Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav Technologie potravin. Úloha a význam plísní a kvasinek v mlékařství Bakalářská práce

Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav Technologie potravin Úloha a význam plísní a kvasinek v mlékařství Bakalářská práce Vedoucí práce: doc. Ing. Květoslava Šustová, Ph.D. Vypracovala: Markéta Rozsypalová Brno 2013

PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci na téma Úloha a význam plísní a kvasinek v mlékařství vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Bakalářská práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího bakalářské práce a děkana Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně. dne. podpis autora..

PODĚKOVÁNÍ Ráda bych touto cestou poděkovala paní doc. Ing. Květoslavě Šustové, Ph.D. za odborné vedení mé bakalářské práce, za poskytnuté literární prameny a cenné rady, které mi velmi pomohly při vypracování mé závěrečné práce. Také bych chtěla poděkovat mé rodině a všem mým blízkým za podporu během celého mého studia.

ABSTRAKT Tato bakalářská práce pojednává o významu plísní a kvasinek využívaných v mlékárenském průmyslu. První část je soustředěna na obecnou charakteristiku plísní, jejich specifické využití pro výrobu mléčných výrobků, zejména plísňových sýrů a na jejich možný negativní vliv. V druhé části je popsána stejně jako u plísní, charakteristika kvasinek jako mikroorganismů, jejich využití při výrobě mléčných výrobků a jejich možný nežádoucí charakter. V závěrečné části se tato bakalářská práce věnuje oblasti mikrobiologické kontroly kvasinek a plísní v mléce a mléčných výrobcích. Klíčová slova: plíseň, kvasinky, mlékařství, sýr, mikrobiologie ABSTRACT This thesis discusses the importance of molds and yeasts used in the dairy industry. The first part focuses on general characteristics of fungi, their specific use for the production of dairy products, especially blue cheese and their possible negative impact. The second part is described as well as fungi, such as yeasts characteristic of microorganisms, their use in the manufacture of dairy products and their possible undesirable character. In the final part of the thesis deals with the microbiological control of yeasts and molds in milk and dairy products. Keywords : mold, yeast, dairy, cheese, microbiology

OBSAH 1 ÚVOD... 7 2 CÍL PRÁCE... 8 3 LITERÁRNÍ PŘEHLED... 9 3.1 Charakteristika plísní... 9 3.2 Rozmnožování plísní... 10 3.3 Vlastnosti plísní... 10 3.4 Taxonomické rozdělení potravinářsky významných plísní... 11 3.5 Význam plísní z potravinářského hlediska... 11 3.6 Plísňové kultury využívané v mlékárenském průmyslu... 12 3.7 Úloha a význam plísní při výrobě sýrů... 16 3.7.1 Metabolismus laktátu... 16 3.7.2 Lipolytické enzymy plísní... 17 3.7.2.1 Methylketony... 18 3.7.3 Proteolytické enzymy plísní... 18 3.7.4 Klasifikace plísňových sýrů... 19 3.7.4.1 Sýry s plísní v těstě... 19 3.7.4.2 Sýry s plísní na povrchu... 23 3.7.4.3 Sýry dvouplísňové... 25 3.8 Plísně jako možné příčiny kažení mléčných výrobků... 27 3.8.1 Plísně kontaminující sýry... 27 3.9 Metabolické produkty plísní... 28 3.9.1 Mykotoxiny... 28 3.9.1.1 Mykotoxiny v sýrech produkované plísněmi... 29 3.10 Ochrana proti růstu nežádoucích plísní... 31 3.11 Charakteristika kvasinek... 32 3.12 Rozmnožování kvasinek... 32 3.13 Vlastnosti kvasinek... 33 3.14 Taxonomické rozdělení potravinářsky významných kvasinek... 33 3.15 Význam plísní z potravinářského hlediska... 35 3.16 Kvasinkové kultury využívané v mlékárenském průmyslu... 35

3.17 Úloha kvasinek při výrobě sýrů zrajících pod mazem... 36 3.17.1 Klasifikace sýrů zrajících pod mazem... 37 3.17.1.1 Sladké sýry zrající pod mazem... 37 3.17.1.2 Kyselé sýry zrající pod mazem... 38 3.18 Úloha kvasinek při výrobě sýrů s plísní... 39 3.18.1 Sýry s plísní na povrchu... 39 3.18.1.1 Geotrichum candidum... 40 3.18.2 Sýry s plísní uvnitř... 41 3.19 Úloha kvasinek při výrobě másla... 41 3.20 Úloha kvasinek při výrobě kefírů... 42 3.20.1 Mikrobiální metabolismus... 43 3.20.1.1 Lipolytické enzymy kvasinek... 43 3.20.1.2 Proteolytické enzymy kvasinek... 43 3.20.1.3 Metabolické dráhy kvašení... 44 3.21 Úloha kvasinek při výrobě kumysů... 44 3.22 Úloha kvasinek při výrobě jogurtového sýru Laban (Labneh)... 45 3.23 Kvasinky jako možné příčiny kažení mléčných výrobků... 46 3.23.1 Kvasinky kontaminující sýry... 46 3.24 Ochrana proti růstu nežádoucích kvasinek... 47 3.25 Biologický inhibitor nežádoucích kvasinek a plísní v mléčných výrobcích.. 47 3.26 Mikrobiologická kontrola obsahu kvasinek a plísní v mléce a mléčných. výrobcích... 48 3.26.1 Živná média pro kultivaci a stanovení počtu plísní a kvasinek v mléčných výrobcích... 49 4 ZÁVĚR... 52 5 POUŽITÁ LITERATURA... 53 5.1 Internetové zdroje... 58 6 SEZNAM OBRÁZKŮ... 61 7 SEZNAM TABULEK... 63

1 ÚVOD Plísně a kvasinky řadíme mezi eukaryotní mikroorganismy patřící do říše nižších hub. Obě skupiny mají velký význam z hlediska životního prostředí. Podílí se na mineralizaci, rozkladu odumřelých částí rostlin a živočichů, čímž významně přispívají ke koloběhu biogenních prvků. Český název plísně zavedl v 19. století přírodovědec Jan Svatopluk Presl. Charakteristickým znakem výskytu plísní je tvorba viditelného mycelia na substrátu nejrůznější povahy, což je způsobeno jejich vysokou adaptabilitou na podmínky prostředí. S tím je však spojený jejich nežádoucí vliv. Plísně způsobují kažení potravin, jelikož produkují aktivní enzymy, které rozkládají sacharidy, bílkoviny a tuky. Současně tak dochází ke zhoršení nutriční hodnoty a senzorických vlastností. Je však velmi důležité zmínit jejich významnou úlohu v potravinářském průmyslu a dalších biotechnologiích. Roku 1928 bylo objeveno první účinné antibiotikum Penicilin skotským lékařem Alexandrem Flemingem z plísně Penicillium natatum. Toto období se tak stalo důležitým mezníkem počátku výzkumu plísní. Plísně se dále používají pro produkci některých organických látek, důležitých enzymů, vitamínů a pigmentů. Nejpodstatnější úloha plísní však spočívá v potravinářském průmyslu, zejména při výrobě plísňových sýrů. Kvasinky byly poprvé jednotlivě pozorovány nizozemským přírodovědcem Antoni van Leeuwenhoek. Podobně jako plísně jsou i kvasinky známými původci kažení potravin. Jejich využití však spočívá zejména ve schopnosti zkvašovat sacharidy, čehož se využívá v potravinářství. Kvasinky patří celosvětově mezi nejvíce průmyslově využívané mikroorganismy. Již po tisíce let jsou používány pro výrobu alkoholických nápojů. Další využití nacházejí v oblasti kynutého pekařského droždí, vína, piva, produkci organických kyselin, vitamínů, medicíny a v krmivářském průmyslu. Kromě kvasného průmyslu jsou hojně využívané také v mlékárenských technologiích, převážně pro výrobu některých fermentovaných mléčných výrobků a sýrů. 7

