Hph-VS-Ph (poskytl Dr. J. C. Powers, Georgia Institute of Technology, USA) Bodipy green DCG-074, FY01 a FY02 (poskytl Dr. M. Bogyo, Stanford University, USA) Sigma, USA: CA-074, E-64, EDTA, Ostatní chemikálie: Bio-Rad, USA: agarosa Biotinum, Německo: GelRed Nucleic Acid Gel Stain, 10,000x in water Fermentas, Lotyšsko: O GeneRuler 1kb DNA ladder, PageRuler Prestained Protein Ladder, 6x Orange Loading Dye Solution, Zip Ruler Express, DNA Ladder 1 a 2 Fluka, SRN: dimethylsulfoxid (DMSO), Invitrogen, USA: zeocin, YNB Lachema, ČR: chlorid sodný, chlorid vápenatý, azid sodný, dusičnan stříbrný, ethanol, hydroxid sodný, chlorid sodný, isopropanol, k. octová, k. chlorovodíková, methanol New England Biolabs, USA: pufr NEB č. 1, 2, 3 Pierce, USA: SuperSignal West Femto Chemiluminescent Substrate Serva, SRN: peroxodisíran amonný (APS) 24

Sigma, USA: azid sodný, biotin, hovězí serumalbumin (BSA), dithiothreitol (DTT), kys. ethylendiamintetraoctová (EDTA), glycin, imidazol, protilátku proti histidinovému haxapeptidu, Luria-Bertani agar (LB agar), Luria-Bertani médium (LB médium), dodecylsulfát sodný (SDS), sorbitol, N,N,N,N -tetramethyl ethylendiamin (TEMED), Tween 20, Tris báze, YPD agar, YPD médium, akrylamid, směs dntp, Sigma GelElute Gel extraction Kit (NA1111) Qiagen, SRN: Qiagen plasmid mini/maxi kit, QIAquick Gel Extraction Kit 3.1.3 Přístroje a vybavení Přístroje: Analytické váhy AE 163 Autokláv Labo Autoclave Blotovací zařízení Mini Trans-Blot Centrifuga Beckman J2-MI CCD kamera LAS 3000 Vakuová odparka Speed Vac Concentrator Ultrafree-MC Microcentrifuge filter, 0,45 μm Fluorescenční/absorbanční čtečka GENios Fluorescenční scanner Typhoon Horizontální agarosová elektroforéza Horizon 58 Lyofilizátor Freezone 6 liter ph metr ph Pracitronic MW 870 Sonikátor Soniprep 150 MSE Vertikální elektroforesa Mini Protean Spektrofotometr Heλios α Spektrofotometr Pye Unicam PU 8610 Mettler, Švýcarsko Sanyo, Japonsko Bio-Rad, USA Beckman, USA Fujifilm, Japan Thermosavant, USA Millipore, USA Tecan, Rakousko GE Healthcare Lifesciences, Švédsko Bio-Rad, USA Labconco, USA Pracitronic, Německo Hielscher, Německo Bio-Rad, USA Unicam, USA Philips, UK Kolony a nosiče: Sephadex G-25 Ni-NTA Superflow GE Healthcare Lifesciences, Švédsko Qiagen, USA Ostatní vybavení PVDF membrána Vektor ppiczαa Millipore, USA Invitrogen, USA 25

3.2 Experimentální metody 3.2.1 Příprava extraktu z dospělých krevniček K cca 50 µl zmražených lyofilizovaných červů krevničky S. mansoni (směs samců a samic) nebo S. japonicum (oddělené vzorky samců a samic) bylo přidáno 300 µl vychlazeného pufru 50 mm Na-acetát, ph 5,5. Směs byla homogenizována za chlazení na ledu pomocí skleněného homogenizátoru a poté sonikována na ledu 4 x 10 s. Homogenizovaná směs byla centrifugována (10 min, 15000 g, 4 C). K supernatantu byl přidán CHAPS do výsledné koncentrace 0,5 %. Supernatant byl přefiltrován pomocí Ultrafree-MC mikrocentrifigačního filtru, 0,2 µm (10 min, 5000 g, 4 C) a takto připravený extrakt byl zamražen v 100 μl alikvotech v -80 C. 3.2.2 Značení vzorků fluorescenční značkou K 10 µl extraktu byly přidány 4 µl směsi o složení 0,1 