MIKROSKOPY Mikroskopická technika je neodmyslitelnou součástí praktické mikrobiologie a mikroskop patří k základnímu vybavení každé laboratoře. 1. Popis zařízení Mikroskop je vlastně soustava čoček o jedné optické ose. Skládá se z části mechanické a optické (obr. 1). K mechanické části náleží: stativ noha mikroskopu a nosič tubusu tubus stolek se svorkami na přichycení preparátu dva šrouby na nosiči tubusu mikrometrický a makrometrický, které umožňují posun stolku ve směru optické osy revolverové zařízení (revolverový měnič) umožňuje výměnu objektivů Obr. 1 Hlavní části mikroskopu se zdrojem světla Optická část má zajistit nejen zvětšení, ale hlavně rozlišení jemných detailů objektu. Tento úkol je realizován třemi soustavami čoček: objektivem zajišťujícím zvětšení a rozlišení, okulárem zajišťujícím zvětšení, kondenzorem zajišťujícím maximální osvětlení objektu. Optická část je dále doplněna osvětlovacím zařízením (světelný zdroj, zrcátko). - 1 -
Objektiv Závisí na něm jakost obrazu a je pro rozlišovací schopnost mikroskopu nejdůležitější. Jednotlivé typy objektivů se liší uspořádáním čoček (mohou být z různého materiálu a jsou kombinovány tak, aby korigovaly vady jednotlivých čoček, ze kterých jsou sestaveny tj. vady sférické a chromatické). Podle toho, jaké vady mají korigovat, rozeznáváme objektivy: achromatické (achromáty), apochromatické (apochromáty), planachromatické, planapochromatické. Na plášti objektivu jsou uvedeny parametry objektivu: zvětšení / numerická apertura (např. 100/1,4) korekce na délku tubusu mikroskopu / hodnota pro přípustnou tloušťku skla (např. 160/0,1) Schopnost rozlišit co největší detaily závisí na schopnosti objektivu zachytit co nejširší kužel paprsků, které procházejí objektem. Tuto vlastnost vyjadřuje numerická apertura A (obr.2). Vztah mezi numerickou aperturou a indexem lomu lze vyjádřit následujícím vzorcem: A = n * sin α/2 α... úhel svíraný paprsky vycházejícími z objektu, které jsou zachyceny objektivem n... index lomu prostředí Obr. 2 Numerická apertura U většiny objektivů hodnoty numerické apertury nepřesahují 1. Jsou to tzv. objektivy suché (kde mezi objektivem a preparátem je vzduch). Jelikož numerickou aperturu ovlivňuje prostředí mezi objektivem a preparátem a u vzduchu je n = 1, numerická apertura nemůže přesáhnout teoreticky hodnotu 1 (prakticky 0,96). Zvýšit numerickou aperturu lze pouze tím, že se zvýší index lomu prostředí mezi objektivem a preparátem použitím tekutého prostředí, jehož index lomu je přibližně stejný jako index lomu skla (podložního, krycího i čoček). Touto imerzí může být voda, parafínový olej, glycerol, kanadský balzám, ale nejčastěji cedrový olej (n = 1,51). Numerická apertura se pak teoreticky může zvýšit na 1,52 (prakticky na 1,4). Takové objektivy pak nazýváme imerzní. Imerzní objektivy mají zvětšení 100x. Numerická apertura spolu s vlnovou délkou světla určuje rozlišovací schopnost objektivu: a = λ/a a... nejmenší rozměr, který lze rozlišit λ... vlnová délka zdroje A... numerická apertura Pomocí numerické apertury lze vypočítat tzv. užitečné zvětšení mikroskopu. Je rovno 1000 násobné hodnotě apertury. - 2 -
Rozlišovací schopnost mikroskopu lze tedy zvětšit užitím světla o kratší vlnové délce a zvýšením indexu lomu prostředí mezi objektivem a preparátem (použitím imerze). Při konstantní vlnové délce denního světla dosáhneme maximální rozlišovací schopnosti tím, že použijeme objektiv s vysokou numerickou aperturou. Okuláry Jejich úkolem je zvětšit obraz vytvořený objektivem pro subjektivní pozorování okem. Skládají se ze dvou nebo více čoček a podle konstrukce rozlišujeme různé typy okulárů. Na plášti okuláru bývá uvedeno zvětšení (5x až 20x), index zorného pole S a typ okuláru. Objektivy vždy používáme s odpovídajícími okuláry. Při volbě okuláru bereme v úvahu pravidlo o užitečném zvětšení. Celkové zvětšení mikroskopu vypočteme, vynásobíme-li zvětšení objektivu zvětšením okuláru. Z toho vyplývá, že