2 CÍL PRÁCE Cílem mé bakalářské práce bylo prostudovat odbornou literaturu zabývající se problematikou výskytu a využití plísní a kvasinek v mlékárenském průmyslu, zejména při výrobě sýrů. Dále se seznámit s metodami mikrobiologické kontroly výskytu kvasinek a plísní v mléce a mléčných výrobcích. Při zpracování se zaměřit především na cizojazyčnou odbornou literaturu a nové literární prameny a na tomto na základě vypracovat literární rešerši. 8

3 LITERÁRNÍ PŘEHLED 3.1 Charakteristika plísní Plísněmi nazýváme eukaryotní mikroskopické vláknité mikroorganismy, které se řadí mezi houby (Fungi), (ŠILHÁNKOVÁ, 2002, PARIJA, 2009). V mikrobiologické praxi se často používá termín Mikromycety, tedy mikroskopicky pozorovatelné houby (LÁSZTITY, 2009). Jedná se o vícebuněčné, ubikvitární neboli všudypřítomné mikroorganismy, které se mohou vyskytovat v ovzduší, vodě, půdě, na odumřelých či živých organismech a v neposlední řadě i v potravinách. Plísně jsou charakteristické tvorbou viditelného mycelia (podhoubí) složeného z jednotlivých vláken (hyf) o průměru 5 až 10 µm. Mycelium tak prorůstá substrátem a následně vytváří uvnitř či na povrchu viditelný vláknitý povlak (GÖRNER, VALÍK, 2004). Tyto vláknité mikroorganismy se vyznačují velmi rychlým růstem a jsou schopny pokrýt několik centimetrů plochy během dvou až tří dnů (JAY, 2005). Obr. 1 - Stavba Penicillium roqueforti (RUDYPAV, 2012). 9

3.2 Rozmnožování plísní Plísně se rozmnožují dvěma způsoby a to pohlavně a nepohlavně (WALSTRA, 2006). Při pohlavním rozmnožování se vytváří spory meiózou ve vřecku, neboli v asku, či odškrcením koncových buněk ve výtrusorodé vrstvě plodnice. Nepohlavní spory vznikají ve fruktifikačních orgánech, sporangioforu a konidioforu, nebo na vegetativních hyfách (GÖRNER, VALÍK, 2004). Spory nacházející se uvnitř fruktifikačních orgánů se nazývají endospory. Spory, které jsou vně těchto orgánů, nazýváme exospory (konidie), (ŠILHÁNKOVÁ, 2002). Dle způsobu vzniku rozlišujeme oidie, neboli artrospory,tvořící se rozpadem hyf. Dále konidie vznikající v konidioforu ze základní buňky. Některé plísně vytváří tzv. blastospory, které vznikají pučením (WALSTRA, 2006). 3.3 Vlastnosti plísní Dle nároků na výživu plísně náleží do heterotrofních mikroorganismů, vyžadujících přítomnost organických látek (zdroj C, H či energie) v živném prostředí. Dle způsobu získávání energie patří do chemoheterotrofních mikroorganismů, vyznačující se oxidací organických látek za účelem zisku energie (ŠILHÁNKOVÁ, 2002). Tyto mikroorganismy vyžadují přítomnost volného kyslíku, proto je nejčastěji nacházíme na povrchu kontaminovaných potravin. Plísně jsou všeobecně velmi adaptabilní organismy na různé podmínky prostředí. Převážná část plísní má optimální teplotu růstu pohybující se mezi 25 až 30 o C. Z tohoto důvodu se řadí k mezofilním mikroorganismům (LÁSZTITY, 2009). Nicméně je třeba poznamenat, že některé plísně jsou schopné růstu i při mrazírenských teplotách v rozmezí -15 až -18 (ŠILHÁNKOVÁ, 2002). o C 10

3.4 Taxonomické rozdělení potravinářsky významných plísní Dle přítomnosti a typu pohlavního rozmnožování jsou potravinářsky významné plísně systematicky rozděleny do tří základních taxonomických jednotek (JAY, 2005). Tab. 1 - Taxonomické rozdělení potravinářsky významných plísní (TEWARI, 2009). Taxonomická jednotka Mycelium Způsob rozmnožování třída Zygomycota podkmen Ascomycota podkmen Deuteromycota neseptované mycelium septované mycelium septované mycelium pohlavní rozmnožování se uskutečňuje pomocí zygospor pohlavní rozmnožování probíhá za tvorby askospor tvořených v asku (vřecku) známé je pouze nepohlavní rozmnožování pomocí exospor 3.5 Význam plísní z potravinářského hlediska Na jedné straně jsou plísně známé jako organismy způsobující kažení potravin. Na straně druhé jsou však velmi významné pro využití v potravinářském průmyslu. Jejich schopnost značně měnit vůni, chuť i texturu je využívána zejména v mlékárenských technologiích při výrobě sýrů, kde tvoří tzv. sekundární mikroflóru. Označujeme je jako plísně ušlechtilé (LÁSZTITY, 2009). Hlavním předpokladem využití plísní při výrobě sýrů je obsah proteolytických a lipolytických enzymů (WHITEHURST, OORT, 2009). Spolupůsobením těchto enzymů tak dochází ke změnám určitých vlastností a souhrnně se tento proces označuje jako maturace, 11

neboli zrání (BERESFORD, 2001). Kvalita sýrů je určena především jeho chutí a texturou, proto je hlavní pozornost věnována hlavně mikrobiologickým a biochemickým změnám, ke kterým dochází právě v průběhu zrání (FOX, 2000). 3.6 Plísňové kultury využívané v mlékárenském průmyslu Mikrobiální startovací kultury využívané v potravinářství jsou rozmnožování schopné a přesně definované mikroorganismy, které se přidávají do surovin či potravin s cílem zlepšit či vyrobit jejich konzistenci, vůni, chuť, vzhled a trvanlivost. Plísňové kultury se v mlékárenském průmyslu účastní procesu zrání sýrů. Způsobují zejména chemické, fyzikální a mikrobiologické změny mléčného tuku a bílkovin. Jejich metabolické a štěpné produkty přispívají ke vzniku cílených senzorických a reologických vlastností (GÖRNER, VALÍK, 2004). Na zrání plísňových sýrů se podílejí zejména zástupci rodu Penicillium, podle nichž se sýry rozdělují do příslušné skupiny. Mezi tyto plísně patří Penicillium roqueforti a Penicillium camemberti (BERESFORD, 2001). Rod Penicillium patří k nejrozsáhlejšímu rodu plísní a obsahuje celkem asi 150 druhů. Systematicky se řadí do podkmene Ascomycota. Tvoří kolonie, které se na povrchu substrátu vyskytují ve formě sametového, zeleného až moučnatého povlaku (ŠILHÁNKOVÁ, 2002). 1.) Plísňové kultury využívané k výrobě sýrů s plísní v těstě K výrobě sýrů tohoto typu patří kultura plísní Penicillium roqueforti a Penicillium glaucum. Jedná se o plíseň rostoucí a fermentující vnitřní hmotu sýrů. Charakteristickým znakem je tvorba modrozelených žilek uvnitř hmoty. Tato plíseň vykazuje výraznou biochemickou aktivitu, projevující se typickým aroma. Roste dobře v přítomnosti menšího obsahu kyslíku, který však nesmí klesnout pod 5 %, při vyšším obsahu soli a hodnotě a w 0,94 až 0,91 (GÖRNER, VALÍK, 2004). 12

