ELISAVIDITEST antivca EBV IgM OD287 Návod k použití soupravy VÝROBCE: VIDIA spol. s r.o., Nad Safinou II č. 365, Vestec, 252 42 Jesenice, www.vidia.cz, tel.: 420 261 090 565 1. NÁZEV SOUPRAVY ELISAVIDITEST antivca EBV IgM ELISA souprava pro detekci protilátek třídy IgM proti kapsidovému antigenu (VCA) viru EpsteinBarrové (EBV). 2. POUŽITÍ Souprava je určena pro diagnostiku chorob vyvolaných nebo asociovaných s EBV jako jsou infekční mononukleóza a chronická aktivní EBV infekce. Test se používá též při diagnostice Burkittova lymfomu, nasofaryngeálního karcinomu, karcinomů Waldayerova okruhu a k charakterizaci oportunních (oligo nebo polyklonálních) lymfomů. Najde uplatnění při komplexní charakterizaci chronického únavového syndromu a řady imunodeficientních stavů, kde bývá EBV často aktivován. 3. PRINCIP TESTU ELISAVIDITEST antivca EBV IgM je imunoanalytický test na pevné fázi. Na povrch jamek je navázán specifický antigen, který reprezentuje imunodominantní epitopy VCA komplexu. Jsouli v testovaných sérech příslušné protilátky, navážou se na imobilizované proteiny. Navázané protilátky pak v dalším kroku reagují s protilátkami proti lidskému IgM značenými křenovou peroxidázou. Množství navázaných značených protilátek se stanoví barevnou enzymatickou reakcí. Negativní séra nereagují, mírná změna v zabarvení jamek je pozadím reakce. Ředicí roztok plus obsahuje antilidské IgG protilátky určené k vysycení IgG a revmatoidního faktoru (RF). Lze jej připravit vhodným smícháním ředicího roztoku r.t.u. a RF sorbentu dle návodu. 4. OBSAH SOUPRAVY ELISA odlamovací stripy v manipulačním rámečku, potažené specifickým antigenem STRIPS Ag 1 x 12 ks 1,3 ml negativního kontrolního séra r.t.u. 1) CONTROL 1 lahvička 1,3 ml kalibrátoru r.t.u. CAL 1 lahvička 1,3 ml pozitivního kontrolního séra r.t.u. CONTROL 1 lahvička 13 ml protilátek proti lidskému IgM značených peroxidázou (konjugát antiigm Px) r.t.u. CONJ 1 lahvička 125 ml promývacího roztoku 10x konc. WASH 10x 1 lahvička 100 ml ředicího roztoku r.t.u. DIL (pro ředění sér a přípravu DIL PLUS) 1 lahvička 1,0 ml RF sorbentu 51x konc. RF SORB 51x 1 lahvička 13 ml chromogensubstrátového roztoku TMB r.t.u. TMB 1 lahvička 13 ml stop roztoku r.t.u. STOP 1 lahvička Sáček se zipem Návod k použití soupravy Certifikát kontroly kvality 1) r.t.u., ready to use (v pracovní koncentraci) 1
5. POTŘEBNÝ MATERIÁL NEDODÁVANÝ SE SOUPRAVOU Destilovaná/deionizovaná voda pro ředění promývacího roztoku, pipetovací zařízení, zařízení pro rozplňování roztoků a promývání stripů, spektrofotometr/kolorimetr. 6. PŘÍPRAVA REAGENCIÍ a. Vytemperujte všechny složky soupravy na laboratorní teplotu. b. Těsně před vyšetřením důkladně zamíchejte vzorky vyšetřovaných sér, kontrolní séra a kalibrátor. Připravte si ředicí roztok plus (DIL PLUS) pro ředění sér následujícím způsobem: Přidejte 1 díl RF sorbentu k 50 dílům ředicího roztoku r.t.u. ředění 51x (např. 1 ml RF sorbentu 50 ml ředicího roztoku r.t.u.). Řeďte jen takové množství, které spotřebujete pro ředění sér v testu. Testovaná séra řeďte připraveným ředicím roztokem plus 101x (např. 5μL séra 500 μl ředicího roztoku plus). Ředicí roztok plus obsahuje antilidské IgG protilátky určené k vysycení IgG a revmatoidního faktoru (RF). Pro ředění sér lze použít