podle požadovaného zvětšení lze k danému objektivu vybrat vhodný okulár tak, aby nedošlo k překročení užitečného zvětšení. Pro imerzní objektiv (zvětšení 100x) s A = 1,25 je užitečné zvětšení 1250x. Doplňkový okulár tedy bude 12,5x. Slabší okulár nedovolí plně využít rozlišovací schopnost objektivu, silnější okuláry dávají prázdné zvětšení, které nezobrazí více detailů a spíše snižuje ostrost obrazu. Kondenzor Je to soustava dvou nebo tří čoček (s A = 1,2-1,4). Úkolem kondenzoru je soustředit co největší část světelných paprsků ze světelného zdroje na preparát. Kromě toho lze pohybem kondenzoru upravit numerickou aperturu kondenzoru. Při mikroskopování by hodnota numerické apertury objektivu měla být stejná s numerickou aperturou kondenzoru. Numerickou aperturu objektivu měnit nelze. Obecně platí, že při použití slabších objektivů je kondenzor snížen a irisová clonka stažena. Čím jsou silnější objektivy, tím má kondenzor vyšší polohu a clona je více rozevřena. Při práci s imerzními systémy je v některých případech třeba dát imerzi také mezi kondenzor a podložní sklo, neboť bez imerze nemá žádný kondenzor hodnotu numerické apertury větší než 0,9. 2. Osvětlení a seřízení mikroskopu Světelným zdrojem je zpravidla nízkovoltová žárovka s transformátorem pro regulaci intenzity osvětlení (zabudovaná do mikroskopu nebo umístěná v samostatné lampě). Světlo je kolektorem a kolektorovou clonou usměrňováno na zrcadlo mikroskopu nebo přímo na kondenzor. Dnešní mikroskopy mají osvětlovací soustavu splňující podmínky, stanovené německým fyzikem A. Köhlerem na sklonku 19. století. Tomuto optickému sytému se říká běžně Köhlerovo osvětlení. Köhlerovo osvětlení Osvětlovací zdroj ani kondenzor se přímo nezúčastní tvorby obrazu, mají však na jeho vlastnosti (ostrost, jas, kontrast) podstatný vliv. Proto jim musíme věnovat dostatečnou pozornost, chceme-li využít všech možností mikroskopu. Základní podmínkou pro správnou funkci osvětlovací soustavy je, že musí splňovat podmínku centrovaných systémů. Středy všech optických členů včetně zdroje světla - 3 -
musí ležet v optické ose mikroskopu. Pokud tato podmínka není splněna ve výrobě tím, že optické členy jsou pevně uloženy v optické ose, musíme toho dosáhnout centrováním. To znamená, že musíme nastavit polohu optického prvku tak, aby podmínka centrování byla splněna. To se týká jak světleného zdroje a jeho částí, tak kondenzoru. Nastavení KÖHLEROVA osvětlení: Umístíme preparát na stolek mikroskopu a zaostříme s objektivem 20x. Uzavřeme polní clonu světelného pole. Kondenzor zvyšujeme nebo snižujeme tak dlouho, až vidíme obraz clony světelného pole ostře ohraničený. To nastává většinou v případě, když je kondenzor značně vysoko. Clonu světelného pole pak otevřeme co nejvíc, aby se okraje jejího obrazu dotýkaly okraje zorného pole. Pokud obraz clony neleží uprostřed světelného pole, posunujeme jej (centrovacími šrouby kondenzoru) do středu zorného pole tak dlouho, až se všemi svými vrcholy dotýká obvodu. Vyjmeme z tubusu okulár. V otvoru vidíme osvětlenou výstupní pupilu objektivu. Uzavíráme aperturní clonu kondenzoru, aby zůstalo osvětleno ještě 2/3 průměru výstupní pupily objektivu. Má-li kondenzor stupnici numerické apertury, nastavíme na ní hodnotu přibližně ¾ numerické apertury objektivu. Výsledkem Köhlerova nastavení je rovnoměrné a maximální osvětlení průhledného preparátu, ležícího v předmětové rovině. Současně by měla být dosažena nejlepší kombinace mezi rozlišovací schopností a kontrastem. V každém případě doporučujeme ještě vyzkoušet optimální nastavení aperturní clony kondenzoru. 3. Práce s mikroskopem Postup při práci se suchým objektivem preparát uložíme tak, aby prohlížená část byla ve středu kondenzor snížíme dle použitého objektivu (čím je zvětšení menší, tím je kondenzor níže), irisovou clonu otevřeme (na velikost numerické apertury objektivu) makrošroubem snižujeme tubus a v okuláru sledujeme, kdy se objeví záblesk obrazu a doostříme mikrošroubem Postup při práci s imerzním objektivem preparát uložíme tak, aby prohlížená část byla ve středu kondenzor zvedneme úplně nahoru, irisovou clonu otevřeme (na velikost numerické apertury objektivu) na preparát kápneme imerzní olej (pokud pracujeme s dvojitou imerzí, kápneme olej také na čočku kondenzoru ještě než ho zvedneme nahoru) makrošroubem snižujeme tubus a pozorováním ze strany sledujeme, kdy se čočka objektivu spojí s olejovou kapkou (záblesk na hraně podložního skla), dále objektiv nesnižujeme - 4 -