M Na-acetát ph 5,5, 0,1 mm pepstatin, 2,5 mm DTT a 1 µm roztok afinitní fluorescenční značky (FY01, FY02). Vzorek byl inkubován 1 h při 37 C. Poté byl přidán vzorkový pufr pro SDS elektroforézu a probíhala elektroforéza dle postupu v kapitole 3.2.10. Gel byl analyzován pomocí fluorescenčního skeneru Typhoon Imager s excitačním laserem o vlnové délce 532 nm a emisním filtrem propouštějícím vlnovou délku 550 nm. V případě blokování kathepsinu C pomocí specifického inhibitoru byla před přidáním směsi s afinitní fluorescenční značkou provedena preinkubace (15 min, 37 C) s 1 µm inhibitorem C1 (Ala-Hph-VS-Ph). 3.2.3 Stanovení koncentrace proteinů Stanovení koncentrace proteinů bylo provedeno metodou BCA. Byla použita komerční souprava Pierce BCA Protein Assay Kit. Kalibrační křivka byla sestavena ze standardních roztoků hovězího sérového albuminu o různých koncentracích v rozmezí 0-2 mg/ml. K 25 µl vzorku či standardů bylo přidáno do jamek mikrodestičky 200 µl činidla (činidlo A a činidlo B v poměru 50:1). Po inkubaci 30 min při 37 C byla měřena absorbance při vlnové délce 562 nm. Koncentrace proteinů ve vzorcích byla odečtena ze sestavené kalibrační křivky (A 562 proti koncentraci standardu). 3.2.4 Měření enzymových aktivit Enzymová aktivita kathepsinu C byla stanovena měřením fluorescence vznikající při štěpení substrátu značeného AMC (7-amido-4-methylkumarin). Enzymová měření byla 26

prováděna při 37 C pomocí fluorescenčního spektrofotometru Tecan. Uvolňování AMC bylo monitorováno měřením fluorescence při excitační vlnové délce 360 nm a emisní vlnové délce 465 nm. Aktivitní test byl prováděn v 96 jamkové destičce. Celkový objem jamky byl 100 μl. Do jednotlivých jamek mikrodestičky bylo pipetováno 20 μl testovaného vzorku a 60 μl aktivační směsi. Směs se promíchala a nechala inkubovat 10 min při 37 C. Poté bylo přidáno 20 μl substrátové směsi a bylo spuštěno proměřování fluorescence na přístroji. Složení reakční směsi: Substrát: 10 mm Gly-Arg-AMC v DMSO Aktivační směs: 100 mm Na-acetát ph 5,5, 2,5 mm DTT, 25 mm NaCl, 0,1% PEG 1500 Substrátová směs: 100 mm Na-acetát ph 5,5, 0,2 mm Gly-Arg-AMC 3.2.5 Stanovení účinnosti inhibice Při stanovení procentuelní účinnosti byl nejprve extrakt preinkubován 30 min s příslušným inhibitorem přidaným do aktivační směsi, poté byla změřena zbytková aktivita podle kap. 3.2.4. Účinnost inhibice v procentech byla vypočítána ze získaných počátečních rychlostí reakce pomocí vztahu: v i účinnost inhibice [% ] = (1 ). 100, v 0 kde v 0 a v i jsou počáteční rychlosti reakce bez inhibitoru resp. s inhibitorem. Výsledná koncentrace inhibitorů byla 1 µm kromě E-64, jehož výsledná koncentrace byla 10 µm. 3.2.6 Transformace kvasinek Pichia pastoris Příprava buněk P. pastoris 50 ml YPD média bylo zaočkováno kmenem X-33 kvasinek P. pastoris z misky s YPD agarem. Inkubace probíhala při 30 C za třepání (230 rpm) přes noc. Druhý den bylo 100-500 μl narostlé kultury převedeno do 500 ml nového YPD média a necháno růst přes noc do dosažení hodnoty A 600 cca 1,3-1,5. Poté byly buňky centrifugovány (5 min, 1500 x g, 4 C). Peleta byla resuspendována v 500 ml ledové sterilní vody a směs opět centrifugována (5 min, 1500 g, 4 C). Peleta byla resuspendována v 250 ml ledové sterilní vody a centrifugována (5 min, 1500 g, 4 C). Peleta byla resuspendována v 20 ml ledového 1 M sorbitolu a centrifugována (5 min, 1500 g, 4 C). K výsledné peletě byl přidán 1 ml ledového 1 M sorbitolu a buňky byly uchovány do použití na ledu. Používaná média: YPD médium: 1% kvasinkový extrakt, 2% pepton, 2% dextrosa YPD agar: YPD médium, 2% agar 27