i ředicí roztok r.t.u.. Kontrolní séra a kalibrátor neřeďte, jsou v pracovní koncentraci (r.t.u., ready to use). c. Připravte si pracovní koncentraci promývacího roztoku jeho naředěním 10x ve vhodném objemu destilované/deionizované vody (např. 100 ml promývacího roztoku 900 ml H 2 O). Pokud jsou v koncentrovaném roztoku krystaly soli, zahřejte ho na vodní lázni na 32 až 37 o C a před naředěním dobře promíchejte. Nespotřebovaný promývací roztok v pracovní koncentraci lze skladovat 1 týden při teplotě 2 až 10 o C. d. Konjugát antiigm Px, chromogensubstrátový roztok TMB a stop roztok neřeďte, jsou v pracovní koncentraci (r.t.u.). 7. PRACOVNÍ POSTUP a. Stripy, vakuově zatavené s desikantem, nechte před otevřením sáčku vytemperovat na laboratorní teplotu, aby nedošlo k orosení destičky. Připravte si potřebný počet stripů pro reakci. Nepoužité stripy společně s desikantem dobře uzavřete do sáčku se zipem nebo vakuově zatavte. b. Naplňte příslušné jamky po 100 μl jednotlivými kontrolními séry, kalibrátorem a ředěnými testovanými séry podle následujícího schématu (viz Tab. 1): Naplňte první jamku samotným ředicím roztokem plus pro stanovení pozadí reakce (DIL PLUS). Další dvě jamky naplňte Kalibrátorem (CAL) a jednu jamku negativním kontrolním sérem (CONTROL ). Zbývající jamky naplňte ředěnými testovanými séry (S1, S2, S3, ). Pro kontrolu je vhodné aplikovat také pozitivní kontrolní sérum (CONTROL ). Každé sérum stačí aplikovat na jednu jamku. Pokud chcete vyloučit případnou laboratorní chybu, aplikujte Kalibrátor na tři jamky, vyšetřovaná a kontrolní séra aplikujte po dvou jamkách. Inkubujte 30 minut (/ 2 min.) při laboratorní teplotě. c. Odsajte obsah jamek do pojistné sběrné láhve obsahující vhodný dezinfekční prostředek (viz Bezpečnostní předpisy). Jamky poté 4x promyjte 250 μl promývacího roztoku. Vyvarujte se přetékání roztoku ven z jamek. Obsah jamek odsajte a destičku vyklepněte na přířez buničité vaty. d. Důkladně promíchejte lahvičku s konjugátem antiigm Px r.t.u. (CONJ) a napipetujte do jamek po 100 μl konjugátu. Inkubujte 60 minut (/5 min.) při laboratorní teplotě. e. Tekutinu z jamek odsajte a promyjte je 4x 250 μl promývacího roztoku (viz bod c.). Odsajte a vyklepněte. f. Napipetujte do jamek po 100 μl chromogensubstrátového roztoku TMB. Inkubujte 10 minut (/30 sec.) v temnu při laboratorní teplotě. Dobu inkubace začněte měřit po napipetování 1. stripu destičky. Dodržujte toto pravidlo, vyvarujete se tak nedodržení časového intervalu. Pipetujte rychle v pravidelném rytmu, případně použijte vhodný dispenzor. Překryjte stripy alobalem, neprůhledným víčkem, nebo je po dobu reakce uložte na temné místo. 2
g. Zastavte reakci přidáním 100 μl stop roztoku. Pipetujte ve stejném rytmu jako při rozplňování chromogensubstrátového roztoku TMB, aby enzymatická reakce probíhala ve všech jamkách po stejnou dobu. Zkontrolujte, zda nejsou v jamkách bubliny, pokud ano, jemným poklepem na rámeček destičky je odstraňte. h. Intenzitu barevné reakce změřte na spektrofotometru/kolorimetru při 450 nm nejpozději do 20 minut po zastavení reakce. Doporučujeme použít referenční filtr 620690 nm. Tab. 1: Schéma aplikace vzorků 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 a DIL PLUS S5 b CAL S c CAL d CONTROL e S1 f S2 g S3 h S4 8. HODNOCENÍ TESTU Nejdříve odečtěte absorbanci jamky se samotným ředicím roztokem plus (DIL PLUS = pozadí reakce) od hodnot kontrolních, testovaných sér a kalibrátoru. 