díváme se do okulárů a jemným otáčením makrošroubu zvedáme tubus, jakmile se objeví preparát, doostříme mikrošroubem po skončení pozorování zvedneme tubus, preparát odsuneme a pokud nepokračujeme v práci s imerzí, ihned řádně očistíme objektiv (i kondenzor, pokud pracujeme s dvojitou imerzí). Nejčastější závady nedostatečně osvětlené zorné pole špatně seřízené světlo, snížený kondenzor, zúžená clona přesvětlené zorné pole zvýšený kondenzor, příliš otevřená clona a intenzivní světlo objektiv není přetočen přesně do optické osy čočky objektivu nebo okuláru jsou znečištěny preparát není zcela suchý i malé zbytky vody vytvářejí s imerzním olejem neprůhlednou emulzi. 4. Udržování a čištění mikroskopu Mikroskop udržujeme v čistotě, chráníme jej před prachem, před působením škodlivých výparů a chemických činidel a před nárazy a poškozením. Prach odstraňujeme čistým měkkým štětcem, k čištění kovových částí používáme jemný hadřík, imerzní látky odstraňujeme hadříkem namočeným v xylolu (nikdy nepoužíváme přebytek rozpouštědla mohlo by dojít k uvolnění balzámu, kterým jsou čočky tmeleny) nebo v méně agresivnějším benzínu. Po odstranění mechanických nečistot se k vlastnímu čištění čoček používá ether. Horní konec tubus nesmí zůstat otevřený, aby dovnitř nevnikl prach. Proto do tubusu vkládáme okulár nebo krycí destičku. Zaprášení čoček okuláru poznáme, otáčíme-li okulárem při otevřené cloně kondenzoru (temné skvrny v zorném poli prach se současně otáčejí). Vnějšek okuláru oprašujeme štětcem nebo čistíme hadříkem (příp. navlhčeným xylolem), vnitřek okuláru lze vyčistit rozebráním na jednotlivé části (pozor na pořadí a polohu čoček při zpětném sestavování). Znečištění objektivu se projeví neostrým mlhavým obrazem. Vnější plochu čelní čočky čistíme hadříkem namočeným v xylolu, cedrový olej (nebo jiná imerzní látka) nesmí na objektivu zatvrdnout). Vnitřek objektivu můžeme zbavit prachu vyfouknutím, nikdy se však nesnažíme o rozebrání objektivu. Po skončené práci a dobrém očištění mikroskopu přikryjeme mikroskop ochranným obalem nebo ho uložíme do skříňky. 5. Speciální způsoby mikroskopování Pro speciální způsoby mikroskopování slouží různá pomocná zařízení, která umožňují používat např. zvláštní druh osvětlení (mikroskopie v zástinu neboli v temném poli), zvláštní druh světla (fluorescenční mikroskopie) nebo speciální zařízení (fázová kontrastní mikroskopie). Zcela zvláštní kapitolu pak tvoří mikroskopie elektronová. Fluorescenční mikroskopie Některé látky pod vlivem ultrafialového nebo modrého záření emitují část absorbované energie ve formě viditelného světla. Tento jev označujeme jako fluorescence a vzniká v důsledku - 5 -
intramolekulární přeměny energie. Jsou-li zmíněné látky přítomny v buňce (např. riboflavin, chlorofyl), mluvíme o primární fluorescenci (přirozené). Sekundární fluorescence je vyvolána zabarvením sledovaných částí fluoreskujícími barvivy tzv. fluorochromy. Nejčastěji se používá akridinová oranž, primulin apod. Sekundární fluorescenci lze využít pro detekci mikroorganismů, v diagnostice mykobakterií, při studiu povrchových struktur buněčných stěn hub apod. Fluorochromy lze též značit protilátky a používat je k lokalizaci antigenů v buňkách; na tomto principu je založena imunofluorescence. Ke značení protilátek se používá hlavně fluorescein a rhodamin. Funkce fluorescenčního mikroskopu je založena na následujících dvou principech (obr. 3): 1. Na vzorek se nechá dopadat pouze světlo v intervalu vlnových délek, které způsobují excitaci. 