Specific IgE Determination the Choice of Method

Specific IgE Determination the Choice of Method IVO LOCHMAN, ALENA KLOUDOVÁ, VÍTĚZSLAV NOVÁK Odbor imunologie a alergologie, Zdravotní ústav se sídlem v Ostravě SOUHRN Výsledky studie potvrdily opodstatněnost našeho předpokladu, že užitím běžné ELISA při stanovování koncentrace specifického IgE (sp.ige) dochází často k nálezu falešně nízkých koncentrací tohoto analytu. Jedním z důvodů je paralelní tvorba sp.ig i v jiných imunoglobulinových třídách. Mezi klasickými ELISA dosahují nejméně zkreslených výsledků modifikace, které mají navázáno co největší množství alergenu na jednotku reakční plochy. V tomto směru se z dostupných diagnostických souprav jeví výhodný např. CAP systém. Preferovány by však měly být tzv. capture ELISA, které kompetitivně-inhibiční vliv sp.ig tvořených v ostatních Ig-třídách na stanovované sp.ige eliminují. Klíčová slova: stanovení specifického IgE, ELISA, capture ELISA SUMMARY Results of the study confirmed our hypothesis that underestimation of specific IgE (sp.ige) is frequently reached using common ELISA. It is caused by simultaneous production of sp.ig in other Ig-classes. The least distorted results among classical ELISAs are obtained using ELISA modifications with high quantity of allergen coupled to the unit of the reaction space. The CAP system presents advantages among comparable diagnostic kits from this point of view. However capture ELISA would be preferred for sp.ige determination in any case because it eliminates possible competitive-inhibitory effect of co-present sp.ig in other Ig-classes. Key words: specific IgE determination, ELISA, capture ELISA Stanovení specifického IgE (sp.ige) je jednou ze základních a nejpoužívanějších metod v laboratorní diagnostice stavů časné přecitlivělosti (alergické reakce I. typu). Přestože existují indikační kritéria, která mají zajišťovat její racionální využívání (8, 9), je počet indikací této metody a náklady na ně vynaložené v rámci ČR relativně velmi vysoký. Stojí tedy jistě za zamyšlení, kdy tato vyšetření indikovat a zda výsledky dosahované použitými technikami jsou vždy správně interpretovány. Diagnostické soupravy pro stanovení sp.ige nabízí dnes i v ČR řada výrobců a distributorů. Většina z těchto testů je založena na principu běžné ELISA. Alergeny jsou vázány na pevné sorbenty a v případě pozitivní reakce dochází ke vzniku komplexů alergenů se sp.ige. Ty jsou pak detekovány po přidání anti-ige konjugátu enzymatickou reakcí pomocí fotometrie, fluorimetrie nebo luminometrie (obr. 1). Za zlatý standard je mezi těmito technikami označována metoda vyvinutá firmou Pharmacia známá jako CAP System TM, resp. UniCAP TM, která využívá fluorescenční detekce enzymatické reakce. Oproti všem

ostatním metodám má výhodu ve vysoce kapacitním vazebném sorbentu vnitřního povrchu speciálních kalíšků (caps), na něž jsou alergeny navázány a ve kterých reakce probíhá. Vnitřní povrchy těchto kalíšků umožňují navázat na jednotku plochy minimálně 3krát více alergenu než aktivované papírové disky nebo až 50krát více než běžné plasty používané ostatními výrobci (13, 14). Otázka, na kterou se snažíme v této práci odpovědět, je, zda jsou techniky založené na principu běžné ELISA (viz obr. 1) vhodné a zda poskytují objektivní informaci ve všech situacích, kdy je stanovení sp.ige aplikováno. Vycházíme při tom z předpokladu, že i u atopiků, tedy jedinců, kteří mají sklon k vyšší IgE protilátkové odpovědi [11], dochází zvláště při dlouhodobém a opakovaném působení antigenu/alergenu, k paralelní tvorbě jak specifického IgE, tak specifických protilátek v jiných imunoglobulinových třídách, především pak ve třídě IgG (5-7). Tvorba protilátek ve třídě IgG, ale i IgA, IgM a dokonce i IgD je totiž co do množství o několik řádů vyšší než tvorba IgE a může tak sp.ige stanovované běžnou ELISA v důsledku kompetice v některých případech maskovat (tab. 1). Tuto situaci lze podle našeho názoru navodit např. při specifické alergenové imunoterapii (SIT) a může být také navozena u potravinových alergií spojených s intolerancemi. V takových případech se nám jeví výhodnější použít pro stanovení sp.ige tzv. capture techniky, které tuto kompetici eliminují (obr. 1). Dílčí výsledky podporující tuto hypotézu jsou předkládány v této práci.