Linearizace rekombinantního vektoru pomocí Sac I Rekombinantní vektor ppiczαa/smcc (plazmid ppiczαa obsahující insert zymogenu SmCC) byl štěpen pomocí restrikční endonukleasy Sac I v NEB pufru č. 1 *. Reakční směs obsahovala 10 μg DNA (vektor), 2,5 μl restrikčního enzymu Sac I, 8 μl NEB pufru č. 1, 0,8 μl BSA (10 mg/ml). Objem byl doplněn do 80 μl vodou. Směs byla inkubována při 37 C přes noc. Druhý den byla linearizovaná DNA přečištěna pomocí komerční soupravy Sigma GelElute Gel extraction Kit (NA1111). NEB pufr č. 1: 10 mm Bis Tris Propan-HCl, ph 7,0, 10 mm MgCl 2, 1 mm DTT * komerční název pufru dodávaného firmou New England Biolabs spolu s enzymy Horizontální agarosová alektroforéza Linearizace byla zkontrolována horizontální agarosovou elektroforézou. Agarosa byla rozpuštěna zahřátím v TAE pufru na výslednou koncentraci 1%. Po ochlazení na 60 C byl přidán Gel Red dle předepsaného ředění. Směs se nechala tuhnout v elektroforetické vaně s vloženým hřebenem. Do jamek vzniklých vyjmutím hřebenu se nanášel DNA standard a vzorky smíchané se vzorkovým pufrem. Elektroforetické dělení probíhalo při 120 V po dobu 15-30 min. Fragmenty DNA byly vizualizovány pod UV lampou při vlnové délce 302 nm (365 nm). Vzorkový pufr: 6x Orange Loading Dye Solution TAE pufr: 40 mm Tris-acetát, ph 8,0, 2 mm EDTA Molekulové standardy: zipruler Express DNA Ladder 1 a 2 Transformace elektroporací 5-10 μg přečištěné linearizované DNA bylo přidáno k 160 μl buněk P. pastoris. Tato směs byla pipetou přenesena do elektroporační kyvety a inkubována 5 min na ledě. Elektroporace byla provedena při 2 kv, délka pulsu byla 5 ms. Směs byla ihned po elektroporaci přenesena z kyvety do zkumavky s 1 ml ledového 1 M sorbitolu a inkubována 1-2 h při 30 C bez třepání. Poté byly elektroporované buňky (25, 100 a 200 μl směsi) rozetřeny na misky s YPDS/Z agarem a inkubovány 3-10 dní při 30 C, dokud na miskách nevyrostly kolonie. Narostlé kolonie byly přeneseny na misky s YPD/Z agarem pro získání samostatných kolonií. Používaná média: YPD médium: 1% kvasinkový extrakt, 2% pepton, 2% dextrosa YPDS/Z médium: YPD médium, 1 M sorbitol, 100 μg/ml zeocin YPD/Z agar: YPD médium, 2% agar, 100 μg/ml zeocin YPDS/Z agar: YPD médium, 1 M sorbitol, 2% agar, 100 μg/ml zeocin 28