2. K vytvoření obrazu se použije pouze nezbytně nutná část fluorescenčního světla, které obsahuje i neabsorbovanou část excitačního světla. Obraz se buď pozoruje, nebo se zachytí na mikrofotografii. Volba vlnové délky je samozřejmě velmi podstatná. Proto je ve fluorescenční mikroskopii důležitá volba vhodných optických filtrů. Obr. 3 Principy a základní součásti fluorescenčního mikroskopu 1. Světelný zdroj: Ze světelného zdroje vychází světlo s různými vlnovými délkami od ultrafialové po infračervenou. 2. Excitační filtr: Tento filtr propouští pouze světlo, které je potřebné k fluorescenci vzorku, především obvykle s kratší vlnovou délkou. Ostatní světlo pohlcuje. 3. Fluorescenční preparát: Vzorky, které reagují na dopadající světlo fluorescencí (většinou po přidání barviva-fluorochromu). 4. Bariérový filtr: Tento filtr pohlcuje všechno excitační světlo, které nebylo použito k excitaci a propouští pouze fluorescenční světlo. Navíc je možné z fluorescenčního spektra nechat projít pouze jeho část. Tyto čtyři základní součásti jsou pro činnost fluorescenčního mikroskopu nezbytné. V praktických aplikacích se používá k implementaci fluorescenčního systému do mikroskopu různých doplňků. Pracujeme většinou s imerzí mezi kondenzorem a preparátem, popř. s dvojitou imerzí. Imerzní olej nesmí mít vlastní fluorescenci. Pozorování provádíme v temné místnosti. - 6 -
Nevýhodou metody je skutečnost, že fluorochromy jsou většinou mutageny, proto je nezbytné při práci s nimi zachovávat příslušná opatření (oddělený prostor, oddělený oběh laboratorního skla, speciální likvidace roztoků, nepipetovat ústy, při práci se substancí používat roušku, nepotřísnit si pokožku apod.). Mikroskopie v temném poli (v zástinu) Při pozorování v zástinu se předmět osvětlí paprsky pod takovým úhlem, aby žádný z nich nevnikal přímo do objektivu. Studovaný objekt je osvětlován obvodovými šikmými paprsky. Používá se speciálních kondenzorů (paraboloidních), nebo se pod kondenzor vloží clonka s neprostupným středem, takže nepropouští středové paprsky (obr. 4). To znamená, že do objektivu vstupuje jen světlo odražené nebo rozptýlené osvětleným mikroskopovaným objektem. V temném poli pak jednotlivé části preparátu intenzivně září. Kondenzor pro mikroskopování v zástinu se spojuje s podložním sklíčkem imerzí a apertura se nastaví na nejvyšší hodnotu. Speciální objektivy pro pozorování v zástinu jsou opatřeny irisovou clonkou. Tato metoda se v mikrobiologii často používá při studiu pohyblivosti bakterií a při pozorování mikroorganismů, které se nedají dobře barvit a jsou přitom malé, takže se spatně rozlišují normálním světleným mikroskopem (spirochety, velké viry). Při používání mikroskopie v temném poli je nutno zachovávat dokonalou čistotu optiky i krycích a podložních sklíček. Preparáty je nutno zhotovovat ve velmi tenké vrstvě. objektiv objekt kondenzor Obr. 4 Chod paprsků při mikroskopování v temném poli Fázová kontrastní mikroskopie Tento druh mikroskopie je vhodný zejména pro zkoumání struktury živých buněk. Pro pozorování kvasinkové buňky je nenahraditelnou metodou, neboť umožňuje studium jader, vakuol, mitochondrií a buněčných inkluzí bez obarvení a navíc posuzování celkového stavu buněk v průběhu růstu a množení. Metoda umožňuje vidět v buňkách struktury, které mají mírně odlišný index lomu, - 7 -
