UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI

UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI Fakulta přírodovědecká Katedra analytické chemie STANOVENÍ VYBRANÝCH ANTIDIABETICKÝCH LÉČIV V KLINICKÝCH VZORCÍCH METODOU HPLC/MS DIPLOMOVÁ PRÁCE Autor práce: Studijní obor: Vedoucí diplomové práce: Bc. Stloukalová Kateřina Analytická chemie RNDr. Fryčák Petr, Ph.D. OLOMOUC 2014

Prohlašuji, že jsem tuto práci vypracovala samostatně. Veškeré literární prameny a informace, které jsem v práci využila, jsou v seznamu použité literatury. Souhlasím s tím, že práce je prezenčně zpřístupněna v knihovně Katedry analytické chemie, Přírodovědecké Fakulty, Univerzity Palackého v Olomouci. V Olomouci dne..... Vlastnoruční podpis

Poděkování Chtěla bych poděkovat vedoucímu své diplomové práce RNDr. Petru Fryčákovi, Ph.D. za odborné vedení při řešení této problematiky, cenné rady, trpělivost a čas, který mi věnoval při zpracovávání této práce. Dále bych chtěla poděkovat doc. RNDr. Peteru Ondrovi, Csc., MUDr. Ondřejovi Krystyníkovi a Doc. MUDr. Karlovi Urbánkovi, Ph.D. za pomoc při zpracovávání diplomové práce a poskytnutí vzorků pacientů. A v neposlední řadě své rodině za psychickou podporu.

Souhrn Tato diplomová práce se zabývá stanovením pěti farmaceutických substancí, které náleží ke skupině perorálních antidiabetik a slouží k léčbě cukrovky 2. typu. Tato nemoc se odborně nazývá diabetes mellitus 2. typu a pacienti při ní trpí nedostatečnou citlivostí tkání na inzulín. Znamená to tedy, že slinivka pacientů postižených touto nemocí je schopna produkovat dostatek inzulínu, ale tkáně organismu nejsou na tento hormon dostatečně citlivé. Příčiny diabetu 2. typu nejsou zcela objasněny, nicméně často bývají spojovány se sedavým způsobem života, příjmem nezdravého jídla, obezitou, kouřením a vysokým krevním tlakem. Lidé s touto nemocí musí pravidelně užívat perorální antidiabetika, která citlivost těchto tkání zvyšují. Na trhu je několik dostupných skupin těchto léků a každá skupina má jiný mechanismus účinku. V této diplomové práci jsme se věnovali glimepiridu, glibenklamidu a gliklazidu, které zastupují skupinu sulfonylmočovinových derivátů, metforminu, který patří do skupiny biguanidů a sitalgliptinu, který náleží do skupiny gliptinů. Cílem práce bylo vytvořit dostatečně citlivou metodu pro identifikaci a kvantifikaci sitagliptinu, gliklazidu, glimepiridu, glibenklamidu a metforminu v plazmě. K řešení této problematiky bylo použito spojení vysokoúčinné kapalinové chromatografie a hmotnostní detekce s hybridním analyzátorem QqTOF. Vzhledem k významné odlišnosti metforminu od ostatních analytů byly pro separaci použity dvě různé stacionární fáze. Kvantifikace byla provedena na základě kalibrační křivky sestrojené s použitím izotopově značených standardů. Součástí této práce byla i aplikace vyvinuté metody na reálné vzorky. Vzorky krve jedenácti pacientů trpících diabetem 2. typu a léčených perorálními antidiabetiky jsme získali z III. interní kliniky Fakultní nemocnice Olomouc. Stanovená množství léčiv v plazmě pacientů se pohybovala v rozmezí 206-1615 ng/ml v případě metforminu a 1638-2358 ng/ml v případě gliklazidu; glimepirid byl detekován v jediném vzorku a jeho koncentrace činila 93ng/ml.

Summary This diploma thesis aims to determine five pharmaceutical substances that belong to the group of per oral antidiabetics and are used to treat diabetes mellitus type 2. The patients suffer from insufficient tissue sensitivity to insulin. In other words, the patient pancreas is able to produce enough of insulin however the patient tissues are not sensitive enough of insulin; the patient tissues, however, are not sensitive enough to the hormone. The causes of type 2 diabetes have not been fully explained although the disease is often associated with inactive way of life, unhealthy diet, obesity and smoking as well as with high blood pressure. Patients suffering from disease need to use peroral antidiabetics regularly to increase the tissues sensitivity. There are several groups of those medicaments on the market although each of those groups has a different mechanism of action. The thesis was dealing with glimepiride, glibenclamide and gliclazide, which represent a group of sulphonylurea structural analogues. Further, the thesis focused on metformin, which belongs to the group of biguanides, and on sitalgliptin from the group of gliptins. The thesis aimed to create a sufficiently sensitive method to identify and quantify sitagliptin, gliclazide, glimepiride, glibenclamide and metformin in the blood plasma. This was achieved by employing high performance liquid chromatography with mass spectrometric detection using a QqTOF hybrid analyser. As metformin is significantly different from the other analytes, two different stationary phases were used for the separation process. The quantitation was based on a calibration curve that had been created using isotopically labeled standards. The method was also applied to real blood samples. The blood samples from patients with type 2 diabetes who were cured with peroral antidiabetics were acquired from the 3rd Clinic of Internal Medicine of the University Hospital Olomouc. In the blood of the patients, the amount of metformin ranged from 206 to 1615 ng/ml, the amount of gliclazide ranged from 1638 to 2358 ng/ml, also the amount of glimepiride was in 93 ng/ml as well.

OBSAH 1. ÚVOD 1 2. TEORETICKÁ ČÁST 3 2.1 Diabetes 3 2.1.1 Metabolismus cukru 3 2.1.2 Získávání energie 3 2.1.3 Spotřeba energie 3 2.1.4 Glykémie 3 2.1.5 Inzulín 4 2.2 Diabetes mellitus 2. typu 5 2.2.1 Inzulínová rezistence 6 2.2.2 Inzulínová deficience 6 2.3 Průběh nemoci diabetes mellitus 2. typu 7 2.4 Význam léčby diabetes mellitus 2. typu 8 2.5 Perorální antidiabetika 8 2.5.1 Rozdělení perorálních antidiabetik podle mechanismu účinku 9 2.5.2 Deriváty sulfonylmočoviny 9 2.5.2.1 Mechanismus účinku působení sulfonylmočovinových derivátů 10 2.5.2.2 Gliklazid 14 2.5.2.3 Stanovení gliklazidu metodou HPLC/MS 15 2.5.2.4 Glibenklamid (Glyburid) 16 2.5.2.5 Stanovení glibenklamidu metodou HPLC/MS 17 2.5.2.6 Glimepirid 18 2.5.2.7 Stanovení glimepiridu metodou HPLC/MS 18 2.5.2.8 Glipizid 20 2.5.2.9 Gliquidon 20

2.5.3 Biguanidy 21 2.5.3.1 Metformin 22 2.5.3.2 Stanovení metforminu metodou HPLC/MS 23 2.5.4 Glinidy 24 2.5.4.1 Postprandiální hyperglykémie 24 2.5.4.2 Mechanismus účinku glinidů 24 2.5.4.3 Repaglinid a nateglinid 24 2.5.5 Thiazolidindiony (glitazony) 25 2.5.5.1 Mechanismus účinku 25 2.5.5.2 Troglitazon 26 2.5.5.3 Rosiglitazon 27 2.5.5.4 Pioglitazon 28 2.5.6 Inhibitory α-glukosidáz 28 2.5.6.1 Akarbóza 29 2.5.7 Gliptiny 29 2.5.7.1 Glucagon-like peptid 1 (GLP 1) 30 2.5.7.2 Sitagliptin 31 2.5.7.3 Stanovení sitagliptinu metodou HPLC/MS 32 2.5.8 Kombinování perorálních antidiabetik 33 2.5.8.1 Kombinace perorálních antidiabetik s inzulínem 33 2.5.8.2 Kombinace s metforminem 33 2.5.8.3 Kombinace inhibitorů α-glukosidáz 34 2.5.8.4 Kombinace rychlá inzulínová sekretagoga, glinidy, regulátory prandiální glykémie 34 2.5.8.5 Kombinace glitazonů 34

2.5.8.6 Komerčně dostupné přípravky 34 2.5.9 Stanovení perorálních antidiabetik 35 3. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST 36 3.1 Použité chemikálie 36 3.2 Vzorky klinického materiálu 36 3.3 Instrumentace a metody 36 4. VÝSLEDKY A DISKUZE 41 4.1 Výběr stanovovaných perorálních antidiabetik 41 4.2 Chromatografická a hmotnostně spektrometrická data standardů 43 4.2.1 Rekonstruované iontové chromatogramy standardů 44 4.2.2 MS spektra 45 4.2.3 MS/MS spektra 47 4.2.4 Kolizí indukovaná disociace 51 4.3 Mez detekce a stanovitelnosti 56 4.3.1 Metformin 57 4.3.2 Sitagliptin 58 4.3.3 Gliklazid 59 4.3.4 Glibenklamid 60 4.3.5 Glimepirid 61 4.4 Opakovatelnost a reprodukovatelnost 62 4.4.1 Reprodukovatelnost 62 4.4.2 Opakovatelnosti 63 4.5 Kalibrační křivky 64 4.6 Stanovení koncentrace antidiabetik v plazmě 67 4.6.1 Pacient č. 2 67 4.6.1 Pacient č. 11 68 4.7 Srovnání vyvinuté metody s metodami popsanými v literatuře 71 4.7.1 Metody stanovující tři a více antidiabetk 71

4.7.2 Metody stanovující tři a méně antidiabetik 73 5. ZÁVĚR 76 6. LITERATURA 77 7. SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK A SYMBOLŮ 82 8. SEZNAM OBRÁZKŮ 83 9. SEZNAM TABULEK 87

1. ÚVOD Cukrovka neboli diabetes mellitus je metabolické onemocnění charakterizované hyperglykémií (zvýšenou hladinou cukru v krvi). Tato nemoc se řadí mezi civilizační choroby a neustále narůstá počet obyvatel, kteří jí každoročně onemocní. Rozlišujeme dva typy cukrovky, a sice diabetes mellitus 1. typu, kdy tělo trpí nedostatkem inzulínu a ten se musí tělu dodávat, a diabetes mellitus 2. typu, kdy tělo má dostatek inzulínu, ale tkáně organismu jsou k němu necitlivé a musí se tedy pacientům podávat léky, které zvýší citlivost těchto tkání. Oba typy cukrovky jsou zapříčiněny nedostatečným působením hormonu inzulínu v cílových buňkách. Sníží se transport glukózy do buněk, které tak trpí nedostatkem energie, a proto se zvyšuje uvolňování glukózy z jater. K diabetu 2. typu velmi přispívá nedostatek pohybu a sedavý způsob života, kouření, obezita a příjem tučných jídel. Přitom stačí, aby obézní člověk snížil nefarmakologicky svou hmotnost o 5 % a tím snížil výskyt cukrovky 2. typu o 58 %. Léky, které se podávají pacientům s cukrovkou 2. typu se nazývají perorální antidiabetika. Perorální antidiabetika se vyznačují hypoglykemickým účinkem (snižují glykémii, tj. koncentraci glukózy v krvi), kterého dosahují různými mechanismy. Mechanismus účinku souvisí především se strukturou antidiabetik, podle níž je můžeme rozdělit do hlavních sedmi skupin, kterými jsou deriváty sulfonylmočoviny, biguanidy, gliptiny, inhibitory α-glukosidáz, deriváty thiazolidindionů a glinidů a antiobezitika. Podobně jako v případě ostatních skupin léčiv, je i pro antidiabetika vhodné mít k dispozici metody jejich stanovení v biologickém materiálu. Takové metody umožní např. sledovat compliance (tj. dodržování užívání předepsaného léčiva pacientem) nebo určit plazmatickou koncentraci v případě akutních intoxikací, což může být důležitá informace jak z terapeutického tak forenzního hlediska. Experimentální část diplomové práce se zabývá průkazem a stanovením pěti vybraných antidiabetik, kterými jsou sitagliptin (zástupce skupiny gliptinů), metformin (zástupce skupiny biguanidů), glimepirid, gliklazid a glibenklamid (zástupci skupiny derivátů sulfonylmočoviny). Pro měření bylo zvoleno spojení vysokoúčinné kapalinové chromatografie a hmotnostní spektrometrie s hybridním analyzátorem QqTOF. Při vývoji metody byl kladen důraz zejména na jednoduchost přípravy 1

vzorku a pokrytí všech nejrozšířenějších strukturních skupin cílových analytů. Součástí práce je i stanovení zvolených perorálních antidiabetik v reálných vzorcích lidské plazmy. Tato diplomová práce byla vypracovávána ve spolupráci s Ústavem soudního lékařství a medicínského práva Fakultní nemocnice Olomouc a v budoucnu bude vyvinutá metoda vzniklá v rámci této diplomové práce sloužit na půdě tohoto ústavu pro stanovení antidiabetik u pacientů Fakultní nemocnice Olomouc. 2