3.2.7 Exprese SmCC v P. pastoris 2 ml BMG média byly zaočkovány kolonií P. pastoris transformovanou vektorem ppiczαa/smcc (z YPD/Z misky). Kultivace probíhala při 30 C 16-18 h za třepání (250 rpm) do dosažení hodnoty A 600 cca 2-6. Narostlá kultura byla centrifugována (5 min, 1500 g, laboratorní teplota) a peleta byla resuspendována v BMM médiu do konečné A 600 =1,0. V BMM médiu probíhala kultivace při 30 C a každých 12 h byl přidán methanol na koncentraci 0,5%. Exprese probíhala 3 dny od počáteční indukce methanolem, poté byly buňky centrifugovány (5 min, 1500 g, lab. teplota). Médium s exprimovaným proteinem bylo stočeno a lyofilizováno na objem 100 ml. Používaná média: BMG: 0,1 M Na-fosfát ph 6,0, 1,34% YNB, 4x10-5 % biotin, 1% glycerol BMM: 0,1 M Na-fosfát ph 6,0, 1,34% YNB, 4x10-5 % biotin, 0,5% methanol 3.2.8 Gelová chromatografie Odsolení média bylo prováděno na koloně Sephadex G-25. Kolona byla ekvilibrována destilovanou vodou. Lyofilizované médium z exprese (kap. 3.2.7) bylo přefiltrováno přes filtrační aparaturu a naneseno na kolonu. Průtok kolonou byl 2 ml/min a velikost sbíraných frakcí byla 10 ml. Průběh chromatografie byl sledován měřením absorbance při vlnové délce 280 nm a měřením vodivosti. Frakce obsahující proteiny byly spojeny a dále purifikovány pomocí afinitní chromatografie. Kolona: Sephadex G-25 (objem 470 ml, průměr 3,2 cm, výška 60 cm) 3.2.9 Afinitní chromatografie Purifikace proteinu byla provedena na afinitním nosiči Ni-NTA Superflow, na který se rekombinantní protein váže pomocí kotvy histidinového hexapeptidu (viz obrázek 10). Obrázek 10. Struktura Ni-NTA nosiče. Komplex Ni2+ a kyseliny nitrilotrioctové váže polyhistidinové sekvence aminokyselin. Převzato z (52). 29

1 ml nosiče Ni-NTA Superflow byl promyt na koloně vodou a ekvilibračním pufrem a byl přidán k 120 ml vzorku (proteinové frakce po odsolení na koloně Sephadex G-25, kap. 3.2.8). Směs byla inkubována 2 h na třepačce při 4 C a přenesena na fritu. Nosič byl promyt ekvilibračním pufrem, eluce probíhala vsádkově, opakovaně 10 x 1 ml elučním pufrem po dobu 2 min. Průběh purifikace byl vyhodnocen pomocí SDS elektroforézy (kap. 3.2.10). Nosič: Ni-NTA Superflow (Qiagen) Ekvilibrační pufr: 50 mm NaH 2 PO 4, 300 mm NaCl, ph 8,0 Eluční pufr: 50 mm NaH 2 PO 4, 300 mm NaCl, ph 8,0, 250 mm imidazol 3.2.10 Elektroforéza na polyakrylamidovém gelu v přítomnosti SDS Srážení vzorků acetonem K 100 µl vzorku bylo přidáno 400 µl 100% vychlazeného acetonu. Po inkubaci 30 min při 20 C byly vzorky centrifugovány (13000 g, 10 min, 4 C). Supernatant byl odsán a peleta byla vysušena na vakuové odparce SpeedVac při teplotě 70 C. K peletě byl přidán vzorkový pufr (15 µl) a směs byla inkubována 5 min při 100 C a nanesena na SDS elektroforézu. Vzorkový pufr: 100 mm Tris-HCl ph 6,8, 1% SDS, 4% mekraptoethanol, 0,02% Comassie Brilliant Blue G250, 24% glycerol SDS elektroforéza Provedení vertikální polyakrylamidové elektroforézy v přítomnosti 0,1% SDS vycházelo z postupu podle Laemmliho (53). Byly používány 15% polyakrylamidové gely o rozměrech 80 x 60 x 0,7 mm. Elektroforéza byla prováděna na přístroji Bio-Rad. Po skončení elektroforézy byl gel fixován 30 min v roztoku obsahujícím 45% ethanol, 10% kyselinu octovou. K barvení byl použit roztok Coomassie Brilliant Blue G250. 3.2.11 Přenos proteinů z gelu na membránu a imunodetekce Přenos proteinů z gelu na membránu Po provedení SDS elektroforézy byly 2 filtrační papíry, gel a PVDF membrána o velikosti gelu namočeny na 30 min v transferovém pufru. Po ekvilibraci byly navrstveny do blotovacího přístroje v pořadí: anoda, podložka, filtrační papír, membrána, gel, filtrační papír, podložka, katoda. Přenos probíhal 1 h za konstantního napětí 100 V. Poté byla membrána obarvena roztokem Coomassie Brilliant Blue G250 nebo metodou imunodetekce. 30