než je index lomu ostatních složek buňky. Stejně tak rozdíly v indexu lomu celé buňky a okolního prostředí umožňují zřetelněji vidět buňku. Světelná vlna procházející objektem je buď zpožděna nebo je v předstihu (dle refraktivních vlastností objektu) oproti původní vlně procházející okolím. To znamená, že mezi nimi existuje určitý fázový posun. Pro slabě lámové objekty, které se v mikroskopu nejčastěji sledují, je fázový posun 90 (tj. ¼ délky vlny). Fázový kontrastní mikroskop přeměňuje fázové rozdíly na rozdíly v intenzitě světla, takže v obraze vznikají tmavé a světlé kontrasty. Většina živých buněk je ve světleném mikroskopu téměř transparentní (nebarevná). I tyto nebarevné objekty projevují kontrast, pokud se u jednotlivých částí vyskytují rozdíly v indexu lomu a tloušťce (části buněk, organely). Mnohé struktury se takto stávají viditelnými (např. chromatinová tělíska v bakteriích). Zařízení pro fázový kontrast se skládá z fázového kondenzoru s fázovými clonami, pomocného mikroskopu, sady objektivů a sady filtrů (obr. 5). Obr. 5 Optické schéma fázového kontrastu Elektronová mikroskopie Novou část dějin mikroskopie otvírá německý vědec Ernst Ruska (1906 1988), vynálezce elektronového mikroskopu, přesněji řečeno transmisního elektronového mikroskopu (TEM). Toto zařízení umožňuje zvětšení výrazně překročující možnosti optického mikroskopu, který je limitován délkou světelného paprsku (400 600 nm). Princip elektronové mikroskopie spočívá v tom, že světelné paprsky jsou zde nahrazeny svazkem urychlených elektronů, jehož vlnová délka, výrazně nižší než vlnová délka světla, je závislá na urychlujícím napětí (lze dosáhnout 6 pm). Skleněné čočky, regulující sbíhavost a rozbíhavost paprsku světla u optického mikroskopu, jsou zde nahrazeny elektromagnetickými čočkami. Každý TEM se z tohoto důvodu skládá z osvětlovací a zobrazovací soustavy, ze zdrojové a ovládací soustavy, doplněné o vakuovou trubici. Zjednodušený popis činnosti transmisního elektronového mikroskopu pak vypadá takto: Zrychlený, usměrněný proud elektronů emitovaný zdrojem je veden vakuem a probíhá tenkým mikroskopovaným vzorkem - zde se využívá toho, že se část elektronů odráží od atomů a molekul tvořících hmotu vzorku. Jejich opětovným soustředěním pomocí magnetové čočky se vytváří stínový - 8 -
obraz mikroskopovaného vzorku. K jeho zviditelnění se u zdokonalených typů elektronových mikroskopů využívá stejného principu, na jehož základě vzniká obraz na monitoru počítače. První jednoduchý transmisní elektronový mikroskop zkonstruoval Ernst Ruska již v roce 1931. Výsledný obraz, jehož lze docílit transmisním elektronovým mikroskopem, může být až stotisíckrát větší než pozorovaný předmět. Podle způsobu zobrazování se elektronové mikroskopy dnes dělí na transmisní, emisní a odrazové (v praxi málo používané) a novější řádkovací (skenovací či rastrovací). Není jistě nutno zvlášť zdůrazňovat, že se elektronový mikroskop stal cenným nástrojem v řadě vědeckých odvětví, od mikrobiologie a medicíny po fyziku a technologii materiálů. Díky němu byly s vysokou rozlišovací schopností studovány jednotlivé části buňky i pochody, které v nich probíhají, stejně jako např. povrch a struktura krystalů řady materiálů. Na základě revolučních prací na poli elektronové mikroskopie vyvinuli Gerd Binning a Heinrich Rohrer ve švýcarském výzkumném pracoviště IBM v Zurichu skenovací tunelový mikroskop (scanning tunneling microscope, STM). Tato metoda, lety neustále vylepšovaná, umožnila lidskému oku nahlédnout na povrch hmoty v rozměru nanometru. Skenovací tunelové mikroskopie se začalo využívat nejen v mikroelektronice (zvláště ke studiu a konstrukci polovodičů), ale především připravila půdu pro rozvoj nanotechnologie. Vývoj elektronové mikroskopie ovšem nekončí. Mezi nejvýznamnější inovace patří dále především atomový silový mikroskop (atomic force microscope, AFM) a skenovací sondový mikroskop (scanning probe microscope, SPM), který kombinuje metody STM a AFM. Jednou z jeho modifikací je například chemický silový mikroskop (chemical force microscope, CFM), sloužící k pozorování vazeb mezi jednotlivými molekulami. Trojice vědců, Ruska, Binning a Rohrer, získala v roce 1986 Nobelovu cenu za fyziku. Polovina náležela Ernestu Ruskovi za fundamentální práce na poli elektronové optiky a za objev elektronového mikroskopu, o druhou polovinu se rozdělili Gerd Binning a Heinrich Rohrer - za konstrukci skenovacího tunelového mikroskopu. - 9 -