8.1. Kvalitativní orientační hodnocení 1. Spočítejte průměrnou hodnotu OD Kalibrátoru (CAL). Pokud aplikujete tři jamky kalibrátoru a některá z těchto hodnot se liší o více než 20% od průměru, nepoužívejte ji k výpočtu a spočítejte průměr ze zbývajících dvou hodnot. 2. Stanovte cutoff hodnotu tak, že průměrnou hodnotu OD Kalibrátoru vynásobíte korekčním faktorem. Hodnota korekčního faktoru kalibrátoru se určuje pro každou šarži soupravy a je uvedena v Certifikátu kontroly kvality dané šarže. 3. Séra s hodnotou OD < 90% cutoff jsou negativní a séra s hodnotou OD > 110% cutoff jsou považována za pozitivní. Vzorky s OD v rozmezí 90110% cutoff jsou hraniční (viz Pozn.). 8.2. Semikvantitativní hodnocení Stanovte hodnotu indexu pro jednotlivé vzorky sér: 1. Nejdříve stanovte cutoff hodnotu jako v předešlém způsobu hodnocení (čl.8.1., bod 2). 2. Stanovte hodnotu indexu pro jednotlivé vzorky sér tak, že vydělíte OD testovaného séra cutoff hodnotou. 3. Odečtěte v tabulce (viz HODNOCENÍ VÝSLEDKŮ) odpovídající stupeň reaktivity séra. HODNOCENÍ VÝSLEDKŮ: Hodnota indexu Vyhodnocení < 0,90 Negativní 0,90 1,10 / 1,11 4,00 4,01 6,50 6,51 12,00 > 12,00 3
Příklad: Získaná OD kalibrátoru = 0,994; 1,010; 1,094 Průměrná hodnota OD kalibrátoru = 1,033 OD vzorku séra = 0,950 Korekční faktor kalibrátoru = 0,17 Cutoff hodnota = 1,033 x 0,17 = 0,176 Hodnota indexu = 0,950 / 0,176 = 5,40 Pozn.: Hodnocení / znamená, že sérum leží v rozmezí šedé zóny. V případě tohoto výsledku test opakujte. Ležíli sérum po opakovaném testování opět v rozmezí šedé zóny, opakujte testování alternativní metodou nebo použijte sérum odebrané od téhož jedince o 12 týdny později. 9. INTERPRETACE VÝSLEDKŮ VCA VCA VCA EA (D) EBNA1 EBNA1 Stadium EBV infekce IgM IgG IgA IgG IgG IgM EBV negativní Primární EBV infekce (časná fáze) / Primární EBV infekce (transientní fáze) Primární EBV infekce (fáze rekonvalescence) Seropozitivní bez známek aktivní EBV infekce Reaktivovaná EBV infekce* * Při reaktivaci EBV je protilátková odpověď ve třídě IgM slabá a nemusí být vždy v ELISA prokazatelná. Poznámka: Přítomnost revmatoidního faktoru (RF) může interferovat se stanovením IgM protilátek. RF je proto v průběhu testu vysycen RF sorbentem, který je obsažen v ředicím roztoku plus. Pro vyšetření protilátek proti dalším antigenům nabízí VIDIA tyto soupravy: ELISAVIDITEST antiebna1 EBV IgG a IgM; ELISAVIDITEST antivca EBV IgG (CSF) a IgA; ELISAVIDITEST antiea (D) EBV IgG. Pro konfirmační vyšetření lze použít IFVIDITEST antivca EBV IgG a IgM; IFVIDITEST antiea EBV (DR nebo D) IgG. 10. CHARAKTERISTIKY TESTU 10.1. Platnost testu Hodnota OD Kalibrátoru (CAL) by měla být v rozmezí uvedeném v Certifikátu kontroly kvality dané šarže. Hodnota OD negativního kontrolního séra (CONTROL ) by měla být < 0,200. Hodnoty absorbancí kontrolních sér by měly být: CONTROL < CAL < (CONTROL ). 10.2. Přesnost testu Pro stanovení variability mezi jednotlivými testy reprodukovatelnost (interassay) a během testu opakovatelnost (intraassay) bylo provedeno srovnání vzorků s různými hodnotami OD. 4