Obr. 2 - Penicillium roqueforti (ALLPOSTERS, 2012). 2.) Plísňové kultury využívané k výrobě sýrů s plísní na povrchu K nejznámějším sýrům tohoto druhu patří Brie, Camembert a Geramont (LEClERCQ-PERLAT, 2011). Od nich jsou například odvozené sýry Encián (Plesnivec) a Hermelín (GÖRNER, VALÍK, 2004). K výrobě těchto sýrů se používá kamembertská kultura obsahující nejčastěji dva zástupce prospěšných plísní, Penicillium camemberti a Penicillium caseicolum. Ty vytváří na povrchu sýrů bělavý povlak (BOURDICHON, 2012). K jejich optimálnímu růstu je potřeba vyšší obsah kyslíku, z tohoto důvodu se tedy vyskytují na povrchu substrátu (GÖRNER, VALÍK, 2004). Spolupůsobením těchto plísní vzniká jemnější aroma a chuť, než kdyby působila každá zvlášť (BOURDICHON, 2012). 13

Obr. 3 - Elektronová mikroskopie plísně Penicillium camemberti tvořící sekundární mikroflóru sýrů typu Camembert a Brie (LAW, TAMIME, 2010). Plíseň Penicillium nalgiovensis můžeme nalézt v Ellischau neboli v Nalžovském sýru (HUTKINS, 2006). Dle studie, která byla provedena za spolupráce studentů Vyšší odborné školy potravinářské, Střední průmyslové školy mlékárenské v Kroměříži a odborných pracovníků, se zjistilo, že tato plíseň vykazuje podobné charakteristické vlastnosti, jako plísně tradičně používané pro výrobu sýrů s plísní na povrchu. Obdobné výsledné senzorické vlastnosti tak umožňují použití plísně Penicillium nalgiovensis jako zajímavou alternativu pro výrobu sýrů tohoto druhu (MRÁZEK et al., 2009). Dle 14

experimentu, který provedl Doležálek (1962), bylo zjištěno, že během výrobního procesu tvoří tato kultura velmi málo amoniaku, což způsobuje vznik jemné chuti sýrů (GÖRNER, VALÍK, 2004). Verticillium lecanii a Penicillium album jsou využívané pro výrobu speciálních druhů sýrů s šedou či bílošedou plísní. Plíseň Verticillium lecanii se používá pro výrobu sýrů francouzského typu Tomme (LAW, TAMIME, 2010). Obr. 4 - Penicillium nalgiovensis (DIJITALIMAJ, 2012). 3.) Plísňová kultura podílející se na zrání sýrů s nízkodohřívanou sýřeninou Kulturní plíseň Penicillium viridicatum se podílí na zrání sýrů holandského typu s nízkodohřívanou sýřeninou. Za vhodných podmínek zabraňuje vysychání povrchu sýrů. Před expedicí se ze sýrů tato vrstva plísně ovšem odstraňuje. Po uschnutí se sýr potahuje parafínem (GÖRNER, VALÍK, 2004). 15

3.7 Úloha a význam plísní při výrobě sýrů V procesu výroby sýrů se plísně účastní zrání, které je doprovázeno biochemickými a mikrobiologickými změnami. Zrání sýrů rozdělujeme na předběžné, kdy dochází k přeměně laktózy na kyselinu mléčnou a zrání vlastní, při kterém probíhá rozklad bílkovin, částečně i hydrolýza tuku. Ta je nejvýraznější právě u plísňových sýrů. Výsledkem je vznik charakteristické vůně, chuti a textury, typické pro konkrétní druh vzniklého sýru (FOX, 2000). Doba zrání trvá zpravidla od dvou týdnů až do dvou i více let (SIMPSON et al., 2012). Podstatou využití plísní v procesu zrání je obsah proteolytických a lipolytických enzymů (FOX, 2000). Primární biochemické změny během zrání sýrů zahrnují proteolýzu, lipolýzu, metabolizmus zbytku laktózy, laktátu a citrátu. Mezi sekundární biochemické změny patří metabolismus mastných kyselin a aminokyselin (FOX et al., 2004). Nezbytnou součástí procesu výroby plísňových sýrů je následná mikrobiologická kontrola, která zajišťuje kvalitu výsledných produktů (LAW, 1997). Vzhledem k rozmanitosti přítomné mikroflóry plísňových sýrů jsou veškeré biochemické pochody způsobující zrání složitější a rozsáhlejší (ROGINSKI et al., 2003). 3.7.1 Metabolismus laktátu Metabolismus laktátu je nejdůležitějším procesem u plísňových sýrů, zrajících od povrchu (FOX et al., 2004). Laktóza neboli mléčný cukr, je velmi rychle metabolizována v počátečních fázích zrání na laktát (sůl kyseliny mléčné). Laktát je důležitým prekurzorem pro řadu probíhajících reakcí, jako je například mikrobiální metabolismus (ESKIN, SHAHIDI, 2012). Metabolismus laktátu je nejdůležitější v průběhu dozrávání sýrů s plísní na povrchu typu Camembert a Brie. Povrch těchto sýrů je kolonizován mikroorganismy (FOX et al., 2004). Nejdříve kvasinkami rodu Geotrichum candidum a poté ušlechtilou plísní Penicillium camemberti. Ty oxidačně metabolizují laktát na CO 2 a O 2. Tím dochází k odkyselování povrchu těchto sýrů do tří týdnů (BERESFORD, 2001). V důsledku zvýšení ph na povrchu dojde k vysrážení a migraci fosforečnanu vápenatého od středu směrem k povrchu sýru. Zvýšení ph, snížení koncentrace 16

fosforečnanu vápenatého a proteolýza jsou hlavní příčinou měknutí původně pevné a křehké vnitřní vrstvy camembertského sýru (FOX et al., 2004). Obr. 5 - Schematické znázornění změn, ke kterým dochází v průběhu zrání sýru Camembert v důsledku růstu Penicillium camemberti na povrchu (FOX et al., 2004). 3.7.2 Lipolytické enzymy plísní Při zrání sýrů se uplatňují především lipolytické enzymy tzv. lipázy (GÖRNER, VALÍK, 2004). Nejvyšší lipolytickou aktivitu vykazují zejména lipázy plísní, významně se tak podílejí na vzniku charakteristické chuti sýrů (FOX et al., 2004). Nejoptimálnější hodnota ph pro tyto lipázy se pohybuje v rozmezí 5 5,5 při teplotě 30 až 30 o C. Při těchto hodnotách je aktivita lipáz nejvyšší. Lipolytická aktivita plísní je nejvýraznější u sýrů s plísní v těstě, kam řadíme například Roquefort. Velké množství enzymů lipáz produkují zejména zástupci plísní rodu Penicillium. Konkrétně se jedná o Penicillium camemberti, Penicillium roqueforti a Penicillium nalgiovensis (GÖRNER, VALÍK, 2004). Lipázy katalyzují syntézu, ale i rozklad mléčného tuku na glycerol a volné mastné kyseliny (PRASAD, 2011). Následně vznikají karbonylové sloučeniny, aldehydy a ketony. Na typické chuti a vůni plísňových sýrů se podílejí zejména methylketony (GÖRNER, VALÍK, 2004). 17