2. TEORETICKÁ ČÁST 2.1 Diabetes 2.1.1 Metabolismus cukru K pochopení podstaty onemocnění cukrovkou 2. typu je dobré si na začátku vysvětlit podstatu látkové výměny v organismu. Úkol procesu látkové přeměny je získávání energie z potravy. Každý živý organismus potřebuje k udržení životních funkcí získávat trvalou dávku energie. Protože tělo získává energii z potravy nárazově, musí být energie uchovávána v těle v zásobách a odtud v případě potřeby těla uvolňována. 1 2.1.2 Získávání energie Vstřebaná glukóza z potravy vstupuje do svalů a jater, kde je ukládána v podobě zásobního glykogenu, tento proces se nazývá glykogeneze. Mozek a některé další orgány, které nemají vlastní energetické zdroje, jsou zcela odkázány na kontinuální dodávání glukózy krví, k jejímuž využití nepotřebují inzulín. Ostatní orgány jako jsou játra, svaly, tuková tkáň apod. potřebují pro vstup glukózy do svých buněk inzulín. 1 2.1.3 Spotřeba energie Rozkladem zásobního jaterního glykogenu (glykogenolýzou) a nově tvořenou glukózou (glukoneogenezí) syntézou z laktátu a pyruvátu, proteinů a tkáňových tuků může být glukóza uvolňována zpět do krve. Glukóza je krví roznášena ke všem buňkám těla. 1 2.1.4 Glykémie Tímto pojmem se označuje hladina glukózy v krvi. Glykémie je měřena v jednotkách milimolech na litr (mmol/l) a u zdravého jedince je poměrně stálá a její hodnota se pohybuje v rozmezí 3-5,6 mmol/l. 1 Tato diagnostická kritéria glykémie se neustále mění a zpřísňují. Pro přehled je uvedena tabulka (tab. I), kde jsou ukázána kritéria hodnot glykémie nalačno v plazmě žilní krve. 2 Mezi nejvýznamnější regulátory hladiny glykémie patří hormony: glukagon, adrenalin, kortizon, růstový hormon a inzulín. 1 3

Tab. I: Nová diagnostická kritéria hodnot glykémie nalačno v plazmě žilní krve Glukózová tolerance Glykémie nalačno (mmol/l) NGT ( normální glukózová tolerance) 5,6 HGL (hraniční glykémie nalačno (prediabetes) 5,6-6,9 DM (diabetes mellitus) 6,9 Pozn.: V posledních letech je značná pozornost věnována změnám glukózové tolerance v období před manifestací cukrovky 2. typu, které se nazývá prediabetes. 2 2.1.5 Inzulín Inzulín podporuje využití glukózy ve tkáních a tvorbu glukózy, dále tlumí rozklad zásobního glykogenu a tlumí novotvorbu glukózy. Energetické využití glukózy probíhá uvnitř buňky. Přestup glukózy z krve do buňky je umožňován inzulínem, který zprostředkuje glukózový transport přes membránu buňky. Inzulín je hormon, který je do krve uvolňován ze slinivky břišní, kde je produkován β-buňkami Langerhansových ostrůvků. Počet ostrůvků v pankreatu je asi milion. 1 Inzulín koluje v krvi a pouze při vazbě na inzulínové receptory na povrchu tkáňových buněk ve svalech, játrech a tukové tkáni zahajuje transport glukózy prostřednictvím bílkovinných nosičů do buňky, kde se glukóza přeměňuje na látky, které je organismus schopen energeticky využít. Tento hormon tedy aktivuje přísun glukózy k cílovým orgánům a snižuje její tvorbu v játrech, stimuluje tvorbu bílkovin a tlumí rozklad tuků. 1 Inzulín je látka bílkovinné povahy, která se skládá z 51 aminokyselin, které jsou uspořádány do dvou řetězců A a B, spojených řetězcem C. Strukturu inzulínu můžeme vidět na obrázku (Obr. 1). Funkční inzulín vzniká v β-buňkách z proinzulínu odloučením spojovacího C řetězce, tzv. C peptidu. Produkce C peptidu je tedy shodná s množstvím produkovaného inzulínu. Sledováním hladiny C peptidu lze posuzovat zbytkovou sekreci endogenního inzulínu u nemocného léčeného exogenním inzulínem. Zdravý člověk spotřebuje 4

denně asi 30 40 jednotek inzulínu. Inzulín se uvolňuje do krve v několika fázích. Menší množství tohoto hormonu se uvolní do krve již při pohledu na jídlo, další sekrece je podporována vstřebáváním složek potravy, především glukózy. 1 A řetězec S 21 aminokyselin C- peptid S S B řetězec 30 aminokyselin Proinzulín Účinný inzulín Obr. 1: Molekula inzulínu 1 2.2 Diabetes mellitus 2. typu Je to heterogenní, metabolicko-endokrinologické onemocnění, na jehož manifestaci se podílejí jak genetické vlivy, tak vlivy vnějšího prostředí. 2 Řadí se mezi léčitelné, avšak nevyléčitelné choroby. Je to komplexní porucha metabolismu, z níž nejvýraznější je porucha metabolismu glukózy. 3 Toto chronické metabolické onemocnění je charakterizováno zvýšenou hladinou plazmatické glukózy. 2 Diabetes mellitus 2. typu se projevuje u těch osob, které mají geneticky danou sníženou citlivost periferních tkání na vlastní inzulín (inzulínovou rezistenci) a současně geneticky danou omezenou schopnost β-buněk produkovat takové množství inzulínu, které dokáže kompenzovat inzulínovou rezistenci a zajistit normoglykemii (inzulínovou deficienci). 2 5

2.2.1 Inzulínová rezistence Inzulínová rezistence je definována jako stav, kdy fyziologické (normální) hladiny inzulínu v krvi nejsou provázeny fyziologickou a biologickou odpovědí. Buňky periferních tkání (svalstva, tukové tkáně, jater) nereagují adekvátně na endogenně produkovaný inzulín a ztrácejí vůči němu citlivost. Tuto necitlivost (rezistenci) se organismus snaží kompenzovat zvýšenou sekrecí inzulínu v β-buňkách pankreatických ostrůvků. Vzniká tak kompenzatorní hyperinzulinemie. 2 Hyperinzulinemie je vysoká hladina inzulínu v krvi. Následkem vlivu inzulínové rezistence na tukovou tkáň je zvýšení hladiny lipidů v krvi. Inzulínem není dostatečně zablokováno štěpení tukové tkáně na volné mastné kyseliny a ty se pak ve vysoké hladině nalézají v krvi pacienta. Zpětná vysoká hladina volných mastných kyselin zhoršuje inzulínovou rezistenci ve svalové a jaterní tkáni. 1 Inzulínovou rezistenci lze rozdělit na primární a sekundární. Primární inzulínová rezistence je vrozená (geneticky určená) a u diabetes mellitus 2. typu má charakter receptorově postreceptorové poruchy, znamená to, že daný jedinec má vlohu pro odchylku funkce inzulínového receptoru či kaskády reakcí spuštěné za receptorem. U sekundární inzulínové rezistence známe její příčinu (hormonální, metabolickou, protilátkovou, protizánětlivé cytokiny, některé glykoproteiny a fosfoproteiny) a tento druh rezistence po odstranění příčiny, která ji vyvolala vždy mizí. Jako syndrom inzulínové rezistence označujeme skupinu metabolických procesů a jejich klinických projevů, které ve svém důsledku znamenají urychlení a vystupňování procesu aterosklerózy a vysokou četnost úmrtí na kardiovaskulární choroby u diabetiků 2. typu. V literatuře se označuje též jako syndrom X, Reavenův syndrom, metabolický syndrom, nebo smrtící kvartero. 1 2.2.2 Inzulínová deficience Inzulínová deficience je stav, kdy organismus má méně dostupného inzulínu v krvi, než je jeho potřeba k fyziologickým metabolickým pochodům. Zatímco u diabetiků 1. typu jde vždy o absolutní snížení hladin inzulínu, směřující k nulové sekreci v β-buňkách, je u diabetiků 2. typu inzulinová deficience výrazem nepoměru mezi potřebou zvyšovat inzulínovou sekreci k překonání inzulínové rezistence a porušenou schopností β-buněk zajistit 6

dostatečnou hyperinzulinemii. Inzulínovou deficienci prohlubuje přítomná hyperglykémie a zvýšené hladiny volných mastných kyselin. 2 Podle převládající poruchy lze diabetes mellitus 2. typu rozdělit na diabetes mellitus 2. typu s inzulínovou rezistencí a na diabetes mellitus 2. typu s inzulínovou deficiencí. 1 Mezi populacemi, ale i mezi jedinci se liší míra rezistence a inzulínové sekrece. 3 Diabetes se především projevuje u geneticky předurčeného jedince, který se během života vystavuje rizikovým faktorům prohlubující inzulínovou rezistenci jako jsou anomální obezita, přejídání, fyzická inaktivita, faktory vnějšího prostředí a kouření. 4 Je prokázáno, že pokud obézní rizikoví jedinci sníží nefarmakologicky svou hmotnost o 5 % původní hmotnosti, sníží zároveň i riziko vzniku diabetu o 58 %. 2 2.3 Průběh nemoci diabetes mellitus 2. typu Ve stádiu porušené glukózové tolerance a na samém počátku diabetes mellitus 2. typu se nachází hyperinzulinemie nalačno. S prohloubením poruchy postupně mizí časná fáze sekrece inzulínu a mění se i dynamika pozdní fáze sekrece inzulínu. Důsledkem těchto změn je opožděné vyplavení inzulínu a delší přetrvávání vyšší hladiny inzulínu. Situace vede k vyšší glykémii po jídlech. Přetrvávání hyperinzulinemie delší dobu zvyšuje inzulínovou rezistenci. V průběhu trvání cukrovky 2. typu se přidává i porucha bazální sekrece inzulínu (negativní vliv hyperglykémie na β-buňky, tzv. glukózová toxicita) a u pacientů se zvyšuje i glykémie nalačno. Obraz prohloubeného stupně diabetické poruchy je určen postupným úbytkem sekrece inzulínu, ta však v případě cukrovky 2. typu nikdy neklesá k nule. V průběhu trvání cukrovky 2. typu se tedy mění obraz převažující poruchy od poruchy s převahou inzulínorezistence k poruše s převahou inzulínodeficience. Změna převažující poruchy vyžaduje i změnu léčby cukrovky 2. typu. Počáteční fáze s inzulínorezistencí vyžaduje léčbu dietou, pohybem s redukcí nadváhy a perorálními antidiabetiky, následná fáze s rozvojem inzulínodeficience již žádá léčbu inzulínem. 1 7

2.4 Význam léčby diabetes mellitus 2. typu Diabetes mellitus bývá označována jako stav předčasné smrti nebo tichý zabíječ. Tato nemoc zkracuje život o 8 10 let. Protože zvýšená morbidita a mortalita diabetiků 2. typu je spojena s předčasnou aterosklerózou, setkáme se i s názorem, že diabetes 2. typu je závažné cévní onemocnění se špatnou kardiovaskulární prognózou. Lidé postiženi touto chorobou umírají až v 75 % na srdeční choroby. Ischemická choroba srdeční a infarkty myokardu u nemocných s diabetem 2. typu jsou 2,5 krát častější ve srovnání se stejnými věkovými kategoriemi nediabetiků a ishemická choroba dolních končetin je 15-20 krát častější. Hyperglykémie patři do skupiny akutních komplikací a významně zhoršuje prognózu všech přítomných symptomů metabolického syndromu (hypertenzi, hyperlipoproteinemii a poruchy koagulace). 2 Další komplikací, která může nastat je hypoglykémie a je to stav, kdy glykémie v kapilární plasmě klesne pod 3,3 mmol/l. Neuroglykopenie odráží nedostatečné zásobování mozkových buněk glukózou. 1 2.5 Perorální antidiabetika Perorální antidiabetika jsou léky, které působí různým mechanismem hypoglykemického účinku a snižují tím glykémii. Tyto látky se liší jak svými chemickými strukturami, tak mechanismem účinku a používají se především při léčbě cukrovky 2. typu. Tato skupina léčiv se používá obvykle až jako druhá z možností léčby, tedy v případě když nezabere dieta a pohyb. 1 V současné době si můžeme vybírat z šesti dostupných skupin PAD, které jsou deriváty sulfonylmočoviny, biguanidy, inhibitory α-glukosidáz, glutiny, deriváty thiazolidindionů a glinidů. 2 Sedmou skupinu tvoří antiobezitika. V průběhu léčby diabetu 2. typu se hladina inzulínové rezistence a inzulínové sekrece mění. 1 8