Materiál a metody Do studie byla vybrána séra pacientů, kteří se dostavili do ambulance alergologie a klinické imunologie v období listopad 2000 až leden 2001 s alergickými obtížemi, měli pozitivní kožní testy na vybrané inhalační alergeny a byli v naší laboratoři v rámci běžné diagnostiky vyšetřeni na sp.ige. K analýze byla nakonec použita séra 8 mužů (věk 16-28 let, medián 18 let) a 8 žen (věk 14-52 let, medián 38 let). Po stanovení anamnézy, provedení kožních testů a před zahájením alergenové SIT byla u těchto pacientů odebrána krev na stanovení sp.ige. Další odběry krve byly prováděny během hyposenzibilizační terapie. Po provedení rutinních vyšetření byly zbytky sér získaných z těchto krví uchovávány v malých podílech při 20oC až do dalšího zpracování. Stanovení specifického IgE bylo prováděno soupravami a diagnostiky firem RISA/Doverton (Dynex, dále jen RISA), UniCAPTM Pharmacia (PharmaTech, dále jen CAP), C.A.R.L.A./Radim (DRG, dále jen CARLA) a BioChem ImmunoSystems (Medisco, dále jen BIOCHEM). Schémata provedení jednotlivých technik jsou uvedena na obr. 1. V případě CARLA byl použit také námi modifikovaný postup tohoto testu (modcarla), kde první krok originální metody, v němž se v jamkách mikrotitrační destičky s naváza- ným anti-ige inkubuje současně značený alergen s vyšetřovaným sérem, byl rozdělen na kroky dva. Nejprve byla inkubována vyšetřovaná séra s navázaným anti-ige samostatně a teprve v dalším kroku, po promytí, přidán značený alergen (viz obr. 1). U 5 vzorků bylo provedeno stanovení sp.ige metodou UniCAP TM také po vysycení sérových IgG a revmatoidních faktorů (RF) speciálním sorbentem Eurosorb IgG/RF Absorbent (Euroimmun). Celkové IgE a sp.igg bylo stanovováno metodou UniCAP TM Pharmacia. Sp.IgE a sp.igg byly testovány na tyto alergeny: d1 - Dermatophagoides pteronyssinus, g4 - kostřava luční, g6 - bojínek luční, g16 - psárka luční, t3 - bříza bělokorá, w6 - pelyněk černobýl. Statistické vyhodnocení výsledků bylo provedeno pomocí statistického programového vybavení Stata V. 7,0. Výsledky a diskuse Jak vyplývá z tab. 1, jsou sérové koncentrace imunoglobulinů (Ig) v jednotlivých Ig-třídách velice rozdílné. Je třeba si uvědomit, že při dlouhodobé stimulaci antigeny (alergeny) proteinové povahy jsou vytvářeny IgG protilátky zejména ve třídě IgG 1, i když primární protilátková odpověď bývá ve třídě IgM, IgA nebo IgE. Tvorba protilátek v těchto třídách je pak postupně tlumena nebo probíhá paralelně (5-7, 10) Probíhá-li protilátková odpověď současně v několika Ig-třídách, lze předpokládat, že koncentrace sp.ig

jsou v těchto třídách časem podstatně vyšší než ve třídě IgE. Z tab. 1 je patrné, že poměr IgE: IgG může být teoreticky 1:10 000 i vyšší. Sp.Ig v jiných Ig třídách tak mohou velmi výrazně ovlivňovat prostou kompetitivní inhibicí stanovení sp.ige běžnou ELISA technikou v případě, že z reakční směsi nebudou odstraněny všechny nebo alespoň většina sp.ig proti danému alergenu v jiných Ig-třídách přítomných v analyzovaném vzorku. Vlastní alergenové epitopy jsou většinou peptidy o malé molekulové váze mnohonásobně menší něž molekuly Ig. V případě alergenů běžně připravovaných a používaných v ELISA