RUO ELISA-VIDITEST Neurofilamenta-L OD-077 Návod k použití soupravy VÝROBCE: VIDIA spol. s r.o., Nad Safinou II 365, Vestec, 252 42 Jesenice, ČR, tel.: +420 261 090 565, info@vidia.cz, www.vidia.cz 1. NÁZEV SOUPRAVY: ELISA-VIDITEST Neurofilamenta-L ELISA souprava pro detekci lehkého řetězce neurofilament v mozkomíšním moku. 2. POUŽITÍ: ELISA-VIDITEST Neurofilamenta-L je souprava určena pro stanovení koncentrace neurofilament L (NF-L) v mozkomíšním moku. NF-L může být použit jako marker neuronální degenerace jak v mozku modelových zvířat, tak i u lidí s neurodegenerativním onemocněním mozku. Signifikantně zvýšené množství NF-L bylo nalezeno v mozkomíšním moku u pacientů s vaskulární demencí, frontotemporální demencí, amyotrofickou laterální sklerózou, olivopontocerebelární atrofií, pacientů s hydrocefalem s normálním tlakem, infarktem cerebella, sclerosis multiplex, Parkinsonovy a Alzheimerovy choroby, demence s Lewysovy tělísky a také u Lymeské neuroboreliózy. 3. PRINCIP TESTU: ELISA-VIDITEST Neurofilamenta-L je imunoanalytický test na pevné fázi. Je založený na použití polyklonálních a monoklonálních protilátek, které vážou neurofilamenta-l (NF-L). Na povrch jamek je imobilizována specifická anti-nf-l protilátka. Na tuto protilátku se během první inkubace naváží molekuly NF-L přítomné v mozkomíšním moku. Jamky jsou následně promyté, druhá inkubace pobíhá s anti-nf-l monoklonálními protilátkami. K zesílení reakce se používá biotinylovaná protilátka a následná vizualizace probíhá pomocí streptavidinem značené alkalické fosfatázy a 4-nitrofenyl fosfátového roztoku, jako substrátu pro alkalickou fosfatázu. 4. OBSAH SOUPRAVY: 16-jamkové ELISA stripy (bezbarvé) v manipulačním rámečku, potažené specifickou polyklonální protilátkou STRIPS Ab 6 ks NF-L antigen Standard (NF-L), lyofilizát STANDARD 1 lahvička 0,2 ml myší anti-nf-l IgG protilátky 1 (IgG 1) 100 x konc. Ab IgG1 1 lahvička 0,2 ml myší anti-nf-l IgG protilátky 2 (IgG 2) 100 x konc. Ab IgG2 1 lahvička 0,2 ml biotinylované králičí anti-myší IgG protilátky (anti-igg-biot) 100 x konc. CONJ Biot 1 lahvička 0,2 ml alkalické fosfatázy značené streptavidinem (Str-AP) 100 x konc. CONJ Str-AP 1 lahvička 15 ml 4-nitrofenyl fosfátového (4-NPP) roztoku r.t.u. 1) SUBS 4-NPP 1 lahvička 125 ml promývacího roztoku 10 x konc. WASH 10x 1 lahvička 125 ml ředicího roztoku r.t.u. DIL 1 lahvička Návod k použití soupravy Certifikát kontroly kvality 1) r.t.u., ready to use (v pracovní koncentraci) 1
5. POTŘEBNÝ MATERIÁL NEDODÁVANÝ SE SOUPRAVOU: Destilovaná/deionizovaná voda pro ředění promývacího roztoku, pipetovací zařízení, zařízení pro rozplňování roztoků a promývání stripů, spektrofotometr / kolorimetr (405 nm), termostat. 