2.5.1 Rozdělení perorálních antidiabetik podle mechanismu účinku Deriváty sulfonylmočoviny a nesulfonylmočovinové deriváty ovlivňují sekreci inzulínu. Biguanidy a thiazolidindiony snižují inzulínovou rezistenci a ovlivňují působení inzulínu v periferních tkáních. A poslední skupina inhibuje střevní alfa-glukosidázy. 1 Jak již bylo popsáno výše rozdělujeme diabetes 2. typu na dvě skupiny: s převládající inzulínovou rezistencí nebo s převládající inzulínovou deficiencí. Podle tohoto rozdělení cukrovky 2. typu se rozdělují patřičně i PAD na dvě skupiny. První skupina se nazývá inzulínové senzitizéry, které zvyšují citlivost na inzulín a druhá se nazývá inzulínová sekretagoga a tato skupina zvyšuje sekreci inzulínu. 2 2.5.2 Deriváty sulfonylmočoviny Sulfonylmočovinová antidiabetika obsahují sulfonylmočovinovou skupinu a jsou odvozena od sulfonamidových látek. Základní strukturu této skupiny látek můžeme vidět na obrázku (obr. 2). Další úprava molekuly (odstranění aminoskupiny z benzenového jádra a otevření heterocyklického benzenového kruhu) zvýšila jejich hypoglykemickou aktivitu a snížila toxicitu. Sulfonylmočovinové deriváty se dělí na dvě skupiny a sice první a druhou generaci. Do první generace derivátů sulfonylmočovin patří karbutamid a tolbutamid. O několik let později byl novými zásahy do molekuly nahrazen vedlejší alifatický řetězec cyklohexylovou skupinou a byla připojena další cyklická struktura spojená s glycinem na druhém konci molekuly a tak vznikla sulfonylmočovinová antidiabetika druhé generace. Patří sem všechny ostatní deriváty sulfonylmočoviny. 5 Tato skupina látek stimuluje sekreci inzulínu z β-buněk Langerhansových ostrůvků pankreatu a nezvýší tím tvorbu inzulínu, umožní jen jeho uvolnění ze sekrečních granul. Pro jejich léčebný účinek je nutná zachovaná vlastní sekrece inzulínu. 1 Tyto látky mají hyperglykemické účinky. 2 Deriváty sulfonylmočovin nedokáží primárně ovlivnit inzulínovou rezistenci, ale pokles glykémie druhotně zvýší citlivost tkání vůči inzulínu (svalová tkáň a játra). Síla i délka vazby na plasmatické bílkoviny se u jednotlivých látek liší a je to jeden z faktorů, kterým se od sebe odlišují. Tato skupina látek se metabolizuje v játrech a ledvinách a z organismu se vylučuje převážně močí. 5 9

Obr. 2:Obecná struktura jádra sulfonylmočovinových derivátů 6 2.5.2.1 Mechanismus účinku působení sulfonylmočovinových derivátů V membráně β-buňky (β-buňky jsou buněčné typy Langerhansových ostrůvků, které jsou součástí slinivky břišní. Jedná se o buňky s endokrinní funkcí, produkují do krve hormon inzulín, který pomáhá buňkám vychytávat z krve glukózu a tím snižuje její celkový obsah v krvi) 7 jsou draslíkové kanály, jejichž činnost je závislá na množství adenosintrifosfátu v buňce. V bazálním stavu jsou otevřeny a zajišťují polarizaci membrány β-buňky. Vápníkové kanály, jejichž činnost je závislá na napětí membrány, jsou naopak uzavřeny. Metabolismus glukózy a živin zvyšuje tvorbu adenosintrifosfátu, na úrovni Krebsova cyklu jsou to aminokyseliny a na úrovni acetylkoenzymu A jsou to mastné kyseliny. Zvýšený poměr adenosintrifosfátu a adenosindifosfátu způsobí uzavření draslíkových kanálů, množství draslíku v membráně stoupne a způsobí její depolarizaci. Tím se otevře vápníkový kanál, závislý na napětí membrány a dovolí vstup vápníkových iontů do buňky. V cytosolu tedy stoupne koncentrace vápníku, což způsobí vyprázdnění inzulínu z endoplazmatického retikula, tedy z vnitřních buněčných rezerv. K tomu dochází exostózou ze sekrečních granulí v β-buňkách. Pohyb sekrečních granulí k membráně je zprostředkován mikrotubuly a mikrofilamenty, které jsou aktivovány přímo nebo zvýšením vápníkových iontů v buňce. Tímto způsobem je aktivována i adenylcykláza a fosfolipáza C. Mechanismus účinku této skupiny látek můžeme vidět na obrázku (obr. 3). 5 10

Nízká glykémie uvolňování Vysoká glykémie uvolnění glukózy metabolismus inzulínu K + - kanál K + - kanál závislý na K + (ADP) (ATP) závislý na ATP (ADP) (ATP) Ca 2+ ATP otevřen -70 mv se zavírá Ca 2+ - kanál závislý na napětí membrány uzavřen -40 mv Ca 2+ - kanál závislý na napětí membrány se otevírá uzavřen Obr. 3: Sekrece inzulínu závislá na metabolismu β-buňky 5 Sulfonylmočovina a produkty metabolismu živin ovlivňují stejné draslíkové kanály, jejichž činnost je závislá na adenosintrifosfátu, ale odlišným mechanismem. Sulfonylmočovina se váže na specifické receptory v membráně β-buňky, které jsou spojeny s draslíkovými kanály a svou vazbou způsobí jejich uzavření. Mechanismus účinku můžeme vidět na obrázku (obr. 4). 5 11

zavřený otevřený játra játr glukoneogeneze glukóza K + - kanál Ca 2+ - kanál glykogenolýza výdej glukózy z jater sulfonylureový sulfonylurea Ca 2+ glykémie receptor K + depolarizace e Ca 2+ uvolňování inzulín inzulín glukóza Vychytávání glukózy v periferiích GLUT - 4 β- buňka glukóza glykogen glykolýza sval Krebsův cyklus ATP Obr. 4: Mechanismus účinku sulfonylmočovinových antidiabetik 5 Zdá se, že důvodem necitlivosti β-buněk ke glukóze je také porucha jejího metabolismu. Estery kyseliny jantarové stimulují biosyntézu proinzulínu, zatímco estery jiných intermediárních metabolitů Krebsova cyklu na syntézu inzulínu nepůsobí. Tyto nálezy mohou pomoci zjistit defektní místa v metabolismu glukózy, která zodpovídají za necitlivost β-buněk a umožní v budoucnu rozvoj inzulínových sekretagog, která budou účinkovat již cíleně na konkrétní poruchu. K inzulínovým sekretagogům patří také nesulfonylmočovinové deriváty kyseliny benzoové, které jsou nesulfonylmočovinovou součástí molekuly sulfonylmočovinového antidiabetika glibenklamidu. Tato nesulfonylmočovinová sekretagoga se rovněž váží na receptory související s draslíkovými kanály. 5 Draslíkové kanály jsou přítomny i v jiných tkáních. Byly prokázány ve vysoké hustotě v srdečních, hladkých a příčně pruhovaných svalových buňkách a v některých mozkových neuronech. Draslíkové kanály jsou složeny ze dvou odlišných součástí. Jednou z nich je podjednotka, která tvoří pór (Kir6.2) a druhou součástí podjednotka tvořená receptorem pro sulfonylmočovinu, které se spojují do jednoho heteromerního komplexu 12

v poměru 4:4. Draslíkové kanály v různých tkáních obsahují různé typy podjednotky sulfonylmočoviny (SUR). SUR-1 je přítomen v β-buňkách, SUR-2 v buňkách myokardu a SUR-2B v hladké svalovině. 5 Vazba sulfonylmočoviny na draslíkové kanály byla zkoumána v experimentu na zvířecích β-buňkách a buňkách srdečního a hladkého svalu. Ukázalo se, že afinita sulfonylmočoviny byla nízká k podjednotce Kir.6.2., ale vysoká k podjednotce SUR. Vazbu sulfonylmočovinových antidiabetik k receptorům můžeme vidět na obrázku (obr. 5). Pankreatické receptory Kardiální (vaskulární) receptory SUR-1 SUR-1 SUR-2A (2B) SUR-2A (2B) gliklazid Pankreatické receptory Kardiální (vaskulární) receptory SUR-1 SUR-1 SUR-2A (2B) SUR-2A (2B) glibenklamid + glimepirid Obr. 5: Vazba sulfonylmočovinových derivátů k sulfonylmočovinovým receptorům v β-buňce a buňce srdečního a hladkého svalu 5 Výsledky řady studií ukazují, že jednotlivá sulfonylmočovinová antidiabetika ovlivňují membránové draslíkové kanály odlišným způsobem. 5 Do sulfonylmočovinové skupiny látek druhé generace patří tyto sloučeniny: gliklazid, glibenklamid, glimepirid, gliquidon a glipizid. Jednotlivá antidiabetika budou podrobně popsána dále. 5 13

2.5.2.2 Gliklazid Obr. 6: Struktura molekuly gliklazidu Gliklazid je perorální hypoglykemické léčivo, které patří do skupiny sulfonylmočovinových derivátů druhé generace, používajích se při léčbě diabetes mellitus 2. typu. 8 Systematický název jeho molekuly je 1-(3-azabyciklo[3.3.0.]okt-3-yl)-3-(ptolylsulfonyl)urea a tuto molekulu můžeme vidět na obrázku (obr. 6). 10 Tento derivát sulfonylmočoviny obsahuje heterocyklické jádro, které obsahuje dusík s endocyklickou vazbou. 5 Průměrná molekulová hmotnost je 323,41 a řadí se mezi inzulínová sekretagoga neboť zvyšuje sekreci inzulínu. V lékárnách ho můžeme najít ve farmaceutických přípravcích s názvy Diaprel (jež obsahuje 80 mg gliklazidu) a Diaprel MR (jež obsahuje 30 mg gliklazidu, MR znamená že jde o nový preparát s řízeným uvolňováním účinné látky, obsahuje hydrofilní matrix, který má v sobě vlákna hypromelózy s nízkou a vysokou viskozitou jež dovoluje postupné řízené uvolňování gliklazidu). 5 Gliklazid pomáhá zlepšit porušenou první fázi sekrece inzulínu a má antiagregační schopnost. Tato látka je především vylučována žlučí a lze jim léčit i diabetiky s mírnou poruchou ledvinových funkcí. 2 Velikost dávky gliklazidu se pohybuje v rozmezí 40-320 mg, která se podává pacientovi jednou až dvakrát denně, trvání jejího účinku je 10 až 15 hodin a metabolizuje se v játrech. 5 Mechanismus účinku gliklazidu je selektivní inhibice kanálů se SUR-1, tedy v β- buňce. Inhibice proudů podjednotky SUR je okamžitě reverzibilní. Gliklazid blokuje selektivně s vyšší afinitou draslíkové kanály β-buněk a vazba je volně reverzibilní. 5 14

2.5.2.3 Stanovení gliklazidu metodou HPLC/MS Vybraná metoda stanovuje gliklazid v lidské plazmě, která se připravovala precipitací acetonitrilem. Separace probíhala na koloně Hypersil BDS C 18 (50 mm x 2,1 mm, 3 μm). Mobilní fáze se skládala z methanolu:1 % kyseliny mravenčí:acetonitrilu (30:31:39). Celková doba anlýzy byla 2 minuty. Limit detekce gliklazidu byl 10,0 ng/ml. Intradenní a interdenní reprodukovatelnost metody je méně než 15 %. Při stanovení gliklazidu metodou vysokoúčinné kapalinové chromatografie spojené s hmotnostní spektrometrií je ve spektru měřeném v pozitivním módu, při ionizaci elektrosprejem za použití trojitého kvadrupólu, pozorován jeho molekulový iont [M+H] + s hodnotou m/z 324. V MS/MS spektru patří nejvyšší intenzita iontu s hodnotou m/z 110. Obě tato spektra jsou k vidění na následujících obrázcích (obr. 7 a obr. 8). 9 Obr. 7: Hmotnostní spektrum gliklazidu 9 15