10.2.1. Opakovatelnost (intraassay) Variační koeficient opakovatelnosti je maximálně 5%. Je měřen pro každou šarži minimálně na 12 paralelních jamkách téže destičky. Příklad: (n = počet paralelních jamek na téže destičce) n A ±σ CV opak. 16 1,335 0,050 3,8 % 16 0,614 0,023 3,7 % 10.2.2. Reprodukovatelnost (interassay) Variační koeficient reprodukovatelnosti je maximálně 15%. Je měřen pro každou šarži porovnáním jamek téhož séra v několika po sobě jdoucích testech. Příklad: (n = počet testů určitého vzorku) n A ±σ min max CVrepro 18 1,369 0,064 1,2231,476 4,7% 18 0,463 0,060 0,3370,569 12,9% 10.2.3. Recovery test Naměřené hodnoty recovery se pohybují pro každou šarži v rozmezí 80 až 120% očekávané hodnoty. 10.3. Diagnostická citlivost a specifita testu Stanovení diagnostické citlivosti bylo provedeno testováním vzorků vybraných od pacientů v akutní fázi infekční mononukleosy a od pacientů s reaktivací infekce, kde byl očekáván pozitivní výsledek na IgM proti VCA. Výsledek byl potvrzen nezávislými komerčními testy. Zjištěná diagnostická citlivost je 94,7%. Specifita testu byla stanovena na základě vyšetření vzorků od EBV séropozitivních zdravých jedinců a EBV séronegativních pacientů, kde byl očekáván VCA IgM negativní výsledek. Výsledná specifita testu z daných vzorků byla 96,1%. 10.4. Interference Hemolytické a lipemické vzorky nevykazují žádný vliv na výsledek testu minimálně do 50 mg/ml pro hemoglobin, 5 mg/ml pro bilirubin a 50 mg/ml pro triglyceridy. 11. BEZPEČNOSTNÍ PŘEDPISY Všechny složky soupravy jsou určeny pouze pro laboratorní účely. Lidská séra použitá v soupravě byla testována na nepřítomnost HBsAg, HCV a protilátek antihiv1,2. Přesto s nimi nakládejte jako s infekčním materiálem a předměty, které s nimi přišly do styku, autoklávujte 1 hodinu při 121 C nebo dezinfikujte minimálně 30 minut 3% roztokem chloraminu. Tekuté odpady obsahující stop roztok (roztok kyseliny sírové) před likvidací neutralizujte 4% roztokem hydrogenuhličitanu sodného. Se stop roztokem pracujte opatrně, aby nedošlo k potřísnění kůže nebo sliznice. Staneli se tak, omyjte postižené místo větším množstvím tekoucí vody. Odpad vzniklý při promývání stripů dezinfikujte v odpadní nádobě pomocí vhodného dezinfekčního roztoku (např. Incidur, Incidin, chloramin,...) v koncentraci doporučené výrobcem. Při práci nejezte, nepijte a nekuřte. Nepipetujte ústy, ale vhodnými pipetovacími zařízeními. Používejte ochranné rukavice a po práci si důkladně umyjte ruce. Dbejte, aby nedošlo k rozlití vzorků a k tvorbě aerosolu. 5
12. UPOZORNĚNÍ a. Výrobce zaručuje použitelnost soupravy jako celku. b. Promývací roztok, chromogensubstrátový roztok TMB r.t.u., stop roztok r.t.u., ředicí roztok r.t.u. a RF sorbent r.t.u. jsou vzájemně zaměnitelné mezi jednotlivými soupravami ELISA VIDITEST, pokud není v návodu k použití soupravy uvedeno jinak. c. Pracujte asepticky, aby nedošlo k mikrobiální kontaminaci sér a reagencií. d. Při odebírání, ředění a skladování reagencií postupujte tak, aby nedošlo k jejich vzájemné kontaminaci či kontaminaci látkami inhibujícími enzymatickou aktivitu. e. Kontrolní séra, kalibrátor, ředicí roztok, chromogensubstrátový roztok TMB a konjugát antiigm Px jsou konzervovány ProClinem 300. f. Chromogensubstrátový roztok TMB nesmí přijít do