Imunodetekce komerční protilátkou proti histidinovému hexapeptidu Při imunodetekci byla membrána nejprve pro zablokování nespecifických interakcí inkubována v roztoku TTBS obsahujícím 10% odtučněné mléko a 1% PVP (1 h, 4 C). Poté byla opláchnuta v TTBS (3 x 10 min). Membrána byla inkubována v přítomnosti protilátky proti histidinovému hexapeptidu s navázanou křenovou peroxidasou v roztoku TBS (ředění 1:2000) po dobu 2 h při laboratorní teplotě. Po inkubaci byla membrána znovu promyta TTBS roztokem (3 x 15 min) a vystavena působení 1 ml komerčního substrátu pro peroxidasu SuperSignal West Femto Chemiluminescent Substrate. Následně byla membrána vizualizována na CCD kameře. Transferový pufr: 25 mm Tris-HCl ph 8,3, 192 mm glycin, 20% methanol TBS roztok: 10 mm Tris-HCl, ph 7,4, 0,15 M NaCl TTBS roztok: 10 mm Tris-HCl, ph 7,4, 0,15 M NaCl, 0,05% Tween 3.2.12 Určení N-koncové aminokyselinové sekvence Vzorky určené k analýze byly separovány pomocí SDS elektroforézy a převedeny na PVDF membránu (kap. 3.2.11). PVDF membrána byla barvena pomocí Coomassie Brilliant Blue G250. Po odbarvení 25% methanolem s 10% kyselinou octovou byl proužek membrány s proteinem vyříznut. Určování N-koncové aminokyselinové sekvence prováděl Ing. Z. Voburka na ÚOCHB AV ČR: Při automatickém Edmanově odbourávání N-koncových aminokyselin byl použit proteinový sekvenátor ABI Procise 491. Jednotlivé PTH-deriváty byly identifikovány pomocí RP-HPLC. 31

4 Výsledky 4.1 Identifikace kathepsinu C v extraktu z krevniček S. mansoni a S. japonicum 4.1.1 Detekce aktivity kathepsinu C v extraktech z krevničky Kathepsin C byl detekován měřením enzymové aktivity v kinetickém testu se specifickým fluorogenním substrátem savčích kathepsinů C Gly-Arg-AMC při ph 5,5 na fluorescenční čtečce. Aktivita kathepsinu C byla stanovena v extraktu S. mansoni (směs samic a samců) a extraktu samic resp. samců S. japonicum. U měření S. japonicum byla analýza aktivity provedena se stejným množstvím proteinu u samic a samců (proteinové množství bzlo určeno metodou BCA, kap. 3.2.3). Enzymová aktivita vztažená na jednotkové množství proteinu v testovaném extraktu je dále nazývána jako specifická aktivita. Analýza ukázala, že extrakt ze samic S. japonicum vykazoval cca 30x vyšší specifickou aktivitu kathepsinu C než extrakt ze samců. Extrakt z S. mansoni vykazoval cca poloviční specifickou aktivitu než extrakt ze samic S. japonicum. 4.1.2 Inhibice aktivity kathepsinu C v extraktech z krevničky Inhibiční specifita kathepsinu C v extraktu z S. mansoni a S. japonicum byla studována pomocí sady nízkomolekulárních a proteinových inhibitorů selektivních pro papainové proteasy nebo konkrétní savčí proteasy z této rodiny (viz tabulka 1). Tabulka 1: Přehled použitých inhibitorů a jejich cílových enzymů Inhibitor Chemické složení inhibitoru Cílové proteasy E-64 N-[N-(L-3-trans-karboxyoxirin-2-karbonyl)-L-Leu]- agmatin cysteinové rodiny papainu proteasy CA-074 L-trans-epoxysukcinyl(propylamid)-Ile-Pro-OH savčí kathepsin B C1 Ala-Hph-VS-Ph savčí kathepsin C C2 Val-Phe-VS-Ph savčí kathepsin C C3 Nva-Hph-VS-Ph savčí kathepsin C FY01 Nva-Hph-VS-(CH 2 ) 10 -CO-Lys(Bodipy)-Tyr kathepsin C FY02 Pro-Hph-VS-(CH 2 ) 10 -CO-Lys(Bodipy)-Tyr kathepsin C 32