Obr. 8: MS/MS spektrum gliklazidu s prekurzorním iontem [M+H] + o m/z 324 9 2.5.2.4 Glibenklamid (Glyburid) Obr. 9: Struktura molekuly glibenklamidu Glibenklamid je perorální léčivo typu sulfonylmočovinových derivátů, které se široce používá pro léčbu hyperglykémie u pacientů trpících cukrovkou 2. typu. Toto léčivo se kompletně rychle vstřebává v gastrointensticiálním traktu. 11 Tato látka je známá také pod názvem glyburid, jeho průměrná molekulová hmotnost je 494.004 a systematický název molekuly 5-chloro-N-[2-[4-(cyklohexylkarbamoyl-sulfamoyl)fenyl]ethyl]-2-methoxybenzamid. Strukturu molekuly glibenklamidu lze vidět na obrázku (obr. 9). 12 V lékárně si ho můžeme zakoupit pod názvem Maninil (tento přípravek obsahuje 5 mg glibenklamidu) a nebo 16

Glucobéne (který obsahuje 1,75 mg nebo 3,5 mg glibenklamidu). Toto léčivo je nejstarším antidiabetikem druhé generace sulfonylmočovinových derivátů. Lék je kompletně metabolizován na látky s mírným hypoglykemizujícím účinkem. Vylučován je ledvinami a částečně žlučí. 2 Tento lék se podává v rozmezí dávek 1,25 mg až 20 mg a to jednou až dvakrát denně, jeho účinek trvá 12 až 24 hodin a metabolizuje se v játrech. 5 Mechanismus účinku glibenklamidu, který obsahuje jak složku sulfonylmočoviny tak benzamidový profil spočívá v tom, že se může vázat současně na obě receptorové součásti SUR-1, ale k benzamidovému místu pouze na SUR-2A. 5 2.5.2.5 Stanovení glibenklamidu metodou HPLC/MS Uvedená metoda stanovuje glibenklamid v plazmě, která se připravuje precipitací přidáním organického rozpouštědla. K separaci dochází na Zorbax CN koloně (150 mm x 4,6 mm, 5 μm) při použití mobilní fáze složené z acetonitrilu a 0,01 mol/l octanu amonného upraveného na ph=3,2 (1:1). Při stanovení byl použit gliquidon jako interní standard. Limit kvantifikace glibenklamidu je 40 ng/ml. Relativní směrodatná odchylka této metody je 9 %. Při detekci glibenklamidu v plazmě vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií s následnou hmotnostní detekcí, chemickou ionizací za atmosférického tlaku a za použití iontové pasti, v pozitivním módu lze ve spektru nalézt protonovaný molekulární ion o m/z 494 a v MS/MS spektru ion o m/z 369. Spektra jsou vidět na obrázku (obr. 10). 12 Obr. 10: Hmotnostní spektrum glibenklamidu a jeho iontového produktu 12 17

2.5.2.6 Glimepirid Obr. 11: Struktura molekuly glimepiridu Glimepirid je moderní perorální hypoglykemické léčivo, které zastupuje skupinu sulfonylmočovinových derivátů. Systematický název jeho molekuly je 1-[[p-[2-(3-ethyl-4- methyl-2-oxo-3-pyrrolin-1-karboxamido)ethyl]fenyl]sulfonyl]-3-(trans-4- methylcyklohexyl)urea. Průměrná molekulová hmotnost je 490,616. Molekulu glimepiridu je zobrazená na obrázku (obr. 11). 13 Krystalický prášek této látky je bílé až žlutobílé barvy, který je prakticky nerozpustný ve vodě. Tableta glymepiridu je po perorálním podání kompletně vstřebána v gastrointestinálním traktu. 14 Glimepirid je v lékárnách k dostání pod názvem Oltar (s obsahem glimepiridu 1 mg, 2 mg nebo 3 mg) a Amyryl (obsahující 1 mg, 2 mg, 3 mg nebo 4 mg glimepiridu). Cílem při vývoji této substance bylo zajištění fyziologičtějšího uvolňování inzulínu s malým rizikem hypoglykémií. Je diskutována i jeho možná schopnost snižovat inzulínovou rezistenci ovlivněním aktivity glukózových přenašečů. Je prokázána jeho antiagregační schopnost a může se podávat i pacientům s poruchou ledvinových funkcí, protože se vylučuje převážně žlučí a částečně ledvinami. 2 Glimepirid by se měl dávkovat v rozmezí množství 1-6 mg, jednou denně a trvání účinku se pohybuje mezi 12 až 24 hodinami. Metabolismus probíhá v játrech. 5 Mechanismus jeho účinku je podobný jako u glibenklamidu. Tento lék blokuje přibližně stejně všechny tři typy rekombinantních draslíkových kanálů a zlepšuje první i druhou fázi sekrece inzulínu avšak nezvyšuje citlivost k tomuto hormonu. 5 2.5.2.7 Stanovení glimepiridu metodou HPLC/MS Vbrabá metoda stanovuje glimepirid v lidské plazmě. Vzorky byly připrapovány kapalinovou extrakcí (ethyl acetát:diethyl ether (50:50)) na základě 96 - jamkového formátu mikro zkumavek. Jako interní standard byl použit glibenklamid. Separace v kapalinovém 18

chromatogramu probíhala na koloně YMC-Pack Pro C18 (50 mm x 4,0 mm za použití mobilní fáze složené z acetonitrilu : 20 mm octové kyseliny (80:20 %). Nastřikovaný objem byl 50 μl a celková doba analýzy 1,8 min. Molekula se v této metodě ionizuje pomocí elektrospreje a v hmotnostním analyzátoru je separována v kvadrupólu společně s iontovou pastí. V hmotnostním spektru, které je na obrázku (obr. 12), lze vidět protonovaný molekulární ion [M+H] + o hodnotě m/z 491 a v MS/MS spektru ion o m/z 352. 14 Obr. 12: Hmotnostní a MS/MS spektrum glimepiridu 15 19

2.5.2.8 Glipizid Obr. 13: Struktura molekuly glipizidu Glipizid patří mezi deriváty sulfonylmočoviny druhé generace a efektivně se využívá při kontrole hladiny glukosy v krvi u diabetických pacientů. 16 Systematický název molekuly je 1-cyklohexyl-3-[[p-[2-(5-methylpyrazinkarboxamido)ethyl]fenyl]sulfonyl]urea. 17 Jeho průměrná molekulová hmotnost je 445,535 a molekula glipizidu je na obrázku (obr. 13). Tato substance se je komerčně dostupná pod názvem Minidiab, který obsahuje 5 mg glipizidu a má velmi rychlý nástup účinku. Glipizid se vylučuje močí, proto se nemůže podávat pacientům s poruchami funkcí ledvin a metabolizuje se v játrech. 2 Rozmezí dávek glipizidu by mělo být v rozmezí 2,5-40 mg jejichž trvání je 16-24 hodin a počet dávek je jednu až dvě denně. 5 Glipizid zvyšuje sekreci inzulínu stimulací ostrůvků β-buněk. 17 2.5.2.9 Gliquidon Obr. 14: Struktura molekuly gliquidonu 20

Gliquidon je zástupce skupiny sulfonylmočovin, průměrná molekulová hmotnost jeho molekuly, která je vidět na obrázku (obr. 14), je 527,632 a molekula má systematický název N-(cyklohexylkarbamoyl)-4-[2-(7-methoxy-4,4-dimethyl-1,3-dioxo-3,4- dihydroisoquinolin-2(1h)-yl)ethyl]benzensulfonamid. 18 Gliquidon má velmi krátkou dobu účinku a proto je vhodný pro kombinovanou léčbu. 19 Komerčně se nachází tato substance pod názvem Glurenorm a toto léčivo obsahuje 30 mg gliquidonu. Tento lék je určen zejména nemocným cukrovkou 2. typu s poškozenou funkcí ledvin i ve stádiu chronické hemodialýzy. Z organismu se vylučuje žlučí. 1 Gliquidon se dávkuje v množství 15 až 60 mg jednou až dvakrát denně. Trvání jeho účinku je 8 až 10 hodin a metabolizuje se v játrech. 5 Tato látka se vyznačuje velmi silnou vazbou na bílkoviny plazmy a má tedy dlouhý poločas vylučování. 5 2.5.3 Biguanidy Historie biguanidů sahá do poloviny 20. století. První deriváty biguanidů měly závažné vedlejší účinky a proto se po postupném výzkumu stal jediným používaným zástupcem této skupiny metformin. Metformin je jako jediný bezpečný doporučován a bude dále pojednáno pouze o něm. Diabetici druhého typu mají zejména makrovaskulární obtíže obzvláště ischemickou chorobu srdeční. Právě aterosklerotické postižení cév je úzce spjato s inzulínovou rezistencí a hyperinzulinémií a proto ovlivnění inzulínové rezistence by pak mělo snížit mortalitu a tento předpoklad byl poprvé prokázán u metforminu. 5 Biguanidy nezvyšují sekreci inzulínu a v monoterapii nevyvolávají hypoglykémii. Tato skupina snižuje glukoneogenezi v játrech, omezují vstřebávání glukózy ze střeva a mají anorektický efekt. Neváží se na plasmatické bílkoviny, nejsou metabolizovány v játrech a vylučovány jsou vždy ledvinami. Tato skupina látek je doporučována obézním diabetikům cukrovky 2. typu. 1 21

2.5.3.1 Metformin Obr. 15: Struktura molekuly metforminu Metfromin je jediný bezpečný zástupce biguanidů. Systematický název jeho molekuly je 1, 1-dimethylbiguanid (N,N-Dimethylimidodicarbonimidic diamide). 20 Jeho průměrná molekulová hmotnost je 129,163. Strukturu molekuly metforminu lze vidět na obrázku (obr. 15). Metformin je k dostání pod názvem Siofor (obsahující 500 mg, 850 mg nebo 1000 mg účinné látky) a Glucophage (jehož obsah metforminu je 500 mg, 850 mg nebo 1000 mg). Metformin se vstřebává nekompletně a to pouze z 60 % podané dávky, maximální plazmatické hladiny dosahuje po dvou hodinách a poločas eliminace je okolo 4 hodin. Metformin se prakticky nemetabolizuje a vylučuje se ledvinami. 1 Mechanismus antihyperglykemizujícího účinku je extrapankreatický. 2 Metformin pravděpodobně zasahuje do oxidačního řetězce v mitochondriích, zejména v hepatocytech, upravuje odchylky v intracelulárním metabolismu kalcia v inzulinodependentních tkáních (játra, svalstvo, tuková tkáň). Důsledkem je pak snížení výdeje glukózy z jater (snížení zejména glukoneogeneze v jaterních buňkách) a jednak zlepšení inzulínové senzitivity periferních tkání. Metformin zpomaluje vyprazdňování žaludku, zpomaluje vstřebávání glukózy v tenkém střevě. 1 Jeho hlavním místem účinku jsou játra. 5 Metformin sám o sobě může zlepšit diabetickou dyslipidémii, to znamená že sníží triacylglycerolémii a zvýší HDL-cholesterolémii. Po podání metforminu dojde k měřitelnému poklesu plazmatické koncentrace volných mastných kyselin. Volné mastné kyseliny negativně ovlivňují funkci β - buněk pankreatu, proto může být podání metforminu následováno zlepšením inzulínové sekrece nezávislé na poklesu glykémie. Metformin zvyšuje trobolytickou aktivitu, zlepší hemorheologické vlastnosti krve, pozitivně ovlivňuje cévní 22

permeabilitu, snižuje glykaci, snižuje oxidační stres, snižuje plazmatickou koncentraci amylinu a snižuje agregabilitu trombocytů. 1 2.5.3.2 Stanovení metforminu metodou HPLC/MS V uvedené metodě se metformin stanovuje v lidské plazmě, která se připravuje kyselou acetonitrilovou precipitací. Při stanovení metforminu se používal glimepirid jako interní standard. Separace probíhala na koloně C18 (50 mm x 4,6 mm, 5 μm) za použití mobilní fáze složené z acetonitrilu:5 mm octanu amonného upraveného na ph=3,0 (7:3). Nastřikovaný objem byl 5 μl a délka analýzy 3,5 minuty. Při stanovení metforminu metodou vysokoúčinné kapalinové chromatografie ve spojení s hmostnostním spektrometrií, ionizací elektrosprejem a s použitím trojitého kvadrupólu jako hmotnostního analyzátoru se v hmotnostním spektru objeví mateřský ion o m/z 130,1 a jeho fragment o m/z 60,1. Spektra jsou zobrazena na obrázku (obr. 16). 21 Obr. 16: Hmotnostní spektrum protonovaného iontu metrforminu a) a výchozího iontu fragmentu b) 22 23