6. PŘÍPRAVA REAGENCIÍ, STANDARDŮ A VZORKŮ: a. Vytemperujte všechny složky soupravy na laboratorní teplotu. b. Připravte pracovní koncentraci promývacího roztoku jeho naředěním 10x ve vhodném objemu destilované/deionizované vody. (např. 100 ml promývacího roztoku + 900 ml H 2 O). Pokud jsou v koncentrovaném roztoku krystaly soli, zahřejte ho na vodní lázni na 32-37 C a před naředěním dobře promíchejte. Nespotřebovaný promývací roztok v pracovní koncentraci lze skladovat 1 týden při teplotě +2 až +10 o C. c. 4-nitrofenyl fosfátový roztok a ředící roztok (DIL) neřeďte, jsou v pracovní koncentraci (r.t.u.). d. Těsně před použitím nařeďte testované mozkomíšní moky ředicím roztokem v poměru 1 : 1 (např. 50 µl testovaného mozkomíšního moku + 50 µl ředicího roztoku). e. Těsně před použitím nařeďte myší anti-nf-l IgG protilátku 1 (anti-igg 1) a myší anti- NF-L IgG protilátku 2 (IgG 2) v poměru 1:1 100 x ředicím roztokem a důkladně zamíchejte (např. 0,1 ml IgG1 + 0,1 ml IgG2 + 9,8 ml ředicího roztoku (DIL)). (Pozn.: Pro zpracování 12 stripů (tj. 1 rámečku) je zapotřebí cca 10 ml ředěné směsi IgG 1 a IgG 2.) f. Těsně před použitím nařeďte biotinylovanou králičí anti-myší IgG protilátku (anti- IgG-biot) 100 x ředicím roztokem a důkladně zamíchejte (např. 0,1 ml anti-igg-biot + 9,9 ml ředicího roztoku). (Pozn.: Pro zpracování 12 stripů (tj. 1 rámečku) je zapotřebí cca 10 ml ředěného anti-igg-biot.) g. Těsně před použitím nařeďte alkalickou fosfatázou značenou streptavidinem (Str- AP) 100 x ředicím roztokem (DIL) a důkladně zamíchejte (např. 0,1 ml Str-AP + 9,9 ml ředicího roztoku). (Pozn.: Pro zpracování 12 stripů (tj. 1 rámečku) je zapotřebí cca 10 ml ředěné Str-AP. Dobře promíchejte.) h. Rehydratujte NF-L antigen 1 ml ředicího roztoku, přičemž získáte koncentraci NF-L 100 ng/ml. Pro budoucí použití skladujte koncentrát NF-L při -20 C maximálně 6 měsíců. Těsně před použitím Standardy NF-L nařeďte z koncentrátu ředicím roztokem podle následující tabulky (viz Tab. 1): Tab. 1 Schéma přípravy Standardů A až F: Objem Standardu Objem ředicího roztoku (DIL) v µl Výsledná koncentrace Standardu v pg/ml Označení Standardu 100 000 NF-L 20 µl NF-L 980 µl 2000 ST F 500 µl ST F 500 µl 1000 ST E 500 µl ST E 500 µl 500 ST D 500 µl ST D 500 µl 250 ST C 400 µl ST C 600 µl 100 ST B 400 µl ST B 400 µl 50 ST A 2
7. PRACOVNÍ POSTUP: a. Stripy, vakuově zatavené s desikantem, nechte před otevřením sáčku vytemperovat na laboratorní teplotu, aby nedošlo k orosení destičky. Připravte si potřebný počet stripů pro reakci. Nepoužité stripy společně s desikantem dobře uzavřete do sáčku se zipem nebo vakuově zatavte. b. Promyjte jamky 3x promývacím roztokem 250 µl/jamku. Vyvarujte se přetékání roztoku ven z jamek. Obsah jamek odsajte a destičku vyklepněte na přířez buničité vaty. c. Naplňte příslušné jamky po 100μL připravenými Standardy (ST A až F) a ředěnými testovanými mozkomíšními moky podle následujícího schématu (viz Obr. 1). Je zapotřebí každý vzorek napipetovat do dvou paralelních stripů (například, když pipetujete vzorek do jamky A prvního stripu, potom musíte nepipetovat tentýž vzorek i do jamky A druhého stripu). Stripy 2, 4, 6, 8, 10 a 12 jsou kontroly (pozadí) pro stripy 1, 3, 5, 7, 9 a 11. První jamky stripů č. 1 a 2 naplňte samotným ředicím roztokem pro stanovení celkového pozadí reakce (DIL). Další jamky stripů 1 a 2 naplňte Standardy NF-L (ST A, ST B, ST F). Zbývající jamky naplňte v duplikátech ředěnými testovanými moky (M1, M2, M3,...). Každý mok stačí aplikovat v jednom duplikátu jamek. Chcete-li vyloučit laboratorní chybu, aplikujte mok na dvě jamky příslušného stripu. Inkubujte 