Extrakt byl inkubován s jednotlivými inhibitory v souladu s efektivními koncentracemi dle literatury (54); výsledná koncentrace inhibitorů byla 1 µm kromě E-64, jehož výsledná koncentrace byla 10 µm. Následně byla stanovena zbytková aktivita kathepsinu C v kinetickém testu s fluorogenním substrátem Gly-Arg-AMC. Výsledky (viz obrázek 11 a obrázek 12) ukazují, že jak u S. mansoni tak u S. japonicum byla aktivita kathepsinu C částečně inhibována inhibitorem papinových proteas E-64 a zcela inhibován selektivními inhibitory savčích kathepsinů C Ala-Hph-VS-Ph (C1) a Nva-Hph-VS-Ph (C3) a fluorescenčními značkami FY01 a FY02. Inhibitor savčího kathepsinu C Val-Phe-VS-Ph (C2) zcela inhibuje SmCC, ale SjCC inhibuje jen z cca 50%. Inhibiční specifita je velmi podobná u samců a samic S. japonicum. 120 100 % zbytková aktivita 80 60 40 20 0 120 100 kontrola E-64 CA-074 FY01 FY02 C1 C2 C3 inhibitory Obrázek 11. Inhibiční aktivity kathepsinu C v extraktu z S. mansoni. Přehled požitých inhibitorů je uveden v tabulce 1 na str. 33. Aktivita kathepsinu C byla měřena s fluorogenním substrátem Gly-Arg- AMC při ph 5,5. Relativní hodnoty zbytkové aktivity jsou vztaženy k neinhibované kontrole. samci samice % zbytková aktivita 80 60 40 20 0 kontrola E-64 CA-074 FY01 FY02 C1 C2 C3 inhibitory Obrázek 12: Inhibiční aktivity kathepsinu C v extraktu ze samic resp. samců S. japonicum. Přehled požitých inhibitorů je uveden v tabulce 1 na str. 33. Aktivita kathepsinu C byla měřena s fluorogenním substrátem Gly-Arg-AMC při ph 5,5. Relativní hodnoty zbytkové aktivity jsou vztaženy k neinhibované kontrole. 33

4.1.3 Vizualizace kathepsinu C afinitními značkami Dílčím úkolem práce bylo identifikovat kathepsin C v extraktu z dospělých červů pomocí proteomické afinitní značky. U S. japonicum byly analyzovány zvlášť vzorky samic a samců, u S. mansoni se pracovalo se směsí obou pohlaví. Pro vizualizaci značeného kathepsinu C byl extrakt separován pomocí SDS elektroforézy a následně detekován na fluorescenčním skeneru (kap. 3.2.2). Extrakt byl před provedením elektroforézy inkubován s afinitní fluorescenční značkou FY01. Tato značka je ireverzibilní inhibitor specifický pro kathepsin C s navázanou fluorescenční skupinou Bodipy Green 530/550 (55). Značené proteasy jsou v gelu detekovány pomocí fluorescenčního skeneru při použití laseru o excitační vlnové délce 633 nm a emisního filtru propouštějícího vlnovou délku 670 nm. Touto metodou byly v extraktu detekovány 2 pruhy příslušející katalytické doméně kathepsinu C o MW cca 20 a 23 kda pro S. mansoni a MW cca 15 a 20 kda pro samce i samice S. japonicum (viz obrázek 13). Že se jedná skutečně o kathepsin C bylo ověřeno preinkubací extraktu se specifickým inhibitorem kathepsinu C Ala-Hph-VS-Ph (C1), který