jsou součástí komplexů obsahujících řadu dalších epitopů. Pro naši kalkulaci předpokládejme, že velikost jejich molekul může být srovnatelná s velikostí molekul Ig a na jednotku povrchu je jich navazováno stejné množství jako IgG. Sérum o konc. 100 U IgE/ml obsahuje v objemu 50 ml, který se obvykle aplikuje do reakční nádobky při stanovování sp.ige, 0,00005 nmol IgE. Obsahuje-li zároveň 10 g IgG/l, obsahuje v 50 ml také 3,33 nmol IgG. Předpokládáme-li dále, že koncentrace sp.ig jsou v podobných poměrech jako koncentrace celkových Ig, může být, jak již bylo řečeno, koncentrace sp.igg ve vzorcích více než 10 000krát vyšší než koncentrace sp.ige a v neředěných sérech, která jsou při stanovování sp.ige aplikována, jeho množství může i mnohonásobně převyšovat vazebnou schopnost aktivovaného, senzibilizovaného sorbentu a výrazně tak svou přítomností ovlivňovat nalézané koncentrace sp.ige. Musíme mít při tom na paměti, že interakce mezi jednotlivými sp.ig v séru není tak jednoduchá, aby závisela jen na poměrech jejich koncentrací a dala se spočítat jen s jejich pomocí, ale že ji ovlivňují také afinita a avidita jednotlivých protilátek, velikost, kvalita a množství molekul alergenu vázaného na sorbentu a to, že jednotlivé alergen-specifické protilátky mohou být namířeny proti různým epitopům téhož alergenu. Nadějnými nejen v terapii, ale i diagnostice se proto ukazují malé, dobře definované, rekombinantní alergeny, obsahující jen vybrané epitopy přírodních alergenů (1, 2, 12). Pro zdárný průběh ELISA musí být množství reaktantů účastnících se reakce (alergeny, konjugát a substrát) proti stanovovanému analytu (sp.ig) v nadbytku (3). Kdyby nebyly ve vzorcích přítomny Ig v jiných Ig-třídách, je tento předpoklad v prvním kroku běžné ELISA pro stanovování sp.ige zcela splněn. Předpokládejme, že je na reakční ploše pevného sorbentu navázáno v CAP systému přibližně 270 pmol alergenu, v RISA technice na aktivovaném papírovém disku 90 pmol a u běžného plastu mikrotitrační destičky 5 pmol. Je-li konc. IgE v séru 100 U/ml, je v 50 ml séra aplikovaného do reakce cca 0,05 pmol IgE. To je při použití běžného plastu použitého jako sorbent pro alergen 100krát méně, než je předpokládané množství navázaného alergenu. Papírové disky jsou na tom ještě asi 20krát lépe a nejlépe jsou na tom kalíšky CAP systému, kde je navázaného alergenu více než 5000-násobný přebytek. Jiná je situace u IgG. Předpokládáme-li v séru koncentraci IgG 10 g/l, pak, jak jsme již uvedli, je v 50 ml vzorku 3,33 nmol IgG, což je cca 10krát více než je maximální sorpční kapacita CAP a cca 800krát více, než je maximální sorpční kapacita neaktivovaného plastu. Celkové IgG přítomné ve vzorku však stanovení sp.ige zásadně neovlivní, protože kompetitivní inhibici způsobuje jen alergen specifické IgG a alergen-specifické imunoglobuliny ostatních imunoglobulinových tříd. Jak bylo uvedeno, vzorky sér byly v naší studii paralelně analyzovány na přítomnost sp.igg metodou CAP (Pharmacia) a sp.ige metodami CAP, RISA, CARLA, modcarla a BIOCHEM. Výsledky jsou uvedeny v tab. 2. U 5 vzorků bylo provedeno také vyšetření sp.ige metodou CAP po vysycení sorbentem Eurosorb IgG/RF (tab. 3).