2.5.4 Glinidy Tato skupina léčiv se řadí mezi nesulfonomočovinová sekretagoga, která snižují hyperglykemii podobně jako deriváty sulfonylmočoviny, ale na rozdíl od nich mají rychlý nástup hypoglykemizujícího účinku (rychle se vstřebávají z trávicího traktu) a krátký poločas účinku v organismu. 2 Metabolismus probíhá zejména v hepatocytech na neaktivní metabolity, většina je vylučována stolicí a minimum močí v podobě neaktivních metabolitů. 5 Díky své farmakodynamice jsou někdy nazývány regulátory prandiální glykemie (snižují glykémii po jídle). 2 Glinidy se řadí do skupiny inzulínových sekretagog. Inzulínová sekretagoga jsou léky, které se využívají k bezpečnému ovlivnění postprandiální hyperglykémie. 2 2.5.4.1 Postprandiální hyperglykémie Postprandiální hyperglykémie hraje významnou roli v rozvoji pozdních diabetických komplikací, a to jak mikroangiopatických (zvyšuje průtok krve retinou, akcentuje glomerulární hyperfiltraci, potencuje tvorbu kolagenu), tak i makroangiopatických (zvyšuje krevní tlak, vede k hyperkoagulaci, potencuje oxidační stres). V současnosti je toto přijímáno jako nezávislý rizikový faktor rozvoje makrovaskulárních komplikací. Postprandiální hyperglykémie je determinována určitými faktory, které jsou prandiální nálož sacharidů, sekrecí inzulínu, kvalitou časné fáze inzulínové sekrece, inzulínovou rezistencí, endogenní produkcí glukózy, neadekvátní supresí glukagonu, perzistencí zvýšené koncentrace mastných kyselin a akcelerací evakuace žaludku. 5 2.5.4.2 Mechanismus účinku glinidů Glinidy se po požití rychle vstřebávají ze zažívacího ústrojí. Vážou se na specifické receptory β-buněk, důsledkem je uzavření kaliových kanálů senzitivních na ATP. Poté dojde k depolarizaci buněčné membrány, která je následována infixem vápníkových iontů, jež vede k uvolnění inzulínu. 5 2.5.4.3 Repaglinid a nateglinid Hlavními zástupci glinidů jsou repaglinid a nateglinid. Tyto dvě sloučeniny jsou v lékárnách k dostání pod názvy Novonorm (obsahuje 0,5 mg, 1 mg, a 2 mg účinné látky 24

repaglinidu) a Starlix (obsahuje 60 mg nateglinidu). 2 Nateglinid má rychlejší vazbu na receptory než repaglinid. Okamžitý efekt glinidů na sekreci inzulínu do jisté míry nahrazuje chybějící první fázi inzulínové sekrece, což se významně promítne do zlepšené kontroly zejména postprandiální glykémie. V tom tkví přínos této novější skupiny léků. 5 2.5.5 Thiazolidindiony (glitazony) Tuto skupinu můžeme hledat také pod názvem deriváty thiazolidindionů a byla pojmenována podle hlavního způsobu svého hypoglykemizujícího účinku inzulínové senzitizéry, neboli látky, které zvyšují citlivost periferních tkání k působení inzulínu. 5 K této skupině léku se řadí troglitazon, rosiglitazon, pioglitazon, darglitazon, englitazon a ciglitazon. 3 U této skupiny léků se při léčbě můžeme setkat s kontraindikacemi které jsou porucha jaterních funkcí, srdeční sehávání a edémové stavy. 2 Antihyperglykemický účinek glitazonů je vázán na thiazolidindionové jádro, a proto mezi nimi není z tohoto hlediska větší rozdíl. Troglitazon, rosiglitazon a pioglitazon se liší strukturou postranních řetězců. Tyto rozdíly jsou zodpovědné za odlišnosti farmakokinetiky, farmakodynamiky a nežádoucích účinků mezi jednotlivými glitazony. Nejvíce používanými jsou rosiglitazon a pioglitazon. 3 2.5.5.1 Mechanismus účinku Glitazony působí jako selektivní agonisté receptorů PPARγ (peroxisome proliferator-activated receptor γ), které zprostředkovávají ovlivnění inzulinorezistence. PPAR receptory jsou jaderné receptory a byly popsány tři hlavní subtypy α (nacházejí se především v játrech, ale i kosterním svalstvu a srdečním svalstvu), γ a δ. Po aktivaci přirozeným (mastné kyseliny a jejich deriváty, jako leukotrieny a některé prostaglandiny, deriváty oxidace LDL) či syntetickým ligandem (glitazony) se PPARγ naváží na specifická místa DNK (tzv. hormone response element nebo thiazolidinedione responsive genes ), a tím aktivují nebo inhibují expresi genů zodpovědných za syntézu proteinů zapojených do regulace množství zásobního tuku, metabolismu mastných kyselin a glukózy a tvorby hormonů ovlivňujících tkáňovou senzitivitu k inzulínu (např. acyl-coa syntéza, lipoproteinová lipáza, adipopektin a jiné). Naopak po aktivaci PPARγ receptorů je inhibována exprese genů pro 25

syntézu rezistinu a TNFα hormonů spojovaných se zhoršením účinnosti inzulínu ve tkáních. Inhibována je i produkce leptinu, čímž jsou výrazně ovlivněny procesy indukované leptinem (např. suprese inzulínové sekrece či zvýšení energetického výdeje). Glitazony vedou ke zvýšené diferenciaci tukových buněk v podkožním a hnědém tuku, ale ne v tuku viscerálním. Popsané metabolické účinky glitazonů jsou vyjádřeny zejména v podkožní tukové tkáni, kde je koncentrace PPARγ 20-30krát vyšší ve srovnání s jinými tkáněmi. 3 Glitazony snižují inzulínovou rezistenci a následně snižují zvýšené hladiny glukózy v krvi, nepůsobí na inzulínovou sekreci. 2 Zatím je prokázána zvýšená exprese glukózových transportérů, zvýšená fosforylace inzulínového receptoru, zvýšená aktivace fosfatidylinozitid- 3-kinázy. Snížení jaterní produkce glukózy je pravděpodobně následek aktivace klíčového enzymu glukózové produkce v játrech PEPCK (phosphoenolpyruvate carboxykinase). 2 Thiazolidindiony vedou ke snížení hyperglykémií i nepřímo, a to svým ovlivněním hladin volných mastných kyselin díky zvýšení využití oxidace těchto kyselin. Zvýšení plazmatických volných mastných kyselin způsobuje kompetitivní snížení inzulínem stimulovaného využité glukózy a vede i ke zvýšení jaterní glukózové produkce. 2.5.5.2 Troglitazon Obr. 17: Struktura molekuly troglitazonu Tato látka byla uvedena na trh jako první thiazolidindion. Průměrná molekulová hmotnost jeho molekuly, kterou můžeme vidět na obrázku (obr. 17), je 441,54. Komerčně se nachází pod názvem Rezulin. Tento přípravek byl po třech letech stažen z trhu pro jeho hepatotoxicitu. Jelikož byl nejdéle zkoumán v klinickém používání je jeho hypoglykemizující účinek nejlépe prozkoumán. Léčba tímto přípravkem vedla k snížení hypertenze. 5 26

2.5.5.3 Rosiglitazon Obr. 18: Struktura molekuly rosiglitazonu Rosiglitazon byl uveden na trh později než troglitazon a má silnější hypoglykemizující efekt oproti troglitazonu. Průměrná molekulová hmotnost jeho molekuly, kterou lze vidět na obrázku (obr. 18), je 357,43. Rosiglitazon vede k signifikantnímu zvýšení hladiny adipopektinu. Tento plazmatický glykoprotein je syntetizován a vylučován v tukové tkáni a jsou mu přisuzovány protizánětlivé a protiaterogenní vlastnosti. Rosiglitazon je k dostání pod názvem Avandia (obasahují 4 mg a 6 mg účinné látky) jeho plazmatický poločas je 3-4 hodiny a vylučuje se močí. 5 27

2.5.5.4 Pioglitazon Obr. 19: Struktura molekuly pioglitazonu Piolitazon byl uveden do klinické praxe nejpozději ze všech tří uvedených. Průměrná molekulová hmotnost jeho molekuly, jejíž struktura je na obrázku (obr. 19), je 356,44. Podávání tohoto perorálního antidiabetika vede k inhibici oxidace mastných kyselin s dlouhým řetězcem, zatímco oxidace molekul se středně dlouhým řetězcem zůstává neovlivněna. V lipidovém spektru pioglitazon neovlivňuje LDL - cholesterol, ale snižuje triacylglyceroly a zvyšuje hladiny HDL - choleterolu. 5 2.5.6 Inhibitory α-glukosidáz Sacharidy jsou základní složkou potravy a jsou zastoupeny ve formě polysacharidů (škrob) a disacharidů (sacharóza). Tyto složité cukry musí být před vstřebáním rozloženy na základní jednotky a to jsou monosacharidy. Tento proces je zabezpečen enzymovým vybavením epitelu tenkého střeva α-glukosidázami. Hydrolýza složitých sacharidů je následována vstřebáním monosacharidů. U diabetika, kterému selhává postprandiální sekrece inzulínu je potom důsledkem rychlé absorpce prudký a významný vzestup postprandiální glykémie. 5 Aktivitu α-glukosidáz je možno inhibovat pomocí kompetitivních inhibitorů. Tyto látky zpomalí rychlost hydrolýzy sacharidů a výsledkem je snížené množství vstřebaných monosacharidů za časovou jednotku. Negativním důsledkem inhibice hydrolýzy může být zvýšení nabídky sacharidů mikroflóře tlustého střeva s celou řadou důsledků dyskomfort. 5 28

Látek, které dovedou kompetitivně inhibovat střevní α-glukosidázy je pro farmaceutické použití vytvořeno více (miglitol, voglibóza) ale v České republice je dostupný pouze jeden a to akarbóza. 5 2.5.6.1 Akarbóza Obr. 20: Struktura molekuly akarbózy Akarbóza je pseudotetrasacharid, který se po perorálním podání nevstřebává. Kompetitivně inhibuje dva enzymy α - glukosidázu a α - amylázu. 23 Ve farmaceutickém průmyslu se vyrábí pod názvem Glucobay, který obsahuje 50 mg a 100 mg účinné látky. 2 Molekula akarbózy, kterou můžeme vidět na obrázku (obr. 20), je velmi blízká molekule oligosacharidu, obsahuje však navíc dusík. Díky němu se dokáže na krátkou chvíli navázat na α - glukosidázy (zejména amylázu, sacharázu méně maltázu), ale protože odolává jejímu enzymovému účinku, není hydrolyzována. Po dobu navázání na enzym je jeho vlastní aktivita blokována. Vazba akarbózy je plně reverzibilní. Výsledkem je zpomalení digesce sacharidů a prodloužení doby absorpce. Akarbóza se vylučuje převážně stolicí. 5 2.5.7 Gliptiny V dnešní době se uplatňuje i nový inkretinový přístup, který využívá DPP-4 (dipeptidyl peptidase-4) inhibitory, kam patří sitagliptin a vildagliptin. Inkretiny jsou GIT (glucose-dependent insulinotropic polypeptid/gastric inhibitory polypeptid) hormony (Jsou to spíše skupiny peptidů s parakrinní, neurotransmitterovou a neuromodulátorovou aktivitou, jejich hlavní funkce je koordinace funkce GIT po jídle. Biologickým účinkem 29