se ireverzibilně váže do aktivního místa enzymu, takže následně již nedochází k vazbě fluorescenční afinitní značky a pás příslušející kathepsinu C není při fluorescenční detekci na gelu identifikován (viz obrázek 13A, dráha 2; obrázek 13B, dráha 2 a 4). Pásy o molekulové hmotě vyšší než 23 kda, které nejsou citlivé k uvedenému vypínání, jsou pravděpodobně nespecificky značené proteiny. A) B) Obrázek 13: Detekce kathepsinu C v extraktu z S. mansoni a S. japonicum pomocí proteomické fluorescenční značky. Vzorky extraktu byly inkubovány s afinitní fluorescenční značkou FY01 specifickou pro kathepsin C a separovány na SDS elektroforéze. Značení bylo kontrolně blokováno v přítomnosti inhibitoru kathepsinu C Ala-Hph-VS-Ph (C1). Vizualizace byla provedena na fluorescenčním skeneru Typhoon. Standardy molekulových hmot jsou vyznačeny. A) S. mansoni (naneseno 30µg proteinu). Dráhy 1: Extrakt. 2:Extrakt inkubovaný s inhibitorem C1. B) S. japonicum (naneseno proteinu: samci 10 µg, samice 5 µg). Dráhy 1: Extrakt ze samců. 2: Extrakt ze samců inkubovaný s inhibitorem C1. 3: Extrakt ze samic. 4: Extrakt ze samic inkubovaný s inhibitorem C1. 34

4.2 Příprava rekombinantního SmCC Dílčím cílem práce bylo připravit proenzym kathepsinu C z krevničky S. mansoni (SmCC) rekombinantní expresí. Kvasinky Pichia pastoris byly zvoleny pro expresi SmCC, protože jako eukaryotní organismus zajišťují správný proces zrání rekombinantního proteinu, například sbalování a posttranslační modifikace. Výhodou je i nižší stupeň glykosylace rekombinantního proteinu v porovnání například s expresním systémem Saccharomyces cerevisiae. Používaný plasmid ppiczαa navíc obsahuje signální sekvenci α-faktoru, která umožňuje sekreci klonovaných proteinů do média, kam buňky P. pastoris sekretují jen málo vlastních proteinů. Vektor ppiczαa/smcc pro přípravu rekombinantního kathepsinu C z S. mansoni (SmCC) poskytla Mgr. A. Jílková. Obsahoval úsek cdna odpovídající SmCC proenzymu (obsahující aktivační peptid, doplňkovou doménu a katalytickou doménu) a sekvenci, jejímž přepisem vzniká na C-konci SmCC histidinový hexapeptid, čehož se dále využívá při purifikaci proteinu. 4.2.1 Transformace buněk P. pastoris a exprese SmCC Integrace požadovaného vektoru do chromosomální DNA P. pastoris probíhá na základě homologní rekombinace. Vektor určený k integraci musí být pro tento účel linearizován. Linearizace byla provedena restrikční endonukleasou Sac I, pro kterou je v plasmidu ppiczαa štěpící místo mimo klonovací oblast pro vložení insertu. Kontrola linearizace byla provedena pomocí agarosové elektroforézy (viz obrázek 14). bp 1 2 3 4 bp Obrázek 14. Kontrola linearizace vektoru ppicαa/smcc pomocí agarové elektroforézy Dráhy 1: zipruler Express DNA Ladder 1. 2: nerozštěpený plazmid. 3: rozštěpený plazmid. 4: zipruler Express DNA Ladder 2. 35