Koncentrace sp.igg v analyzovaných vzorcích se pohybovaly v rozmezí 1,5 36 mg/l. To znamená, že především u vzorků s vyššími naměřenými koncentracemi sp.igg mohou tyto imunoglobuliny skutečně výrazně ovlivňovat stanovované koncentrace sp.ige, a to nejvíce v běžné ELISA využívající neupravované plastové sorbenty a nejméně u CAP systému, jak je možné vyvodit z údajů uvedených v tab. 4. Nalezené konc. sp.igg a sp.ige spolu vzájemně nekorelují (tab. 2). Poměr naměřených koncentrací sp.ige vůči sp.igg je nejvyšší u modifikované CARLA, následuje CAP, BIOCHEM, CARLA a RISA. Z tab. 2 a 3 je tak zřejmé, že přítomnost sp.igg ovlivňuje naměřené hodnoty sp.ige v závislosti na použité metodě stanovení sp.ige. Až na výsledky vyšetření sp.ige soupravami firmy BIOCHEM, kde jsme očekávali naměření vyšších hodnot, výše uvedená naměřená data potvrdily naše úvahy a předpoklady. Poměr průměrů naměřených koncentrací sp.ige metodami CAP a RISA se dokonce blíží očekávané teoretické hodnotě 3.

Při hodnocení výsledků uvedených v tab. 3 musíme mít na paměti, že metoda použitá k vysycení IgG neodstraňuje ze vzorků veškeré IgG a i jeho zbytky, nehledě na možnou přítomnost sp.ig v jiných Ig-třídách, zřejmě mohou mít kompetitivně-inhibiční vliv na stanovení sp.ige. Vysycení IgG ze vzorku však i u tohoto postupu vedlo k naměření průkazně vyšších koncentrací sp.ige. Ačkoliv je test prováděný soupravou CARLA založen na principu capture techniky, kdy v prvním kroku jsou z analyzovaných sér vyvazovány veškeré IgE protilátky, výhodu této techniky ztrácí tím, že na rozdíl od klasické capture techniky spojuje první krok s druhým, tzn. že sérum pacienta se inkubuje současně s konjugovaným alergenem (obr. 1). Nedochází tedy k eliminaci kompetitivně-inhibičního vlivu sp.ig v jiných Ig-třídách na vazbu sp.ige k přítomným konjugovaným alergenům. Aby se kompetitivněinhibiční vliv sp.ig v jiných Ig-třídách na vazbu sp.ige nemohl projevit, musely by být použity velmi vysoké koncentrace konjugovaných alergenů. Nepřekvapilo nás, že koncentrace sp.ige naměřené pomocí RISA, která je v naší laboratoři pro stanovení sp.ige používána jako rutinní metoda a která je klasickou ELISA, a metody CARLA v originálním, nemodifikovaném provedení byly jen nepatrně nižší (prakticky shodné), i když u jednotlivých alergenů byly prokázány určité rozdíly (tab. 5). Musíme si uvědomit, že alergeny používané jednotlivými výrobci nejsou zcela totožné, ačkoliv jsou stejně deklarovány a označovány. Aby představovala skutečnou capture techniku, byla metoda CARLA modifikována tak, že byl první inkubační krok rozdělen na kroky dva (obr. 1). Modifikovanou CARLA jsme u řady sér nalezli výrazně

vyšší koncentrace spec. IgE než při jejím standardním provedení (tab. 6). Dá se říci, že nalézané rozdíly mezi standardní a modifikovanou CARLA byly zpravidla tím větší, čím vyšší byly ve vzorcích koncentrace sp.ige nalezené standardním postupem. Tento výsledek není rovněž překvapující a odpovídá našim předpokladům o možném kompetitivně-inhibičním působení sp.ig v jiných Ig-třídách, uvědomíme-li si, jaké koncentrační poměry jednotlivých imunoglobulinů v sérech jsou (tab. 1 a 4). Nedostatkem naší modifikace CARLA je to, že stanovení vysokých koncentrací sp.ige, v případech, kdy je nutno séra ředit, není zcela správné a plně akceptovatelné. Aby bylo možné brát výsledky získané modifikovanou CARLA jako korektní, bylo by zřejmě nutné užívat k ředění sér speciální roztoky obsahující tzv. nulové sérum nebo jinou indiferentní směs proteinů, které by přibližovaly reakční podmínky ředěného séra séru neředěnému a eliminovaly tzv. matricový efekt (3). Použití 1% BSA v ředících roztocích, jak