gastrointestinálních hormonů je regulace sekrece gastrointestinálních šťáv, absorpce živin, motility celého traktu a průtoku krve, a tím regulace procesu trávení. Podnětem k vyplavení GIT hormonů je přítomnost potravy v lumen žaludku a střeva. Jejich sekreci také regulují nervové podněty či jiné hormony, které působí na inzulín. 24 Hlavním hormonem inkretinového systému je glukagonu podobný peptid (GLP-1). Snižuje glykémii, zvyšuje sekreci inzulínu, snižuje apoptózu β-buněk, snižuje chuť k jídlu a zpomaluje vyprazdňování žaludku. Snižuje také sekreci glukagonu. Je rychle štěpen enzymem dipeptidylpeptidázou 4 (DPP-4). Její zablokování vede ke zvýšení endogenně produkovaného GLP-1. 25 2.5.7.1 Glucagon-like peptid 1 (GLP 1) Za bazálních podmínek je koncentrace GLP 1 v krvi relativně nízká, prudce roste po požití potravy, vzestup hladiny je zprostředkován neuroendokrinně a současně přímým stimulačním účinkem potravy na buňky střevní sliznice. GLP 1 zpomaluje vyprazdňování žaludku, zvyšuje citlivost β buněk k sekrečním podnětům, upravuje kvalitu sekrece inzulínu (restauruje první fázi inzulinové sekrece), snižuje sekreci glukagonu, a proto snižuje výdej glukózy hepatocyty. Nevýhodou z hlediska jeho případného terapeutického užití je velmi krátký poločas účinku (2-7 minut), je degradován všudy přítomným enzymem s názvem dipeptydyl peptidáza 4. 26 Vlastní účinek gliptinů (inhibitorů DPP-4) je založen na prodloužení biologického poločasu endogenního GLP-1 (glucagon-like peptid 1). Ten zvyšuje sekreci inzulínu a snižuje sekreci glukagonu. Přímým efektem gliptinů je tedy snížení glykémie zprostředkované zvýšením sekrece inzulínu, proto vlastním nejdůležitějším efektem gliptinů je změna sekrece inzulínu (a glukagonu). Prokazatelný je vliv na glykémii nalačno, ale také na výšku postprandiální glykémie. Snížení glykémie po gliptinech je důsledkem nejen ovlivnění sekrece inzulínu, ale také přímým důsledkem snížení sekrece glukagonu, pokles glukagonémie pak vede ke snížení produkce glukózy v játrech a podílí se významně na snížení postprandiální exkurze glykémie. Na obrázku (obr. 21) lze vidět schéma postprandiální sekrece glukagonu. 26 30

Obr. 21: Postprandiální suprese sekrece glukagonu a ovlivnění evakuace žaludku 26 2.5.7.2 Sitagliptin Obr. 22: Struktura molekuly sitagliptinu Systematický název sitagliptinu je [(2R)-1-(2,4,5-trifluorophenyl)-4-oxo-4-[3- (trifluoromethyl)-5,6 dihydro [1,2,4]triazolo [4,3-a]pyrazin-7(8H)-yl] butan-2-amine] a jeho průměrná molekulová hmotnost je 407,31. Molekula sitagliptinu je na obrázku (obr. 22). Tato látka je komerčně dostupná pod názvem Januvia, Janumet, Efficib, Velmetia. Sitagliptin je selektivní inhibitor DPP-4. 27 Doporučená denní dávka je 100 mg per os. Nejvhodnější je použít sitagliptin u osob se začínajícím onemocněním. Nejsou uváděny prakticky žádné kontraindikace. 26 31

2.5.7.3 Stanovení sitagliptinu metodou HPLC/MS V uvedené metodě se sitagliptin stanovuje v lidské plazmě, která byla připravena extrakcí kapalina-kapalina. Separace probíhala na koloně Symmetry C18 (150 x 4,6 mm, 5 μm) při použití mobilní fáze složené z 0,03 % kyseliny mravenčí:acetonitrilu (3:7). Doba analýzy byla 2,0 minuty. Nejnižší limit kvantifikace je 0,1 ng/ml. Sitaglitpin se v této metodě ionizoval elektrosprejem a byl použit tojitý kvadrupól jako hmotnostní analyzátor. Při analýze sitagliptinu touto metodou byl v MS spektru přítomen protonovaný iont o m/z 408 a v MS/MS spektru jeho fragmentační produkt o m/z 235, jak je vidět z následujícího obrázku (obr. 23). 28 Obr. 23: Hmotnostní fragmentační spektrum sitagliptinu 28 32

2.5.8 Kombinování perorálních antidiabetik Porucha u diabetu 2. typu postupuje a nelze ji v současnosti odstranit. Dobře volenou léčebnou taktikou však lze zpomalit progresi diabetických komplikací. Mezi jednu z možností patří správná a včasná kombinace perorálních antidiabetik (s různým mechanismem účinku). 3 2.5.8.1 Kombinace perorálních antidiabetik s inzulínem V průběhu trvání onemocnění diabetu 2. typu se postupně mění sekrece inzulínu i stupeň inzulínové rezistence. Typ poruchy s převládající inzulínovou rezistencí se mění na poruchu s deficitem inzulínu. To vede k nutnosti doplnit léčbu inzulínem. Z perorálních antidiabetik se v kombinaci s inzulínem nejvíce používá metformin. 29 Po přidání metforminu k inzulínoterapii se snižuje potřeba inzulínu (v průměru o 10). V praxi se používá i kombinace sulfonylmočovinových antidiabetik s inzulínem. 5 Inzulín se podává podle potřeb pacienta v různou denní dobu i v různých koncentracích a různou dobou působení. 1 U obézních pacientů se také využívá kombinace s biguanidy aby nedocházelo dále ke zvyšování hmotnosti. 1 2.5.8.2 Kombinace s metforminem Metformin lze dobře použít v kombinaci se sulfonylmočovinami, glinidy a glitazony. Kombinace sulfonylmočovin, tedy zlepšení kvality i kvantity inzulinové sekrece, a metforminu, tedy zlepšení inzulinové senzitivity. Metformin lze kombinovat i s akarbózou ale tato kombinace není ideální, jelikož akarbóza snižuje vstřebávání metforminu až o 60 %. Ačkoli metformin stejně jako glitazony ovlivňuje inzuíinovou rezistenci, dochází k tomu však s naprosto odlišným mechanismem, proto je lze také kombinovat (pioglitazon i rosiglitazon). Glitazony lze s metforminem kombinovat i proto že neovlivňují farmakokinetiku metforminu. 5 33

2.5.8.3 Kombinace inhibitorů α-glukosidáz Akarbózu lze kombinovat prakticky se všemi antidiabetiky i inzulínem s výjimkou biguanidů (zvyšuje se závažnost nežádoucích účinků). 5 2.5.8.4 Kombinace rychlá inzulínová sekretagoga, glinidy, regulátory prandiální glykémie Tak jako u všech skupin je i zde výhodná kombinace s metforminem (resp. glitazony). Reálná je kombinace s inzulínem na noc. Žádnou výhodu nepřináší kombinace se sulfonylmočovinami. 2.5.8.5 Kombinace glitazonů Výhodná je kombinace s metforminem protože v tomto spojení komplexně ovlivňují inzulínovou rezistenci. Tuto skupinu látek je také vhodné kombinovat s inzulínovými sekretagogy, kdy se uplatní zejména jejich schopnost v prevenci snižování sekrece inzulínu. Glitazony jak ve spojení s metforminem, tak ve spojení se sulfonylmočovinami přispívají k dlouhodobému zlepšení kompenzace diabetu. 3 2.5.8.6 Komerčně dostupné přípravky Na trhu jsou dostupná tato léčiva, která v sobě kombinují dvě účinné látky ze skupiny perorálních antidiabetik: - Glibomet, Glucovance (metformin + glibenklamid) - Avandamet (rosiglitazon + metformin) 2 34

2.5.9 Stanovení perorálních antidiabetik Nejvíce popsaných metod pro stanovení této skupiny léčiv je spojení vysokoúčinné 11, 12, 14,17, 21, 22, 28, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37,38, 39,40, 41, kapalinové chromatografie s hmotnostní detekcí 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 a touto metodou jsou antidiabetika stanovována i v této diplomové práci. Další metody, které se dále používají pro stanovení skupiny perorálních antidiabetik jsou biologické metody 53, 54, vysokoúčinná kapalinová chromatografie 55, 56, 57, kapilární elektroforéza 58, micelární elektrokinetická chromatografie 59, optická spektrofotometrie 60, vysokoúčinná kapalinová chromatografie se spektrofotometrickou detekcí 61, nukleární magnetická rezonance, FTIR, X-ray difraktometrie 62, imunochemické metody 63, 64, průtoková cytometrie 65, měření vodivosti 66, 67 68, 69,, fluorescenční spektroskopie 70, biochemické metody 71, 72, 73, enzymatické metody 74, 75, 76, 77, 78 a cyklická voltametrie 79. 35

3. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST 3.1 Použité chemikálie Methanol (HiPerSolv CHROMANORM, Batch:134270510) Acetonitril (HiPerSolv CHROMANORM, Batch:13H001875) Deionizovaná voda (Water HPLC, LAB-SCAN, Batch:2012-2286) Kyselina mravenčí (SIGMA-ALDRICH, Batch:BCBLO330V ) Standard: Sitagliptin (Santa Cruz Biotechnology, Lot#H2713) Standard: Gliklazid (SIGMA, dried basis 99,92% - č. šarže 091K0060, kat.č. G2167-5G) Standard: Glibenklamid (SIGMA, č. šarže 075K1376, kat.č. G0639-5G) Standard: Glimepirid (SIGMA, č. šarže 085K4710, kat.č. G2295-50MG) Standard: Metformin ((1,1-dimethylbiguanide hydrochloride),sigma, č.šarže 085K02095, kat.č. D5035-25G) Standard: Gliclazide-d4 (Santa Cruz Biotechnology, Lot#D1911) Standard: Glybenclamide-d11 (Santa Cruz Biotechnology, Lot#H1111) Standard: Metformin-d6, Hydrochloride (Santa Cruz Biotechnology, Lot#H1413) Standard: Glimepiride-d5 (Santa Cruz Biotechnology, Lot#J0413) Standard: Leucin-enkefalin (SIGMA, Batch: SLBD4039V) 3.2 Vzorky klinického materiálu biologické vzorky plné krve (poskytla III. Interní klinika Fakultní nemocnice Olomouc, MUDr. Ondřej Krystyník) 3.3 Instrumentace a metody ultra-účinný kapalinový chromatograf (UPLC, Acquity, Waters) hmotnostní spektrometr (Q-qToF Premier, Waters) s ionizací elektrosprejem a hybridním analyzátorem Q-qToF 36

chromatografická kolona (XB-C18 50 2,1 mm, core-shell sorbent s velikostí částic 2,6 µm), Phenomenex, Part No. 00B-4496-AN) chromatografická kolona (Nucleodur HILIC 50 2 mm s velikostí částic sorbentu 1,8 µm, Macherey-Nagel, Lot. 38220021) Byl připraven směsný roztok standardů (glimepirid, gliklazid, glibenklamid, metformin a sitagliptin) o koncentraci 100 ng/ml a na tento standard byly optimalizovány parametry elektrosprejové ionizace pro dosažení maximálního signálu. Byly optimalizovány tyto parametry: napětí na sprejovací kapiláře, teplota desolvatace, průtok desolvatačního plynu, kolizní energie, šířka izolačního okna, napětí na extraction cone, ion guide a na vstupní štěrbině. Při optimalizaci byl kontinuálně zaváděn směsný standard o koncentraci 100 ng/ml za podmínek napodobujících chromatografickou separaci, tj. průtokem 0,6 ml/min a v rozpouštědle složeném z ACN a 0.1 % HCOOH (50:50). Optimalizace byla měřena s elektrosprejovým iontovým zdrojem v kladném režimu ionizace. Kalibrace hmotnostní škály přístroje byla prováděna na klastry mravenčanu sodného. Tab. II: Optimalizace parametrů elektrosprejové ionizce Parametr Napětí na sprejovací kapiláře Teplota desolvatace Průtok dsolvatačního plynu Kolizní energie Rozmezí optimalizace Interval Vybraná hodnota optimalizace 1 kv -3 kv 0,5 kv 3 kv 200 ºC - 500 ºC 100 ºC 500 ºC 200 l/hod 1000 l/hod 5 V - 30 V 5 V 200 l/hod 1000 l/hod glimepirid 10 V ostatní 15 V Šířka izolačního 2 14 1.00 8 okna extraction cone 0 8 1 6 ion guide 1 5 1 2 sampling cone 10 V - 60 V 10 V 20 V 37