3.7.2.1 Methylketony Methylketony se řadí mezi alifatické ketony, které vznikají jako sekundární látky z lipidů reakcí nazývanou ketonové žluknutí (GÖRNER, VALÍK, 2004). Tvoří žádoucí aromatické složky plísňových sýrů (FUQUAY et al., 2011). Penicillium camemberti a Penicillium roqueforti metabolizují mastné kyseliny částečnou β-oxidací. Penicillium roqueforti dominuje dvěma silnými lipázami způsobující lipolýzu v sýrech s modrou plísní, ve kterých je zaznamenána nejvyšší hladina volných mastných kyselin ze všech sýrů. Tvorba methylketonů je zde nejvýraznější (TAYLOR, LINFORTH, 2010). Z nejvýznamnějších methylketonů se v plísňových sýrech nachází především 2-heptanon a 2-nonanon, které vytváří charakteristickou chuť. Dále aceton, pentan-2-on a undekan-2-on (VELÍŠEK, 2009). Obr. 6 - Methylketony (VELÍŠEK, 2009). 3.7.3 Proteolytické enzymy plísní Proteolýza (degradace) bílkovinných molekul na aminokyseliny je nejdůležitější primární biochemickou reakcí. Má přímý vliv na výslednou chuť sýrů. Během zrání proteolýzu katalyzují proteázy, které dělíme na proteinázy a peptidázy. Jeden ze šesti zdrojů těchto enzymů jsou právě plísně Penicillium camemberti a Penicillium roqueforti, jejichž proteolytický systém je velmi podobný. Proteázy štěpí při zrání sýrů mléčnou bílkovinu kasein na albumosy, peptony, polypeptidy, dipeptidy a následně až na volné aminokyseliny, amoniak, těkavé kyseliny a sirovodík. Hlavní úlohu při proteolýze plní zejména enzym plísně Penicillium roqueforti, aspartát-proteináza či enzym plísně Penicillium camemberti, metaloproteináza. Proteolytická aktivita plísní se výrazně uplatňuje především u sýrů s plísní na povrchu (FOX et al., 2004). 18

Proteolýza uskutečňována enzymy plísně Penicillium camemberti probíhá z převážné části na povrchu. Ve vnitřní vrstvě je aktivita podstatně nižší (LAW, 1997). Obr. 7 - Zjednodušené schéma rozkladu kaseinu (GÖRNER, VALÍK, 2004). 3.7.4 Klasifikace plísňových sýrů Dle druhu plísně podílející se na zrání sýrů, spadají plísňové sýry do dvou základních kategorií (BERESFORD, 2001). První kategorii tvoří povrchově zrající sýry, u kterých plíseň Penicillium camemberti tvoří povlak na jejich povrchu. Tyto sýry (Camembert, Brie) označujeme jako sýry s bílou plísní (CABALLERO et al., 2003). Do druhé kategorie řadíme sýry s modrou plísní (Roquefort), u nichž plíseň Penicillium roqueforti prorůstá vnitřní hmotu a vytváří tak charakteristické modré žilky. Existují však sýry, které se vyrábí za použití kombinace Penicillium camemberti a Penicillium roqueforti. Tyto sýry tak nesou bílou plíseň na povrchu a modrou plíseň uvnitř substrátu (FOX, 2000). 3.7.4.1 Sýry s plísní v těstě Mezi tři nejvýznamnější zástupce sýrů s modrou plísní patří Roquefort, Gorgonzola a Stilton. Nejdůležitějším aspektem výroby sýrů s plísní v těstě je zajistit optimální růst 19

použité kulturní plísně. Toho se dosáhne nejčastěji propichováním hmoty sýrů pomocí speciálních jehel (GÖRNER, VALÍK, 2004). Výrobní proces sýrů s plísní v těstě K výrobě těchto sýrů je důležitá homogenizace mléka. Tukové kuličky tak získávají větší povrch, což má za následek rychlejší průběh lipolýzy (GÖRNER, VALÍK, 2004). Anaerobní zrání uskutečňuje mezofilní mikroflóra Lactococcus lactis ssp. lactis a Leuconostoc ssp. Mléko je zaočkováno sporami plísní Penicillium roqueforti, které se účastní aerobního zrání (LUND, 2000). Množství spor je 10 3 až 10 4 na 1 ml mléka. Zaočkování se provádí buď rozprašováním na sýřeninu, nebo formou vodné suspenze, která se do mléka přidává před jeho koagulací syřidlem (GÖRNER, VALÍK, 2004). Koagulované mléko se krájí a drobí na zrno. Vzniká sýřenina, která se zahřívá na teplotu kolem 26 až 37 o C, při které se udržuje po dobu 30 minut. Za neustálého pohybu sýřeniny následuje odpouštění syrovátky, solení a formování (CALLEC, 2002). Několik dní se ponechává při teplotě 21 až 27 o C, během toho dochází k dofermentování veškeré laktózy. Hodnota ph se mění na 4,8 až 4,9. Roquefortské typy sýrů se solí jak v zrně u mladých sýrů, tak i na sucho po formování. Následuje propíchávání. Za 2 až 4 měsíce by mělo dojít k optimálnímu růstu plísní a dosažení požadovaných vlastností. Relativní vlhkost vzduchu zracích prostor je 90 až 95 % (GÖRNER, VALÍK, 2004). Během lipolýzy při zrání těchto sýrů se vzniklé volné mastné kyseliny působením oxidativní dekarboxylázy přeměňují na methylketony, které dodávají sýrům jejich typické aroma (FOX et al., 2004). Během zrání se na povrchu vytváří maz, který se musí odstraňovat. Dochází k rozvoji i některých kvasinek, konkrétně Debaryomyces hansenii, Kluyveromyces lactis a Candida ssp. (ROGINSKI et al., 2003). 20

Obr. 8 - Výrobní schéma sýru Roquefort (FOX, 2000). Obr. 9 - Sýr Roquefort (KUCHENGOTTER, 2012). 21

Tab. 2 - Přehled některých významných sýrů s plísní v těstě (LIKLER, KOPÁČEK, Země původu Francie Velká Británie Irsko Itálie 2007). Zástupce Roquefort Bleu de Gex Bleu des Causses Stilton Blue Stuart Jersey Blue Cashel Blue Gorgonzola Abeille Les Templiers Baragnaudes Blue stilton White stilton Gorgonzola dolce Gorgonzola picante Charakteristika Bělavá, jemně lesknoucí kůrka, vnitřní hmota bílá, prorostlá modrými žilkami ušlechtilé plísně Až 55 % tuku v sušině, tmavě žlutá barva kůrky i vnitřní hmoty Průmyslový druh Plíseň světlá, jemná konzistence smetanová chuť Tradiční druh Plíseň tmavší a znatelnější, chuť výraznější Dánsko Denablue 50 až 60 % tuku v sušině Německo Španělsko Řecko Izrael Rusko Švédsko Česká republika Edelpilzkäse Österzolla Queso Cabrales DO Picón DE Kopanisty Galil Syr rokfor Ädelost Niva Modřenín Chuť méně výrazná, smetanová Výrazná chuť Smetanové až sýrově žluté zbarvení, výrazná modrozelená plísňová oka Plíseň prorůstající vnitřní hmotu i povrch 22