Linearizovaný rekombinantní vektor byl použit k transformaci kvasinkových buněk P. pastoris elektroporací. Elektroporované buňky byly rozetřeny na misky s YPD agarem obsahujícím zeocin, proti kterému nese plasmid ppiczαa rezistenci, aby proběhla selekce rekombinantních buněk. Narostlou samostatnou kolonií bylo zaočkováno BMG médium a probíhala kultivace za stálého míchání při 30 C do dosažení hodnoty A 600 cca 2-6. Poté byly buňky převedeny do BMM média, čímž byla indukována exprese. P. pastoris je methylotrofní kvasinka schopná metabolizovat methanol jako jediný zdroj uhlíku. Plasmid ppiczαa obsahuje gen pro alkoholoxidasu AOX1 a AOX1 promotor, který řídí expresi vloženého genu. Indukce exprese byla prováděna každých 12 hodin přídavkem methanolu. Buňky byly sklizeny po 3 dnech od začátku indukce. Plasmid ppiczαa obsahuje sekvenci kódující signální peptid α-faktoru S. cerevisiae, který umožňuje účinnou sekreci exprimovaného proteinu do média. 4.2.2 Odsolení média pomocí gelové chromatografie Po skončení exprese bylo médium centrifugováno, aby se odstranily buňky, přefiltrováno a supernatant byl zahuštěn lyofilizací na objem 50 ml z původních 1000 ml. Takto upravené médium bylo naneseno na chromatografickou kolonu s nosičem Sephadex G-25 ekvilibrovanou vodou. Průtok kolonou byl 2 ml/min. Byly sbírány 10 ml frakce, v nichž byla měřena absorbance při 280 nm a vodivost. Na obrázku 15 je vidět, že proteiny jsou ve frakcích 11 až 22 a byly odděleny od solí. Tyto frakce byly spojeny a purifikovány pomocí afinitní chromatografie na koloně Ni-NTA. Absorbance při 280nm 0,18 0,16 0,14 0,12 0,1 0,08 0,06 absorbace vodivost 90 80 70 60 50 40 30 Vodivost [ms/cm] 0,04 20 0,02 10 0 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 0 frakce po 10 ml Obrázek 15. Odsolení kultivačního média obsahujícího SmCC pomocí gelové chromatografie. Na kolonu Sephadex G-25 ekvilibrovanou vodou bylo naneseno koncentrované médium. Průtok kolonou byl 2 ml/min. Ve frakcích byla následně měřena vodivost a absorbance při 280 nm. 36

4.2.3 Purifikace SmCC pomocí afinitní chromatografie Pro purifikaci kathepsinu C bylo využito histidinového hexapeptidu (tzv. histidinová kotva) navázaného na C-konci SmCC a byla provedena afinitní chromatografie na koloně s nosičem Ni-NTA. Princip navázání polyhistidinu na kolonu Ni-NTA je znázorněn na obrázku 10 na straně 29. Spojené proteinové frakce po odsolení na koloně Sephadex G-25 byly inkubovány s nosičem Ni-NTA 2 hod při 4 C. Proteiny, které se nenavázaly na nosič, byly vymyty ekvilibračním pufrem. Eluce kathepsinu C byla provedena vsádkově, kolona bylo pětkrát po dobu 2 min promývána 2 ml pufru, který obsahoval 250 mm imidazol. Imidazol kompetuje s histidinem a je schopen vytěsnit navázaný protein. Průběh purifikace byl analyzován pomocí SDS elektroforézy a imunodetekcí protilátkou proti histidinovému hexapeptidu (viz obrázek 16). Z obrázku vyplývá, že pomocí afinitní chromatografie byl purifikován protein o molekulové hmotě cca 60 kda. Teoretická hodnota molekulové hmoty podle aminokyselinové sekvence prokathepsinu C je 49 kda (viz obrázek 17 na straně 38). Rozdíl v hmotách je pravděpodobně způsoben glykosylací. A B Obrázek 16. Analýza afinitní chromatografie na nosiči Ni-NTA pomocí SDS elektroforézy (A) a imunodetekcí protilátkou rozpoznávající histidinovou kotvu (B). Dráhy 1 a 3: vzorek nanášený na kolonu, dráhy 2 a 4: eluční frakce obsahující SmCC. 37