Separace gliklazidu, glibenklamidu, glimepiridu a sitagliptinu byla prováděna na koloně Kinetex XB-C18 gradientovou elucí směsí 0,5% vodné kys. mravenčí (A) a acetonitrilu (B). Profil gradientu je uveden v tab. III. Zpomalení průtoku v čase 2,90 4,00 minutě mělo za cíl umožnit provedení dostatečného počtu skenů během eluce glimepiridu a glibenklamidu (a odpovídajících izotopově značených standardů), které kolonu opuštěly těsně za sebou. Tab. III: Průběh gradientu mobilní fáze u oktadecylové kolony Čas (min) Průtok (ml/min) A (%) B (%) 0,600 85,0 15,0 1.00 0,600 85,0 15,0 2.50 0,600 45,0 55,0 2.90 0,150 4,0 96,0 4.00 0,150 0,0 100,0 5.00 0,600 85,0 15,0 Metformin byl separován na koloně HILIC gradientovou elucí pomocí stejné mobilní fáze, jaká byla použita pro separaci ostatních analytů na fázi C18. Doba separace činila 2,5 min a profil gradientu je uveden v tabulce (Tab. IV): Tab. IV: Průběh gradientu mobilní fáze u HILIC kolony Čas (min) Průtok (ml/min) A (%) B (%) 0,600 1,0 99,0 0.75 0,600 1,0 99,0 1.00 0,600 30,0 70,0 2.00 0,600 60,0 40,0 2.50 0,600 1,0 99,0 38

Během každé analýzy byl do tzv. referentního elektrospreje iontového zdroje přiváděn průtokovou rychlostí 5 μl/min standard Leu-Enk o koncentraci 100 μg/l umožňující průběžnou korekci případných odchylek kalibrace škály m/z. Kvantifikace antidiabetik byla provedena metodou kalibrační křivky za použití vnitřních deuteriovaných standardů glimepiridu, gliklazidu, glibenklamidu a metforminu. Analyty byly sledovány technikou MRM (multiple reaction monitoring), pro kterou byl vždy využit nejintenzivnější produktový ion v kolizním spektru. Doba každého skenu činila 0,2 s a prodleva mezi jednotlivými skeny byla nastavena na 0,02 s. Při přípravě roztoků antidiabetik pro měření kalibrační závislosti byly nejdříve připraveny roztoky jednotlivých standardů antidiabetik v methanolu o koncentraci 0,2 mg/ml a postupným ředěním do acetonitrilu byly postupně připraveny nižší koncentrace. Každý koncentrační bod kalibrační přímky byl připraven smícháním 100μl plazmy a 200μl acetonitrilu v němž byly obsaženy standardy antidiabetik a deuteriované standardy antidiabetik o dané koncentraci. Tento roztok byl dále centrifugován, po dobu 5 minut při 14000 rpm, poté byl odebrán supernatant, který byl dusíkem odpařen na objem 100μl. Posledním krokem bylo přefiltrování roztoku přes diskový mikrofiltr (Filtr VWR, 13mm Syringe Filter, w/0,45 μm PTFE Membrane, Batch: 21812270). Koncentrace jednotlivých bodů kalibrační závislosti byly 10 ng/ml, 30 ng/ml, 100 ng/ml, 300 ng/ml, 1000 ng/ml a 3000 ng/ml. Každá koncentrační úroveň kalibrační závislosti byla proměřena třikrát výše popsanými metodami. Mezidenní reprodukovatelnost metody byla měřena ve třech po sobě následujících dnech a intradenní reprodukovatelnost byla měřena třikrát v jednom dni. Měřili se dvě koncentrace standardů antidiabetik 100 ng/ml a 1000 ng/ml. Každá koncentrace byla proměřena šest krát v jednom dni (popř. osmnáctkrát v jednom dni). Opakovatelnost byla vyhodnocena ze šesti bezprostředně po sobě jdoucích měření. Měřeny byly standardy perorálních antidiabetik o koncentracích 100 ng/ml a 1000 ng/ml. Mez detekce a kvantifikace se měřila na sérii standardů o koncentracích 10ng/ml, 30 ng/ml a 100 ng/ml výše popsanými metodami. Dále byly měřeny vzorky plazmy pacientů, kteří užívali uvedené substance. K samotnému stanovení bylo odpipetováno 100 μl plazmy (odstředěné nesrážlivé krve na centrifuze) ke kterému bylo přidáno 200 μl acetonitrilu (ve kterém byly přítomny izotopově 39

značené vnitřní standardy stanovovaných substancí). Tento roztok byl centrifugován a poté byl odebrán supernatant, který byl odpařen pod dusíkem na konečný objem 100μl. Tento roztok byl dále přefiltrován přes diskový mikrofiltr a byl nastříknut. 40

4. VÝSLEDKY A DISKUZE 4.1 Výběr stanovovaných perorálních antidiabetik Největší spotřeba perorálních antidiabetik za rok 2012 v České republice připadá na metformin, glimepirid a gliklazid (tvoří 85%). Tyto údaje lze vyčíst z níže uvedené tabulky (Tab. V), která pochází z databáze Státního ústavu pro kontrolu léčiv, dostupné v programu AISLP. Důležitý údaj je počet DDD (definovaných denních dávek) ten umožňuje porovnat spotřeby mezi sebou. Metformin, glimepirid a gliklazid tvoří s glibenklamidem a sitagliptinem 89 % v ČR předepisovaných anitidiabetik, dohromady také pokrývají tři třídy dostupných antidiabetik a proto byly tyto látky vybrány. 41

Tab. V: Spotřeba perorálních antidiabetik v roce 2012 Tab. V: Spotřeba perorálních antidiabetik v ro Skupina DDD Podíl na perorálních Druh antidiabetika Celkem celkem spotřebě antidiabetik Biguanidy Metformin 536 470 313 Kč 96 554 806 43% Glibenklamid 6 858 156 Kč 6 315 240 3% Glipizid 4 771 620 Kč 1 947 855 1% Deriváty Gliquidon 15 105 012 Kč 2 435 790 1% sulfonylmočoviny Gliklazid 111 300 946 Kč 25 202 340 11% Glimepirid 117 958 012 Kč 68 241 105 30% Kombinace perorálních Metformin a sulfonamidy 8 202 804 Kč 1 432 980 1% antidiabetik Metformin a pioglitazon 71 404 506 Kč 1 603 840 1% Metformin a sitagliptin 163 029 426 Kč 3 470 488 2% Metformin a vildagliptin 190 556 289 Kč 3 935 970 2% Inhibitory alfaglukosidázy Akarbóza 7 876 656 Kč 720 610 0% Thiazolidindiony Pioglitazon 71 333 467 Kč 2 129 078 1% Sitagliptin 178 191 116 Kč 4 058 488 2% Inhibitory Vildagliptin 50 008 782 Kč 1 098 524 0% dipeptidylpeptydázy 4 Saxagliptin 57 190 760 Kč 1 274 760 1% Linagliptin 34 012 697 Kč není údaj není údaj Repaglinid 10 047 919 Kč 868 789 0% Jiná antidiabetika, Exenatid 35 737 152 Kč 487 780 0% kromě inzulinů Liraglutid 188 639 454 Kč 1 963 860 1% 223 742 303 100% 42

4.2 Chromatografická separace a hmotnostně spektrometrická data standardů Při vývoji metody bylo snahou nalézt podmínky, za kterých by všechny analyty měly dostatečnou retenci a byly vzájemně odděleny. Při separacích na nepolární stacionární fázi (kolona Kinetex XB-C18) nebylo dosaženo retence metforminu, který se i při minimálním obsahu organické složky v mobilní fázi (2 %) eluoval v mrtvém čase. Toto chování bylo prakticky nezávislé na složení mobilní fáze (voda : acetonitril, 0,5 % kyselina mravenčí : acetonitril, 10 mmol octan amonný : acetonitril, 10 mmol octan amonný ph=7 : acetonitril, 0,5 % kyselina mravenčí : 20 % butylmethylether v acetonitrilu, 0,5 % kyselina mravenčí : 50 % tetrahydrofuran v acetonitrilu, 0,05 a 0,1% trifluoroctová kyselina : acetonitril). Určité retence metformimu bylo dosaženo pouze při použití kys. trifluoroctové jako aditiva v mobilní fázi, nicméně současně došlo k významnému zhoršení symetrie píků a intenzity signálu u ostatních analytů. Stejný výsledek byl dosažen při použití další nepolární stacionární fáze (Waters Acquity UPLC BEH C18 50 2,1 mm s velikostí částic sorbentu 1,7 µm, part no. 186002350, lot no. 0195312431). Nulová retence metforminu je důsledkem jeho polární až iontové povahy (při běžném ph použitelném pro separaci existuje metformin ve formě kationtu, jeho pk a jsou 2,8 a 11,51) 80. Z tohoto důvodu bylo přistoupeno k pokusu o separaci v režimu HILIC (hydrofilní interakční chromatografie). Přestože bylo dosaženo retence metforminu i sitaglitpinu, v mrtvém čase se naopak eluovaly gliklazid, glibenklamid a glimepirid. Z výše uvedených důvodů bylo učiněno rozhodnutí použít dvoukolonový režim separace, kdy vzorek byl nastříknut postupně na kolonu HILIC ke stanovení metforminu a následně byl další podíl vzorku nastříknut na kolonu s nepolární stacionární fází pro stanovení ostatních analytů. Mobilní fáze (0,5 % kys. mravenčí ve vodě a acetonitril) byly pro oba způsoby separace společné, pouze směr gradientu byl opačný. To dovoluje aplikovat metodu i na jednodušších chromatografických systémech, které umožňují odběr pouze ze dvou zásobníků mobilní fáze. Přepínání kolon bylo prováděno integrovaným selekčním ventilem. U jiných systémů bez možnosti přepínání kolon je dokonce možné díky společné mobilní fázi spojit kolony sériově; takové uspořádání bylo také úspěšně otestováno. 43

Základem pro kvantitativní vyhodnocování antidiabetik (sitagliptinu, metforminu, gliklazidu, glibenklamidu a glimepiridu) v plazmě byly normalizované intenzity píků antidiabetik, tj. poměr intenzit píků analytů (sitagliptinu, metforminu, gliklazidu, glibenklamidu a glimepiridu) a jejich deuteriovaných standardů (metforminu, gliklazidu, glibenklamidu a glimepiridu) v součtovém spektru vzniklém sčítáním všech skenů v oblasti chromatografického píku daného antidiabetika. Pro sitagliptin nebyl použit deuteriovaný standard a proto se jeho intenzita korigovala na deuteriovaný standard gliklazidu. Rekonstruované iontové chromatogramy a spektra standardů jednotlivých antidiabetik jsou na následujících obrázcích (Obr. 24-39): 4.2.1 Rekonstruované iontové chromatogramy standardů Obr. 24: Rekonstruovaný iontový chromatogram a) standardu sitagliptinu (m/z 408), gliklazidu (m/z 324), glibenklamidu (m/z 494) a glimepiridu (m/z 491) o koncentracích 1000 ng/ml ve vodě b) deuteriovaných standardů perorálních antidiabetik (gliklazid (m/z 328), glibenklamid (m/z 505) a glimepirid (m/z 496)) o koncentracích 300 ng/ml v plazmě 44

Obr. 25: Rekonstruovaný iontový chromatogram a) standardu metforminu (m/z 130) o koncentraci 1000 ng/ml ve vodě a b) deuteriovaného standardu metforminu (m/z 136) o koncentraci 300 ng/ml v plazmě 4.2.2 MS spektra Obr. 26: MS spektrum zprůměrované z chromatografické separace standardu sitagliptinu o koncentraci 1000 ng/ml v retenčním čase 1,39-1,53 min 45

Obr. 27: MS spektrum zprůměrované z chromatografické separace standardu gliklazidu o koncentraci 1000 ng/ml v retenčním čase 2,59-2,67 min Obr. 28: MS spektrum zprůměrované z chromatografické separace standardu glibenklamidu o koncentraci 1000 ng/ml v retenčním čase 3,30-3,55 min Obr. 29: MS spektrum zprůměrované z chromatografické separace standardu glimepiridu o koncentraci 1000 ng/ml v retenčním čase 3,56-3,75 min 46

Obr. 30: MS spektrum zprůměrované z chromatografické separace standardu metforminu o koncentraci 1000 ng/ml v retenčním čase 1,46-1,56 min 4.2.3 MS/MS spektra a) Standardy sitagliptinu, gliklazidu, glibenklamidu, glimepiridu a metforminu Obr. 31: MS/MS spektrum iontu (m/z 408) v retenčním čase 1,39-1,53 min standardu sitagliptinu o koncentraci 1000 ng/ml Obr. 32: MS/MS spektrum iontu (m/z 324) v retenčním čase 2,59-2,67 min standardu gliklazidu o koncentraci 1000 ng/ml 47