3.7.4.2 Sýry s plísní na povrchu Při výrobním procesu sýrů s bílou plísní se přidávají do mléka nejčastěji spory kulturní plísně Penicillium camemberti či Penicillium caseicolum (LAW, TAMIME, 2010). Výrobní proces sýrů s plísní na povrchu Pro sýry typu Camembert je charakteristická doba zrání jen asi 1 až 2 týdny. Obsah tuku v sušině se zde pohybuje od 20 % do 65 % (LUND et al., 2000). Anaerobní zrání se uskutečňuje prostřednictvím mezofilního zákysu Lactococcus lactis ssp. lactis a Lactococcus lactis ssp. cremoris přidávaného k mléku vyhřátého na 30 o C (GÖRNER, VALÍK, 2004). Tím je zaručeno kysání sýřeniny. Přídavkem syřidla bílkoviny mléka koagulují. Sýřenina se může krájet a drobit s následným plněním do tvořítek. Poté probíhá odkapávání a kysání sýřeniny do druhého dne (CALLEC, 2002). Hodnota ph by měla být 4,8 až 4,6. To je velmi důležité pro růst kvasinkové a bakteriální mikroflóry, jejichž hlavní úloha spočívá zejména v prvním stádiu zrání těchto sýrů (GÖRNER, VALÍK, 2004). Tato mikroflóra částečně ovlivňuje výsledné aroma a chuť, kterou nejvíce dotváří plíseň Penicillium camemberti. Penicillium camemberti se podílí zejména na proteolýze (LAW, 1997). Konečným produktem proteolýzy je amoniak vzniklý deaminací aminokyselin. Tento děj vede ke zvýšení ph a vzniku charakteristické chuti (FOX et al., 2004). Po formování, kysání a zisku optimální konzistence následuje solení na sucho nebo v solné lázni (GÖRNER, VALÍK, 2004). Následně se po osolení provádí zaočkování kmenem kulturní plísně a nastupuje aerobní zrání. Při tomto procesu je velmi důležité obracení, aby byl přístup kyslíku rovnoměrný. Ve zracím prostoru je relativní vlhkost vzduchu nižší než u sýrů s plísní v těstě a to 80 až 85 %. Penicillium camemberti umožňuje rozklad bílkovin. Stejně jako Penicillium roqueforti se podílí i na hydrolýze tuku, při které dochází k tvorbě methylketonů. Během zrání se tvoří i některé kvasinky, které ve větším množství mohou znemožňovat růst plísně kulturní. Asi po 3 týdnech zrání následuje balení sýrů a jejich skladování při teplotě kolem 5 o C (GÖRNER, VALÍK, 2004). 23

Obr. 10 - Výrobní schéma sýrů Camembert a Brie (FOX et al., 2004). Obr. 11 - Sýr Camembert (CURDNERD, 2012). 24

Tab. 3 - Přehled některých významných sýrů s plísní na povrchu (FOX et al., 2004). Země původu Zástupce Charakteristika Francie Camembert Brie Carré de l' Est Coulommier Měkká, krémová konzistence, vnitřní hmota slámové barvy Pikantní chuť Měkká konzistence, podobné vlastnosti jako Brie Německo Geramond Měkká konzistence Slovensko Plesnivec Smetanově krémová konzistence Česká republika Hermelín Napodobenina francouzského sýru Camembert 3.7.4.3 Sýry dvouplísňové Specifikum dvouplísňových sýrů spočívá v kombinaci bílé plísně na povrchu a modré plísně uvnitř hmoty. Dalším charakteristickým rysem je poměrně vysoký obsah tuku v sušině a to až 70 %. Za původní dvouplísňový sýr je považován sýr německého typu Cambozola. Jedná se o kombinaci sýrů Gorgonzola a Camembert. U nás se jako dvouplísňový sýr vyrábí Sedlčanský Vltavín (GURMETKLUB, 2013). Obr. 12 - Sýr Cambozola (GURMETKLUB, 2013). 25

Tab. 4 - Taxonomický a fylogenetický přehled výskytu plísní izolovaných ze sýrů (ROPARS et al., 2012). Druh plísně Chrysosporium sulfureum Fusarium domesticum Lecanicillium lecanii Penicillium biforme Penicillium camemberti Penicillium caseifulvum Penicillium crustosum Penicillium chrysogenum Penicllium fuscoglaucum Penicillium nalgiovense Penicillium nordicum Penicillium palitans Penicillium paneum Penicillium roqueforti Penicillium solitum Scopulariopsis brevicaulis Scopulariopsis candida Scopulariopsis flava Scopulariopsis fusca Sphaerosporium equinum Sporendonema casei Penicillium camemberti var. rogeri Penicillium camemberti var. caseicola Substrát izolátu Sýry Sýry, švýcarské raclette sýry, prostředí sýrů Prostředí sýrů Francouzské sýry, prostředí sýrů Francouzské sýry typu Camembert Sýry typu Camembert Sýry typu Camembert Dánské sýry Denablue Prostředí sýrů Sýry Prostředí sýrů Ellischau (Nalžovské) sýry Prostředí sýrů Nizozemské sýry Prostředí sýrů Sýry typu Roquefort a Cheddar, prostředí sýrů Prostředí sýrů Sýry Francouzské sýry, povrch sýrů, prostředí sýrů Francouzské sýry Cental, prostředí sýrů Prostředí sýrů Sýry, povrch ovčích sýrů Sýry, prostředí sýrů 26

V této studii je zaznamenán taxonomický a fylogenetický přehled nejdůležitějších plísní podkmene Ascomycota, poskytnutých výrobci sýrů a startovacích kultur pro výrobu sýrů. Pro stanovení těchto izolátů byla použita molekulární metoda (LSU rrna), která je založena na sekvenční analýze genu. Metoda ukázala, že plísně používané pro výrobu sýru se řadí do dvou tříd. První třída se nazývá Eurotiomycetes, kam řadíme rod Penicillium. Druhou třídou je Sordariomycetes, zahrnující zejména rod Scopulariopsis (ROPARS et al., 2012). 3.8 Plísně jako možné příčiny kažení mléčných výrobků Plísně tvoří širokou škálu mikroorganismů kontaminující mléko a mléčné výrobky. Růst nežádoucích plísní zapříčiňuje nevhodnost produktů ke spotřebě a z hlediska výrobce podstatnou ekonomickou ztrátu (GROVE, 1998). 3.8.1 Plísně kontaminující sýry Plísně se mohou vyskytovat na vlhkých místech mlékárenského závodu, a pokud nejsou zavčas odstraněny, může docházet k přenosu spor plísní na sýry. Důsledkem je plesnivění povrchu sýrů. Nejčastějším faktorem umožňující kontaminaci povrchu sýrů je přítomnost kyslíku. U sýrů balených je tento nežádoucí růst omezen, avšak některé formy jsou schopné růstu i za nepřítomnosti vzdušného kyslíku. Mezi takové se řadí nejčastěji rod Penicillium ssp. a Cladosporium. U sýrů, které nepotřebují během zrání kyslík, se proti plesnivění používají látky vytvářející z části nepropustnou vrstvu. Nebo se sýry balí do fólií z plastických hmot (GÖRNER, VALÍK, 2004). Je identifikováno až 371 plísní způsobujících kažení sýrů, z nichž svými 91 % převládá právě rod Penicillium ssp. Nejčastějším zástupcem tohoto rodu je Penicillium commune (GROVE, 1998). Dalšími zástupci těchto plísní jsou Fausarium, Scopulariopsis, již zmíněný rod Cladosporium, Aspergillus a Verticillium (GÖRNER, VALÍK, 2004). Na kažení krémových sýrů se podílí tepelně 27

rezistentní plíseň Byssochlamys nivea, která je schopna růstu při koncentraci kyslíku nižší než 0,5 % (SPERBER, DOYLE, 2009). Obr. 13 - Penicillium commune Obr. 14 - Byssochlamys nivea (MICROFUNGI, 2012). (ENCYKLOPEDIA OF LIFE, 2013). 3.9 Metabolické produkty plísní 3.9.1 Mykotoxiny Velké množství hub produkuje sekundární metabolity zvané mykotoxiny. Obecně se jedná o látky mutagenních a karcinogenních vlastností. I přesto, že toxicita některých mykotoxinů pro člověka nebyla zcela prokázána, jejich vliv na testovaných zvířatech ponechává jen málo pochybností o potenciální i skutečné toxicitě pro člověka (JAY et al., 2005). Jedním z nejznámějších producentů mykotoxinů z řad plísní patří rod Penicillium (COULTATE, 2002). Mykotoxiny se do mléčných výrobků mohou dostat dvěma způsoby. Prvním je nepřímá kontaminace, kdy dojnice přímo zkonzumuje zdroj mykotoxinu či přímou kontaminací, kdy dochází k náhodnému nebo záměrnému růstu plísní (SENGUN et al., 2008). 28