styku s oxidačními látkami a kovovými povrchy. g. Dodržujte přesně pokyny uvedené v návodu. Nereprodukovatelné výsledky mohou vzniknout zejména: * nedostatečným promícháním reagencií a vzorků před použitím * nepřesným pipetováním a nedodržováním času inkubací uvedených v bodě 7. * špatnou technikou promývání a potřísněním okrajů jamek vzorky nebo konjugátem * použitím stejné špičky při pipetování různých roztoků nebo záměnou uzávěrů * kontaminací pipety, používané pro aplikaci vzorků, kontrol nebo chromogensubstrátového roztoku TMB, Px konjugátem (doporučujeme pro aplikaci konjugátu používat pipetu, vyhrazenou pouze pro tyto účely). 13. SKLADOVÁNÍ A EXPIRACE a. Soupravu a její složky skladujte v suchu a temnu při teplotě 2 až 10 C. Za těchto podmínek je expirační doba celé soupravy uvedena na centrálním štítku na obalu soupravy, expirace jednotlivých složek je uvedena na jejich obalu. b. Nespotřebované stripy vložte zpět do obalu a zatavte nebo dobře uzavřete do sáčku se zipem společně s desikantem. Soupravy se přepravují chlazené v termotaškách, doba přepravy do 72 hodin nemá na expiraci vliv. Jestliže po obdržení soupravy zjistíte vážné poškození obalu jakékoliv složky soupravy, ihned informujte výrobce. c. Nespotřebovaná testovaná séra uchovávejte v neředěném stavu rozplněná na alikvoty a zmrazená při teplotě 18 až 28 C. Časté zmrazování a rozmrazování se nedoporučuje. Pokud skladujete séra při teplotě 2 až 10 C, pak je spotřebujte do jednoho týdne. d. Roztoky testovaných sér v pracovní koncentraci nelze skladovat. Připravujte je vždy čerstvé. 6
14. TESTOVACÍ SCHÉMA Krok 1. Krok 2. Krok 3. Krok 4. Připravte reagencie a testovaná séra v pracovním ředění Aplikujte kalibrátor, kontrolní a testovaná séra (100 μl / jamku) Inkubujte 30 minut při laboratorní teplotě 4x promyjte (250 μl / jamku), vyklepněte Aplikujte konjugát antiigm Px r.t.u. (100 μl / jamku) Inkubujte 60 minut při laboratorní teplotě 4x promyjte (250 μl / jamku), vyklepněte Aplikujte chromogensubstrátový roztok TMB (100 μl / jamku) Inkubujte 10 minut v temnu při laboratorní teplotě Krok 5. Krok 6. Aplikujte stop roztok (100 μl / jamku) Změřte absorbanci při 450/ 620690 nm do 20 minut Doporučená literatura: Weber B., Brunner mm., Preiser W., et al: Evaluation of 11 enzyme imunoassays for the detection of immunoglobulin M antibodies to Epstein Barr virus; J. Med. Virol., 1996;57, 87 93 Pumannová M., Řezbová M., Švecová M., Hrbáčková H., Novotná M., Ochotná J., Roubalová K.: Porovnání záchytu IgM protilátek proti virovému kapsidovému antigenu (VCA) viru Epsteina a Barrové (EBV) u různých skupin pacientů pomocí nepřímé imunofluorescence, nepřímé ELISA a reversní ELISA. Studie diagnostické účinnosti soupravy ELISAVIDITEST antivca EBV IgM: Klin. mikrobiol.inf.lék. 2004; 10 (4);186190 GorgievskiHrisoho M.,Hinderer W.,NebelSchickel H.,Horn J.,Vornhagen R., Sonneborn H., Wolf H., Siegl G.: Serodiagnosis of Infectious Mononucleosis by Using Recombinant Epstein Barr Antigens and EnzymeLinked Immunosorbent Assay Technology. J.of Clinical Microbiology 28: 23052311, 1990 Roubalová K., Horáček J., Němeček V. et al: Doporučené metody ve virologické diagnostice; Acta Hygien Epidemiol. Microbiol 2000;1, 1112 Datum poslední verze tohoto návodu: 08/2013 7
8