2 hodiny (+/- 5 min.) při teplotě +37 C. d. Odsajte obsah jamek do pojistné sběrné láhve obsahující vhodný dezinfekční prostředek (viz Bezpečnostní předpisy). Jamky poté 5x promyjte 250 μl promývacího roztoku. Vyvarujte se přetékání roztoku ven z jamek. Obsah jamek odsajte a destičku vyklepněte na přířez buničité vaty. e. Napipetujte do všech jamek po 100 μl ředěné směsi IgG 1 a IgG 2. Inkubujte 60 minut (+/- 5 min.) při teplotě +37 C. f. Tekutinu z jamek odsajte a promyjte je 5x 250 μl promývacího roztoku. Odsajte a vyklepněte. g. Napipetujte do všech jamek po 100 μl ředěné protilátky anti-igg-biot. Inkubujte 60 minut (+/-5 min.) při teplotě +37 C. h. Tekutinu z jamek odsajte a promyjte je 5x 250 μl promývacího roztoku. Odsajte a vyklepněte. i. Napipetujte do všech jamek po 100 μl ředěného Str-AP. Inkubujte 30 minut (+/-2 min.) při teplotě +37 C. j. Tekutinu z jamek odsajte a promyjte je 5x 250 μl promývacího roztoku. Odsajte a vyklepněte. k. Napipetujte do všech jamek po 100 μl 4-nitrofenyl fosfátového roztoku (4-NPP). Inkubujte 60 minut (+/-5 min.) při laboratorní teplotě. Překryjte stripy alobalem, neprůhledným víčkem, nebo je po dobu inkubace uložte na temné místo. l. Intenzitu barevné reakce změřte na spektrofotometru/kolorimetru při 405 nm nejpozději do 5 minut. Obr. 1 Schéma aplikace vzorků: Strip č. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A DIL DIL M2 M2 B ST A ST A M3 M3 C ST B ST B M4 M4 D ST C ST C M5 M5 E ST D ST D M6 M6 F ST E ST E M7 M7 G ST F ST F H M1 M1 3
8. HODNOCENÍ TESTU: Stanovte koncentraci NF-L pro jednotlivé testované vzorky mozkomíšních moků: 1. Nejdříve odečtěte absorbanci (OD) jamek v sudých stripech (č. 2, 4, 6, 8, 10 a 12) od absorbancí v lichých stripech (č. 1, 3, 5, 7, 9 a 11) např. jamka 1A 2A, jamka 1B 2B apod. 2. Od hodnot absorbancí získaných v bodě 1. odečtěte absorbanci (OD) jamky se samotným ředicím roztokem (DIL = pozadí reakce) 3. Sestrojte kalibrační křivku tak, že na osu x vyneste koncentrace Standardů (uvedeny v Tab. 1 bod 6. Příprava reagencií, Standardů a vzorků). Na osu y vyneste jejich absorbance (OD). 4. Z rovnice kalibrační křivky vypočítejte koncentraci NF-L ve vzorcích mozkomíšních moků tak, že místo hodnoty y dosaďte hodnotu OD testovaného moku. Hodnoty x pak představují koncentraci NF-L v testovaném moku. Při výpočtu koncentrací je zapotřebí brát v úvahu i ředění vzorků mozkomíšních moků 1:1, tzn. výslednou (vypočtenou) koncentraci musíte násobit 2x. 9. CHARAKTERISTIKY TESTU: 9.1 Platnost testu Hodnota absorbance (OD) Standardu F by měla být > 1,500. Hodnota absorbance (OD) Standardu A by měla být < 0,200. Hodnoty absorbancí NF-L Standardů by měly být: ST A < ST B < ST C < ST D < ST E < ST F 9.2. Přesnost testu Pro stanovení variability mezi jednotlivými testy - reprodukovatelnost (interassay) a během testu - opakovatelnost (intraassay) bylo provedeno srovnání vzorků s různými hodnotami OD. Variabilita (intraassay) (n = počet opakování na stejné mikrotitrační destičce): n OD ±δ min max CV repro. 16 0,938 0,077 0,806 1,075 8,2% 16 0,576 0,047 0,49 0,653 8,2% Reprodukovatelnost (interassay) (n = počet nezávislých testů pro stejný vzorek): n OD ±δ min max CV repro. 