tomu bylo v našem případě, není pravděpodobně dostačující a může vést k nálezům falešně vysokých koncentrací sp.ige. Stanovení sp.ige pomocí soupravy BIOCHEM, která je svou konstrukcí skutečnou capture ELISA, přineslo pro nás překvapivé zjištění. Očekávali jsme totiž, že koncentrace sp.ige nalezené touto soupravou se budou pohybovat mezi koncentracemi nalezenými metodou CAP a modifikovanou CARLA. Ve skutečnosti jsme ale v prvních orientačních testech nalézali metodou BIOCHEM koncentrace sp.ige nižší než metodou CAP (viz tab. 2). Pokud jsou tedy v konstrukci soupravy BIOCHEM dodrženy všechny základní principy ELISA, tj. dostatečný nadbytek navázaného anti-ige v jamkách mikrotitrační destičky a dostatečný nadbytek konjugátů (viz obr. 1), nedovedeme si zatím tuto skutečnost vysvětlit a pro objasnění problému bude zapotřebí dalšího testování. Výše uvedené výsledky potvrzují, že stanovování specifického IgE není zdaleka tak jednoduchá záležitost, jak by se na první pohled mohlo zdát. Významnou roli zde hraje jak aktuální imunoreaktivita pacienta, odrážející se také v imunoglobulinovém spektru vyšetřovaného vzorku séra, tak vlastní metodické provedení testu. Snadná dostupnost poměrně široké nabídky diagnostických souprav pak s ohledem k výše uvedeným výsledkům může přispívat k nejednotnosti a různorodosti při stanovování

sp.ige a interpretaci nálezů tohoto analytu. RNDr. Ivo Lochman, CSc. Odbor imunologie a alergologie ZÚ Ostrava Partyzánské nám. 7 702 00 Ostrava LITERATURA 1. Ahlstedt S. Understanding the usefulness of specific IgE blood tests in allergy. Clin.Exp.All. 2002; 32: 11-16. 2. Douglass J, O Hehir R. Specific allergen immunotherapy: time for alternatives? Clin.Exp.All. 2002; 32: 1-3. 3. Ekins R. and Yman L. in: The Immunoassay Handbook, second edition, (Wild D. edit.), Nature publishing group, 2001; str.46-59 a 664-676. 4. Ferenčík M. Imunochémia, Alfa, Bratislava, 1989; str. 123-131. 5. Flicker S, Steinberger P, Nordehaug L, Sperr WR, Majlesi Y, Valent P, Kraft D, Valenta R. Conversion of grass pollen allergen-specific human IgE into protective IgG1 antibody. Eur.J.Immunol. 2002; 32: 2156-2162. 6. Kowalski M.J., Alam R.: Signal transduction mechanisms as new targets for allergists. Allergy 2001; 56: 199-203. 7. Niedeberger V, Niggemann B, Kraft D, Spitzauer S, Valenta R. Evolution of IgM, IgE and IgG1-4 antibody responses in early childhood monitored with recombinant allergen components: implications for class switch mechanisms. Eur. J. Immunol. 2002; 32: 576-584. 8. Panzner P. Doporučení pro indikaci a provádění stanovení koncentrace specifických IgE protilátek. Praktický lékař 1998; 78, 4: 183. 9. Panzner P. Doporučení pro indikaci a provádění stanovení koncentrace specifických IgE protilátek. Klinická imunológia a alergológia, 1999; 8,2: 21-22. 10. Saxon A, Diaz-Sanchez D, Zhang K. The allergic response in host defense. In: Rich R.R. et al. editors, Clinical Immunology, principles and practice. Second edition, Mosby, London, Edinburgh, NewYork, Philadelphia, St.Luis, Sydney, Toronto, 2001; str. 45.1-45.11. 11. Špičák V. Revize alergologického názvosloví. Stanovisko EAACI. Překlad z Johansson S.G.O. et al.: A revised nomenclature for allergy. An EAACI position statement from the EAACI nomenclature task force. Allergy 2001;56: 813-824. Alergie, 2002; 4,3: 186-187. 12. Valenta R, Kraft D. Recombinant allergen molecules: tools to study effector cell activation. Immunol. Rev. 2001; 179: 119-127. 13. Yman L. Die neue Generation der Allergie-Testung: Pharmacia CAP System. In-vitro Diagnostica Special 1990; 2, 1, 18-22. 14. Yman L. Standardization of IgE Antibody Assays. JIFCC 1991; 3,5: 198-203.