3.9.1.1 Mykotoxiny v sýrech produkované plísněmi Tab. 5 - Přehled některých mykotoxinů produkovaných plísněmi izolovaných ze sýrů (SENGUN et al., 2008, HOCKING, 2006, ROBERTS, 2005). Plíseň Produkovaný mykotoxin Typ sýru Penicillium roqueforti Patulin, Kyselina penicilová Cheddar Kyselina mykofenolová, Patulin, PR toxin Kyselina mykofenolová, Kyselina penicilová Sýr s modrou plísní Roquefortin C Penicillium camemberti Kyselina cyklopiazonová Camembert Byssochlamys nivea Kyselina mykofenolová Krémové sýry Penicillium casei Penicillium nordicum Ochratoxin A Ochratoxin A Švýcarské tvrdé sýry Švýcarské tvrdé sýry Kyselina cyklopiazonová Představuje jeden z nejdůležitějších mykotoxinů produkovaných plísní Penicillium camemberti nalezených v sýrech typu Camembert. Výskyt kyseliny cyklopiazonové je z převážné části v kůře. Nedozrálé sýry skladované v chladnějším prostředí neobsahují více než 500 µg kyseliny cyklopiazonové na 1 kg. K výraznému nárůstu dochází zejména při vyšších teplotách skladování a to až na 5000 µg na kg. Proto je důležité dodržovat podmínky skladování pro zabránění růstu tohoto mykotoxinu (WEIDENBÖRNER, 2001). 29

Obr. 15 - Kyselina cyklopiazonová (WIKIPEDIE, 2013). PR toxin Penicillium roqueforti-toxin je považován za nejvíce akutně toxický toxin. Tvoří se za nízké koncentrace NaCl, při nízkém ph, v přítomnosti sacharózy a za optimálního množství kyslíku (ABBAS, DOBSON, 2011). PR toxin funguje jako inhibitor proteinové syntézy a nukleových kyselin. V prostředí sýrů s modrou plísní je však nestabilní a mění se na méně toxický PR-imin a PR-amindein, jejichž stabilita je také velmi malá (FOX et al., 2004). Roquefortin Nejčastějším metabolitem Penicillium roqueforti v sýrech s modrou plísní je dále mykotoxin Roquefortin C, který je velmi často doprovázen Roquefortinem A. Roquefortin B se vyskytuje jen v menší míře (FOX et al., 2004). Stejně jako PR toxin i Roquefortin je v prostředí sýrů poměrně nestabilní a tudíž nepředstavuje závažné zdravotní riziko pro spotřebitele. Z hlediska bezpečnosti je však lepší používat jako startovací kulturu Penicillium roqueforti, která s sebou nepřináší riziko sekundárních metabolitů (ABBAS, DOBSON, 2011). 30

Obr. 16 - Roquefortin C (ADIPOGEN, 2013). 3.10 Ochrana proti růstu nežádoucích plísní Nárůst nekulturních plísní má za následek znehodnocení výrobků s možností tvorby mykotoxinů a negativní vliv na zdraví konzumenta (GROVE, 1998). Proti růstu nežádoucích plísní na sýrech se využívají potravinářská antimykotika s přídavkem aktivních látek a to natamycin a sorban draselný. Z hlediska chuti je výhodnější používat natamycin, který oproti sorbanu draselnému difunduje do vnitřní vrstvy sýrů jen zlehka a nemění tak chuť. Vůči sorbanu draselnému jsou některé plísně rodu Penicillium rezistentní. Vážný problém způsobuje degradace kyseliny sorbové a sorbanu draselného, které metabolizují za vzniku trans-1,3-pentadienu, který v sýrech vyvolává pach po kerosinu (petroleji). Obsah kyseliny sorbové by v sýrech neměl překračovat hodnotu 2000 mg.kg -1 (GÖRNER, VALÍK, 2004). Převážná část plísní je zničena během pasteračního režimu. Je však důležité použití i další metody zabraňující opětovné kontaminaci. Jako ochrana proti rekontaminaci se používá metoda modifikované atmosféry (MAP), která prokazatelně zpomaluje, až inhibuje růst těchto plísní. Tato metoda je založena na určité koncentraci CO 2, O 2 a N 2 v přímé závislosti na baleném produktu (GROVE, 1998). Pro plísňové sýry je nejúčinnější použití vyšší koncentrace CO 2 v řízené atmosféře (SPERBER, DOYLE, 2009). 31

3.11 Charakteristika kvasinek Kvasinky jsou eukaryotní mikroskopické organismy náležející stejně jako plísně do říše hub. Jejich název je odvozený dle schopnosti velké části kvasinek zkvašovat některé monosacharidy, disacharidy a trisacharidy za vzniku oxidu uhličitého a ethanolu (ŠILHÁNKOVÁ, 2002). 3.12 Rozmnožování kvasinek Růst kvasinek je charakteristický zejména koloniemi, které se vytváří z buněk o průměru 5 až 10 µm. Rozmnožování se dělí obdobně jako u plísní na pohlavní a nepohlavní (GÖRNER, VALÍK, 2004). Pohlavní rozmnožování probíhá spájením dvou haploidních buněk (konjugace) a spájením jader buněk (karyogamie), přičemž vzniká jádro diploidní. Následuje redukční dělení diploidního jádra neboli meióza. Následně vznikají čtyři haploidní jádra, která tvoří základ spory. Vegetativní množení se děje převážně pučením. Dochází ke vzniku dceřiné buňky (pupenu), která je spojena kanálkem s buňkou mateřskou. V pupenu se syntetizuje endoplazmatické retikulum, vytváří se buněčná stěna, dochází k vzrůstu pupenu a spojení několika vakuol ve vakuolu jedinou. V této fázi je pučení ukončeno a následuje oddělení dceřiné buňky od buňky mateřské (ŠILHÁNKOVÁ, 2002). 32

Obr. 17 - Životní cyklus kvasinek (WIKIPEDIE, 2013). 3.13 Vlastnosti kvasinek Ke svému růstu potřebují kvasinky přítomnost vzdušného kyslíku. Schopnost kvasinek spočívá v přeměně metabolismu za anaerobních podmínek na metabolismus fermentační za vzniku ethanolu a oxidu uhličitého. Růst kvasinek je možný v širokém rozmezí teplot od 0 až do 45 o C a ph o hodnotách 3 až 11. Je však důležité poznamenat, že některé druhy kvasinek jsou schopné růstu i za velmi nízkých teplot kolem -10 o C, ph 1,5, za přítomnosti vysokých koncentrací chemických konzervantů, cukru i soli (GÖRNER, VALÍK, 2004). 3.14 Taxonomické rozdělení potravinářsky významných kvasinek Kvasinky využívané v potravinářství se rozdělují dle způsobu rozmnožování do dvou základních skupin. První skupinu zastupují kvasinky vytvářející askospory, nazývané Endomycetales (kvasinky perfektní). Druhou skupinu tvoří kvasinky sporogenní, zvané Cryptococcales (kvasinky imperfektní). Pro přehlednost 33

jsem rozdělení potravinářsky využívaných kvasinek zaznamenala do tabulky (GÖRNER, VALÍK, 2004). Tab. 6 - Taxonomické rozdělení potravinářsky významných kvasinek (GÖRNER, VALÍK, 2004, NARANG, 2008). Endomycetales Cryptococcales rod Schizosaccharomyces rod Saccharomycopsis rod Saccharomycodes rod Hanseniaspora rod Sacharomyces rod Zygosaccharomyces rod Debaryomyces rod Kluyveromyces rod Geotrichum rod Candida rod Cryptococcus rod Malassezia rod Kloeckera rod Brattanomyces rod Rhodotorula rod Sporobolomyces podrod Pichia podrod Hansenula rod Dekkera rod Metschnikowia rod Torulaspora 34