Obr. 33: MS/MS spektrum iontu (m/z 494) v retenčním čase 3,30-3,55 min standardu glibenklamidu o koncentraci 1000 ng/ml Obr. 34: MS/MS spektrum iontu (m/z 491) v retenčním čase 3,56-3,75 min standardu glimepiridu o koncentraci 1000 ng/ml Obr. 35: MS/MS spektrum iontu (m/z 130) v retenčním čase 1,46-1,56 min standardu metforminu o koncentraci 1000 ng/ml 48

b) Deuteriované standardy gliklazidu, glibenklamidu, glimepiridu a metforminu Obr. 36: MS/MS spektrum iontu (m/z 328) v retenčním čase 2,59-2,67 min deuteriovaného standardu gliklazidu o koncentraci 300 ng/ml Obr. 37: MS/MS spektrum iontu (m/z 505) v retenčním čase 3,30-3,55 min deuteriovaného standardu glibenklamidu o koncentraci 300 ng/ml Obr. 38: MS/MS spektrum iontu (m/z 496) v retenčním čase 3,56-3,75 min deuteriovaného standardu glimepiridu o koncentraci 300 ng/ml 49

Obr. 39: MS/MS spektrum iontu (m/z 136) v retenčním čase 1,46 1,56 min deuteriovaného standardu metforminu o koncentraci 300 ng/ml 50

4.2.4 Kolizí indukovaná disociace Sitagliptin Navrhovaný průběh kolizí indukované disociace sitagliptinu v kladném režimu je zobrazen na následujícím obrázku (obr. 40): +H + +H + +H + Obr. 40: Fragmentace iontu m/z 408 51

Gliklazid Navrhovaný průběh kolizí indukované disociace gliklazidu v kladném režimu je zobrazen na následujícím obrázku (obr. 41): +H + +H + označení míst izotopového značení deuteriovaných standardů (gliklazid d4) Obr. 41: Fragmentace iontu m/z 127 52

Glibenklamid Navrhovaný průběh kolizí indukované disociace glibenklamidu v kladném režimu je zobrazen na následujícím obrázku (obr. 42): +H + +H + +H + označení míst izotopového značení deuteriovaných standardů (glibenklamid d 11) Obr. 42: Fragmentace iontu m/z 494 53

Glimepirid Navrhovaný průběh kolizí indukované disociace glimepiridu v kladném režimu je zobrazen na následujícím obrázku (obr. 43): +H + +H + označení míst izotopového značení deuteriovaných standardů (glimepirid d5) Obr. 43: Fragmentace iontu m/z 491 54

Metformin Navrhovaný průběh kolizí indukované disociace metforminu v kladném režimu je zobrazen na následujícím obrázku (obr. 44): +H + +H + +H + označení míst izotopového značení deuteriovaných standardů (metformin d6) Obr. 44: Fragmentace iontu m/z 130 55

4.3 Mez detekce a stanovitelnosti Mez detekce byla určena početně ze vzorce (viz. obr. č. 39) a vizuálně jako koncentrace kalibrantu, který poskytl poměr signálu kalibrantu a šumu vyšší než 3. Mez stanovitelnosti byla určena vizuálně jako koncentrace kalibrantu, který poskytl poměr signálu kalibrantu a šumu vyšší než 10. Obr. 45: Vzorec pro výpočet limity detekce 81 Obr. 46: Vzorec pro výpočet limity kvantifikace 81 σ.... SD úseku kalibrační přímky S.... směrnice kalibrační přímky 56

4.3.1 Metformin Vizuálně: Výpočtem: - mez detekce je 30 ng/ml - mez detekce je 57,7 ng/ml Obr. 47: Mez detekce rekonstruovaný iontový chromatogram fragmentu metforminu (m/z 71) o koncentraci 30 ng/ml Vizuálně: Výpočtem: - mez stanovitelnosti je 100 ng/ml - mez stanovitelnosti je 175 ng/ml Obr. 48: Mez stanovitelnosti rekonstruovaný iontový chromatogram fragmentu metforminu (m/z 71) o koncentraci 100 ng/ml 57

4.3.2 Sitagliptin Vizuálně: Výpočtem: - mez detekce je 10 ng/ml - mez detekce je 25,4 ng/ml Obr. 49: Mez detekce rekonstruovaný iontový chromatogram fragmentu sitagliptinu (m/z 235) o koncentraci 10 ng/ml Vizuálně: Výpočtem: - mez stanovitelnosti je 100 ng/ml - mez stanovitelnosti je 77,1 ng/ml Obr. 50: Mez stanovitelnosti rekonstruovaný iontový chromatogram fragmentu sitagliptinu (m/z 235) o koncentraci 100 ng/ml 58

4.3.3 Gliklazid Vizuálně: Výpočtem: - mez detekce je 10 ng/ml - mez detekce je 39 ng/ml Obr. 51: Mez detekce rekonstruovaný iontový chromatogram fragmentu gliklazidu (m/z 127) o koncentraci 10 ng/ml Vizuálně: Výpočtem: - mez stanovitelnosti je 100 ng/ml - mez stanovitelnosti je 117 ng/ml Obr. 52: Mez stanovitelnosti rekonstruovaný iontový chromatogram fragmentu gliklazidu (m/z 127) o koncentraci 100 ng/ml 59

4.3.4 Glibenklamid Vizuálně: Výpočtem: - mez detekce je 10 ng/ml - mez detekce je 58,2 ng/ml Obr. 53: Mez detekce rekonstruovaný iontový chromatogram fragmentu glibenklamidu (m/z 369) o koncentraci 10 ng/ml Vizuálně: Výpočtem: - mez stanovitelnosti je 100 ng/ml - mez stanovitelnosti je 176 ng/ml Obr. 54: Mez stanovitelnosti rekonstruovaný iontový chromatogram fragmentu glibenklamidu (m/z 369) o koncentraci 100 ng/ml 60

4.3.5 Glimepirid Vizuálně: Výpočtem: - mez detekce je 10 ng/ml - mez detekce je 4,1 ng/ml Obr. 55: Mez detekce rekonstruovaný iontový chromatogram fragmentu glimepiridu (m/z 352) o koncentraci 10 ng/ml Vizuálně: Výpočtem: - mez stanovitelnosti je 100 ng/ml - mez stanovitelnosti je 12 ng/ml Obr. 56: Mez stanovitelnosti rekonstruovaný iontový chromatogram fragmentu glimepiridu (m/z 352) o koncentraci 100 ng/ml 61

4.4 Opakovatelnost a reprodukovatelnost Opakovatelnost a reprodukovatelnost byly vyhodnocovány z šesti po sobě jdoucích měření, v případě reprodukovatelnosti (intradenní) opakovaných třikrát během jednoho dne resp. během tří různých dnů (mezidenní). Získané hodnoty jsme otestovali Q-testem (Dean-Dixonovým testem) na hladině významnosti α=0,05. Dean-Dixonův test slouží jako test pro vylučování odlehlých výsledků. Žádná ze získaných hodnot nebyla odlehlá. Všechny tři dvojice průměrů ze šesti měření u intradenní i mezidenní reprodukovatelnosti byly otestovány Studentovým t-testem shodnosti aritmetických průměrů, všechny dvojice byly vyhodnoceny jako shodné. 4.4.1 Reprodukovatelnost Tab. VI: Interdenní a intradenní reprodukovatelnosti Látka Interdenní reprodukovatelnost Koncentrace (ng/ml) RSD (%) Koncentrace (ng/ml) RSD (%) Metformin 100 6,8 100 4,0 Sitagliptin 100 4,4 100 2,0 Gliklazid 100 4,0 100 2,1 Glibenklamid 100 16,6 100 3,3 Glimepirid 100 4,4 100 3,0 Látka Intradenní reprodukovatelnost Koncentrace (ng/ml) RSD (%) Koncentrace (ng/ml) RSD (%) Metformin 100 10,5 100 2,4 Sitagliptin 100 8,2 100 2,9 Gliklazid 100 3,3 100 2,7 Glibenklamid 100 24,1 100 3,5 Glimepirid 100 5,5 100 3,8 62

4.4.2 Opakovatelnost Tab. VII: Opakovatelnost Látka Koncentrace (ng/ml) Opakovatelnost RSD (%) Koncentrace (ng/ml) RSD (%) Metformin 100 5,8 1000 4,2 Sitagliptin 100 3,1 1000 1,8 Gliklazid 100 3,5 1000 2,6 Glibenklamid 100 10,2 1000 3,4 Glimepirid 100 3,5 1000 1,6 63

Normalizovaná intenzita Normalizovaná intenzita 4.4 Kalibrační křivky Závislost normalizované intenzity metforminu na koncentraci 6 5 4 3 2 1 0 y = 0,001628x + 0,031649 R² = 0,999499 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 Koncentrace (ng/ml) Obr. 57: Závislost normalizované intenzity metforminu na koncentraci Závislost normalizované intenzity sitagliptinu na koncentraci 10 8 6 y = 0,002825x + 0,079913 R² = 0, 996965 4 2 0 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 Koncentrace (ng/ml) Obr. 58: Závislost normalizované intenzity sitagliptinu na koncentraci 64

Normalizovaná intenzita Normalizovaná intenzita 6 5 4 3 2 1 0 Závislost normalizované intenzity gliklazidu na koncentraci y = 0,001766x + 0,086541 R² = 0,992884 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 Koncentraci (ng/ml) Obr. 59: Závislost normalizované intenzity gliklazidu na koncentraci 7 6 5 Závislost normalizované intenzity glimepiridu na koncentraci y = 0,002001x + 0,055506 R² = 0,997429 4 3 2 1 0 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 Koncentrace (ng/ml) Obr. 60: Závislost normalizované intenzity glimepiridu na koncentraci 65

Normalizovaná intenzita Závislost normalizované intenzity glibenklamidu na koncentraci 10 8 6 y = 0,002975x + 0,049768 R² = 0,999073 4 2 0 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 Koncentrace (ng/ml) Obr. 61: Závislost normalizované intenzity glibenklamidu na koncentraci 66

4.6. Stanovení koncentrace antidiabetik v plazmě K dispozici bylo celkem 11 vzorků pacientů užívající perorální antidiabetika. Ukázka výpočtu obsahu substance z regerese kalibrační přímky a spekter stanovení koncentrace perorálních antidiabetik u pacienta č. 2 (metformin) a pacienta č. 11 (glimepirid a gliklazid): 4.6.1 Pacient č. 2 - rovnice regrese metforminu: y = 0,001628x + 0,031645 - průměrná normalizovaná intenzita metforminu: 2,615 (RSD 4,0 %) y = 0,001628x + 0,031645 2,615 = 0,001628x + 0,031645 X Metformin = 1587 ng/ml (± 63 ng/ml) U tohoto pacienta byl stanoven metformin v koncentraci 1587 ng/ml. Ukázky spekter u pacienta č. 2: Obr. 62: Rekonstruovaný iontový chromatogram fragmentu metforminu (m/z 71) v plazmě (BLANK) Obr. 63: Rekonstruovaný iontový chromatogram fragmentu metforminu (m/z 71) v plazmě pacienta č. 2 67

Obr. 64: MS/MS spektrum iontu (m/z 130) metforminu v plazmě pacienta č. 2 4.6.2 Pacient č. 11 - rovnice regrese gliklazidu: y = 0,001766x + 0,086541 - průměrná normalizovaná intenzita gliklazidu: 4,25 (RSD 2,1 %) y = 0,001766x + 0,086541 X Gliklazid = 2358 ng/ml (± 50 ng/ml) - rovnice regrese glimepiridu: y = 0,002001x + 0,055506 - průměrná normalizovaná intenzita glimepiridu: 0,241 (RSD 4,4 %) y = 0,002001x + 0,055506 X Glimepiridu = 93 ng/ml (± 4 ng/ml) U tohoto pacienta č. 11 byl stanoven gliklazid v koncentraci 2358 ng/ml a glimepirid v koncentraci 93 ng/ml. 68

Ukázky spekter u pacienta č. 11: Obr. 65: Rekonstruovaný iontový chromatogram perorálních antidiabetik (sitagliptin (m/z 235), gliklazid (m/z 127), glibenklamid (m/z 369) a glimepirid (m/z 352)) v čísté plazmě (BLANK) Obr. 66: Rekonstruovaný iontový chromatogram fragmentu gliklazidu (m/z 127) v plazmě pacienta č. 11 Obr. 67: MS/MS spektrum iontu (m/z 324) gliklazidu v plazmě pacienta č. 11 69