8 0,324 0,017 0,299 0,347 5,4% 8 0,397 0,034 0,346 0,444 8,6% 8 0,688 0,026 0,655 0,731 3,8% 10. BEZPEČNOSTNÍ PŘEDPISY: Všechny složky soupravy jsou určeny pouze pro laboratorní účely. S testovanými lidskými mozkomíšními moky, s IgG 1, IgG 2 a anti-igg-biot nakládejte jako s infekčním materiálem a předměty, které s nimi přišly do styku, autoklávujte 1 hodinu při 121 C, nebo dezinfikujte minimálně 30 minut 3% roztokem chloraminu. Při práci nejezte, nepijte a nekuřte. Nepipetujte ústy, ale vhodnými pipetovacími zařízeními. Používejte ochranné rukavice a po práci si důkladně umyjte ruce. Dbejte, aby nedošlo k rozlití vzorků a k tvorbě aerosolu. 4
11. UPOZORNĚNÍ: a. Pracujte asepticky, aby nedošlo k mikrobiální kontaminaci moků a reagencií. b. Při odebírání, ředění a skladování reagencií postupujte tak, aby nedošlo k jejich vzájemné kontaminaci či kontaminaci látkami inhibujícími enzymatickou aktivitu. c. Dodržujte přesně pokyny uvedené v návodu. Nereprodukovatelné výsledky mohou vzniknout zejména: * nedostatečným promícháním reagencií a vzorků před použitím * nepřesným pipetováním a nedodržováním času inkubací uvedených v bodě 6. * špatnou technikou promývání a potřísněním okrajů jamek vzorky nebo reagenciemi * použitím stejné špičky při pipetování různých reagencií nebo záměnou uzávěrů 12. SKLADOVÁNÍ A EXPIRACE: Soupravu a její složky skladujte při teplotě +2 až +10 C. Za těchto podmínek je expirační doba celé soupravy uvedena na centrálním štítku na obalu soupravy, exspirace jednotlivých složek je uvedena na jejich obalu. Chraňte před mrazem. Nespotřebované stripy vložte zpět do obalu a zatavte, nebo dobře uzavřete do sáčku se zipem společně s desikantem. Soupravy se přepravují chlazené v termotaškách, doba přepravy do 72 hodin nemá na exspiraci vliv. Jestliže po obdržení soupravy zjistíte vážné poškození obalu jakékoliv složky soupravy, ihned informujte výrobce. Naředěné testované moků, naředěné Standardy a protilátky IgG 1, IgG 2, anti-igg-biot a Str- AP v pracovní koncentraci nelze skladovat. Připravujte je vždy čerstvé. Naředěný promývací roztok lze skladovat 1 týden při teplotě +2 až +10 C. Doporučená literatura: W.J.A. Van Geel, L.E. Rosengren, M.M. Verbeek: An enzyme immunoassay to quantify neurofilament light chain in cerebrospinal fluid, Journal of Immunological Methods 296 (2005), 179-185. 5
13. TESTOVACÍ SCHÉMA: Krok 1. Připravte reagencie a testované vzorky v pracovním ředění Krok 2. 3x promyjte (250 μl/ jamku), vyklepněte Aplikujte 100 μl/ jamku Standardů a testovaných vzorků Inkubujte 2 hod při +37 C Krok 3. 5x promyjte (250 μl/ jamku), vyklepněte Aplikujte 100 μl/ jamku směsi IgG 1/IgG 2 Inkubujte 60 min při +37 C Krok 4. 5x promyjte (250 μl/ jamku), vyklepněte Aplikujte 100 μl/ jamku anti-igg-biot Inkubujte 60 min při +37 C Krok 5. 5x promyjte (250 μl/ jamku), vyklepněte Aplikujte 100 μl/ jamku Str-AP Inkubujte 30 min při +37 C Krok 6. 5x promyjte (250 μl/ jamku), vyklepněte Aplikujte 100 μl/ jamku 4-nitrofenyl fosfátového roztoku Inkubujte 60 min při laboratorní teplotě Krok 7. Změřte absorbanci při 405 nm do 5 minut Datum poslední verze tohoto návodu: 03/2014 6