3.15 Význam plísní z potravinářského hlediska Kvasinky jsou důležité mikroorganismy využívané v pekárenském průmyslu, v kvasném průmyslu pro výrobu piva či vína a v neposlední řadě v mlékárenském průmyslu pro výrobu sýrů, másla a fermentovaných mléčných výrobků, zejména kefírů a kumysů. Schopnost kvasinek růst za nízkých hodnot ph, teploty, nižší vlhkosti, vyšší koncentraci cukru a soli, v kombinaci s jejich enzymatickou aktivitou je předurčuje pro využití v mlékařství (DILIP et al., 2004). Mezi nejvíce využívané kvasinky pro výrobu mléčných výrobků řadíme: Debaryomyces hansenii, Galactomyces geotrichum, Geotrichum candidum, Candida lipolytica, Kluyveromyces marxianus, Candida kefir, Kluyveromyces lactis var. lactis, Candida famata, Saccharomyces cerevisiae, Candida robusta a další (ROGINSKI et al., 2003). 3.16 Kvasinkové kultury využívané v mlékárenském průmyslu Dle charakteru použití kvasinek v mlékařství dělíme kvasinkové kultury na: 1.) kvasinkové kultury pro výrobu sýrů zrajících pod mazem, 2.) kvasinkové kultury pro výrobu sýru s plísní, 3.) kvasinkové kultury pro výrobu másla, 4.) kvasinkové kultury pro výrobu kefírů a dalších nápojových kultur. 1.) Kvasinkové kultury pro výrobu sýrů zrajících pod mazem Tato kultura obsahuje kvasinky Kluyveromyces lactis, Candida utilis a Torulopsis candida. Jejich úlohou je oxidace kyseliny mléčné na povrchu mladých sýrů, čímž vytvářejí optimální podmínky pro růst Brevibacterium linens. Mají schopnost přežívat vyšší koncentrace NaCl, jehož roztokem se omývá povrch sýrů (GÖRNER, VALÍK, 2004). 35

2.) Kvasinkové kultury pro výrobu sýrů roquefortského typu Jedná se o kvasinkovou kulturu skládající se z rodů Torulopsis candida a Kluyveromyces lactis. Významně se podílejí na vzniku typického aroma tvorbou pěti až devíti uhlíkatých methylketonů a ethanolu, který s volnými mastnými kyselinami dávají vznik aromatických esterů (GÖRNER, VALÍK, 2004). 3.) Kvasinkové kultury pro výrobu másla Pro prodloužení trvanlivosti másla a zlepšení jeho jakosti se využívá kvasinková kultura obsahující druhy Cryptococcus laurenti a Torulopsis candida (GÖRNER, VALÍK, 2004). 4.) Kvasinkové kultury pro výrobu kefírů a dalších nápojových kultur Kefírová kvasinková kultura je složena z druhů Candida kefir, Torulopsis lactis var. condensi a Kluyveromyces fragilis. Tyto kvasinky se účastní fermentace mléka společně s Lactobacillus delbrueckii ssp. lactis, Lactobacillus delbrueckii a Lactobacillus acidophilus, při čemž dochází k fermentaci laktózy (DILIP et al., 2004). 3.17 Úloha kvasinek při výrobě sýrů zrajících pod mazem Sýry zrající pod mazem jsou rozšířeným typem sýrů s výraznou proteolytickou aktivitou (GÖRNER, VALÍK, 2004). Výroby se účastní mazová kultura složená zejména z Brevibacterium linens, Arthrobacter a kvasinek Debaryomyces hansenii, Geotrichum candidum a Candida lipolytica (ROGINSKI et al., 2003). Výrobní proces sýrů zrajících pod mazem Výchozí surovinou je plnotučné mléko zaočkované mezofilním zákysem s následným srážením pomocí syřidla. Očkování se provádí rozprašováním suspenze mazové kultury, samovolným očkováním v prostředí sýrárny nebo omýváním slanou vodou. Po krájení a drobení následuje odpouštění části syrovátky. 36

Přidá se teplá voda pro zlepšení synereze sýrového zrna a zředění laktózy, čímž se zabrání vzniku většího množství kyseliny mléčné. Kyselina mléčná by zhoršovala průběh proteolytického aerobního zrání. Poté se provádí formování a může se provádět i lisování. Následuje solení v solné lázni a zrání ve zracím prostoru při relativní vlhkosti 90 až 95 % a teplotě 13 až 15 o C (GÖRNER, VALÍK, 2004). Význam kvasinek během výrobního procesu Hlavní úloha kvasinek spočívá v rozkladu kyseliny mléčné a mléčnanů, v přítomnosti vzdušného kyslíku na CO 2 a H 2 O. To má za následek zvyšování hodnot ph, jak ve vnitřní vrstvě substrátu, tak i na povrchu. Odkyselením povrchu sýrů je umožněn růst mazové mikroflóry Arthrobacter a Brevibacterium linens. Hodnota ph na povrchu pro optimální růst mazové kultury by neměla být kyselejší než 5,5. Další úlohou kvasinek je produkce vitamínů, které také podporují růst mazové kultury. Z produkovaných vitamínů je to konkrétně niacin, riboflavin a kyselina pantotenová (GÖRNER, VALÍK, 2004). 3.17.1 Klasifikace sýrů zrajících pod mazem Zástupci sýrů zrajících pod mazem se rozdělují do dvou skupin podle typu probíhajícího srážení. Hlavními představiteli sladkých sýrů zrajících pod mazem je Romadur, Pepin a Romadůžek, které charakterizuje sladké srážení (ROBINSON, 2005). Představitelem kyselých sýrů zrajících pod mazem s využitím kyselého srážení jsou u nás Olomoucké tvarůžky. Ze zahraničních zástupců může být zmíněn například Limburger, Herve a Livarot (VLKOVÁ et al., 2006). 3.17.1.1 Sladké sýry zrající pod mazem Romadur Výroby sýrů typu romadúr se účastní kvasinky Geotrichum candidum, Candida lipolytica, Candida vini, Candida krusei a Debaryomyces hansenii, které degradují kyselinu mléčnou. Dochází ke zvýšení ph na neutrální hodnoty. Tím se připravují vhodné podmínky pro růst Brevibacterium linens a Micrococcus a současně i zamezení růstu nežádoucích plísní (ROBINSON, 2005). 37

Pepin Na zrání se podílí kvasinková mikroflóra skládající se z rodu Kluyveromyces a Geotrichum, které zajišťují optimální růst mazové kultury Bravibacterium a Staphylococcus xylosus (ROBINSON, 2005). Romadůžek Kvasinková kultura je složena z kvasinek Kluyveromyces a Debaryomyces hansenii. Jejich úloha při zrání sýrů je obdobná jako u předešlých zástupců (ROBINSON, 2005). Obr. 18 - Debaryomyces hansenii Obr. 19 - Sýr Romadur (LAW, TAMIME, 2010). (WIKIPEDIE, 2013). Na snímku (obr. 14) je zobrazena elektronová mikroskopie Debaryomyces hansenii (4 µm) vyzrálého sýru Romadur (LAW, TAMIME, 2010). 3.17.1.2 Kyselé sýry zrající pod mazem Olomoucké tvarůžky Řadí se mezi kyselé sýry, při jejichž výrobě se uplatňuje kyselé srážení. Výchozí surovinou je tvaroh, který má kyselost 120 až 160 o SH. Vysokou kyselost způsobuje obsah kaseinu v tvarohu a kyseliny mléčné. Přídavek uhličitanu sodného či vápenatého snižuje kyselost tvarohu na 115 o SH. Aby mohlo proběhnout vlastní zrání proteolytickými enzymy bakterií je kyselost stále vysoká. To je moment, kdy se využívá schopnosti kvasinek rodu Candida a Torulopsis oxidovat 38

kyselinu mléčnou na CO 2 a H 2 O. Reakce probíhá při teplotě 18 až 45 o C, při které tvarůžky vysychají až do získání hodnot ph 6,4 a obsahu sušiny 36 %. Proto se tento proces s využitím kvasinkové kultury nazývá sušení (GÖRNER, VALÍK, 2004). Obr. 20 - Candida utilis Obr. 21 - Olomoucké tvarůžky (POBIOEGLOOS, 2007). (INOVAČNÍ PODNIKÁNÍ, 2013). 3.18 Úloha kvasinek při výrobě sýrů s plísní Kvasinky tvoří důležitou složku výroby sýrů s plísní na povrchu či s plísní v těstě. Společně s kulturními plísněmi se podílí za zrání (BERESFORD, 2001). 3.18.1 Sýry s plísní na povrchu U sýrů s plísní na povrchu, činností proteolytických a lipolytických enzymů kvasinek, vznikají sloučeniny difundující do vnitřní vrstvy sýrů. Kvasinky mají schopnost asimilace laktátu, produkce alkalických sloučenin, které odkyselují vnitřní a povrchovou vrstvu sýrů (GÖRNER, VALÍK, 2004). Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis, Geotrichum candidum a Debaryomces hansenii stimulují růst rodu Lactococcus lactis a následně i Penicillium camemberti. Největší nárůst kvasinek, plísní a Lactococců je během prvních čtyř dnů zrání (BERESFORD, 2001). Ačkoliv kvasinky nejsou z hlediska výroby sýrů s plísní na povrchu nejdominantnější mikroflórou, mají podstatnou úlohu 39

v navozování interakcí v průběhu zrání s plísněmi a zejména s bakteriemi mléčného kvašení (CORSETTI et al., 2001). Nejvýznamnějším zástupcem kvasinek, které se vyskytují téměř ve všech povrchově zrajících sýrech v počáteční fázi zrání, je Geotrichum candidum (BOUTROU, GUÉGUEN, 2005, SATYANARAYANA, KUNZE, 2009). 3.18.1.1 Geotrichum candidum Zařazení rodu Geotrichum candidum není zcela jednoznačné. Jedna část odborné literatury řadí rod Geotrichum mezi kvasinky, jiná jako přechod mezi kvasinkami a plísněmi. To je zapříčiněno širokou rozmanitostí jeho genotypu a fenotypu (BOUTROU, GUÉGUEN, 2005). Jeho vysoká biochemická aktivita je využívána pro výrobu sýrů, kde pomáhá vytvářet strukturu, soudržnost a tloušťku vrchní vrstvy sýrů (ROGINSKI et al., 2003). Vyskytuje se zejména na povrchu sýrů, které obsahují vyšší obsah volných mastných kyselin. Tvorbou lipáz mění jejich profil. Z triglyceridů uvolňují kyselinu olejovou a další nenasycené mastné kyseliny (ROGINSKI et al., 2003). Tato kvasinka se vyznačuje také vyšší proteolytickou aktivitou. Produkuje dva typy proteináz, extracelulární a intracelulární (FUQUAI et al., 2011). Extracelulární proteolytická aktivita je nižší ve srovnání s intracelulární. Extracelulární proteinázy rodu Geotrichum candidum jsou termolabilní a rychleji se inaktivují při ph 4,0. Významný podíl na utváření organoleptických vlastností má také tvorba peptidáz. Geotrichum candidum snižuje hořkost prostřednictvím aminopeptidáz. Ty hydrolyzují nižší peptidy pocházející z degradace β-kaseinu působením Penicillium camemberti. Je prokázané, že v závislosti na použitém kmenu Geotrichum candidum lze výrazně snížit hořkost beze změny vzhledu sýru a chuti. Nebo lze snížit hořkost, změnit vzhled a posílit příchuť, která je charakteristická pro tradiční sýr Camembert (BOUTROU, GUÉGUEN, 2005). Geotrichum candidum se však dle studií nepodílí jen na zrání sýrů tohoto typu. Tento rod také vykazuje vysokou schopnost inhibice nežádoucích mikroorganismů kontaminující plísňové sýry, jako je například Penicillium commune. Tato schopnost byla prokázána na laboratorním médiu (sýr Camembert), kde se jako startovací kultura 40

zvolil rod Geotrichum a jako mikrobiální kontaminant Penicillium commune (NIELSEN et al., 1998). Obr. 22 - Elektronová mikroskopie sýru zrajícího od povrchu zobrazující růst Geotrichum candidum (2 µm), (LAW, TAMIME, 2010). 3.18.2 Sýry s plísní uvnitř Kvasinky se podílí na zrání sýrů s plísní uvnitř, konkrétně sýrů roquefortského typu. Jejich činností lipolytických enzymů, při které dochází k degradaci mléčného tuku, vznikají aromatické rozkladné produkty methylketony. Produkují také ethanol, který reaguje s volnými mastnými kyselinami za vzniku aromatických esterů (GÖRNER, VALÍK, 2004). Tvorba plynu heterofermentativní mikroflórou, zejména rodem Leuconostoc, je stimulována právě kvasinkami. To má za následek zpřístupnění vnitřní vrstvy sýru a snadnější vývoj Penicillium roqueforti (BERESFORD, 2001). 3.19 Úloha kvasinek při výrobě másla Kvasinková kultura složená z druhů Cryptococcus laurenti a Torulopsis candida dává vznik redukujících látek. Spotřebou vzdušného kyslíku v másle dochází k zabránění nežádoucí oxidace tuku. Tím se eliminuje vznik chemických chyb 41

v dlouhodobě skladovaném mraženém másle. Výsledkem je prodloužení trvanlivosti a zlepšení jakosti másla (GÖRNER, VALÍK, 2004). 3.20 Úloha kvasinek při výrobě kefírů Kefírem se rozumí kysaný mléčný výrobek s malým obsahem alkoholu, jehož základem jsou kefírová zrna (HUI et al., 2007). Pro výrobu kefírů se používá kvasinková kefírová kultura složená zejména z druhů Candida kefir, Torulopsis lactis var. condensi a Kluyveromyces fragilis (DILIP et al., 2004). Působením enzymatické aktivity kvasinkové mikroflóry společně s působením mikroflóry Lactobacillus delbrueckii ssp. lactis, Lactobacillus delbrueckii a Lactobacillus acidophilus vznikají typické chuťové a aromatické vlastnosti kefírů (RENNENBERG, 2008). Výrobní proces kefírů Hlavní význam bakterií při výrobě kefírů je koagulace kaseinu a poměrně rychlá tvorba kyseliny mléčné. V přítomnosti kvasinek je podporován jejich růst (GÖRNER, VALÍK, 2004). Hlavní úlohou kvasinek je fermentace laktosy za současné produkce CO 2 a ethanolu (DILIP et al., 2004). Produkcí CO 2 jsou kefírová zrna vyplavovány na povrch mléka. Koagulovaný kasein se přichytí na jejich povrch a vytváří se tak kaseinová vrstva, kde probíhá další množení a metabolické procesy příslušné mikroflóry. Mléko se fermentuje 1 až 2 dny kefírovou kulturou při teplotě 18 až 22 o C. Dosažená kyselost zralého kefíru je v rozmezí 36 až 44 o SH (GÖRNER, VALÍK, 2004). Při výrobě kefírových mlék se používá opět teplota 18 až 22 a požadovaná kyselost je 36 až 40 o SH. Hlavní rozdíl mezi kefírem a kefírovým mlékem spočívá v rozdílném množství použitých kvasinek. U kefírů se používá řádově 10 4 kvasinek, u kefírového mléka je počet nižší a to 10 2 (GÖRNER, VALÍK, 2004). o C 42