DH001 Hycult Dx Human MBL SOUPRAVA ELISA INFORMACE O VÝROBKU A MANUÁL Přečtěte si pečlivě před zahájením postupů! 96 testů www.hycultbiotech.com Edice 06-12 info@hycultbiotech.com
Upozorňujeme, že tento uživatelský protokol není specifický pro určitou šarži a představuje aktuální specifikace pro tento výrobek. Ohledně informací o specifických šaržích si prostudujte etiketu lahvičky a osvědčení o kontrole jakosti. Upozorňujeme rovněž, že se podmínky odeslání a podmínky uchovávání mohou lišit. Při používání tohoto výrobku uživatel odpovídá za dodržení všech místních/státních a federálních předpisů. Společnost Hycult Biotech neodpovídá za jakékoli porušení patentů, které by mohlo plynout z používání nebo původu tohoto výrobku.
OBSAH Strana 1. ÚČEL POUŽITÍ...2 2. ÚVOD...2 3. PARAMETRY SOUPRAVY...2 4. PŘEHLEDNÉ SCHÉMA PROTOKOLU...3 5. KOMPONENTY SOUPRAVY A POKYNY PRO UCHOVÁVÁNÍ...4 Materiály požadovány, ale neposkytnuty 4 6. VAROVÁNÍ A BEZPEČNOSTNÍ OPATŘENÍ...5 7. PŘÍPRAVA VZORKŮ...6 Odběr, manipulace a uchovávání 6 Postupy ředění 6 8. PŘÍPRAVA REAGENCIÍ...7 9. PROTOKOL ELISA...9 10. INTERPRETACE VÝSLEDKŮ... 10 11. TECHNICKÉ TIPY... 10 12. KONTROLA JAKOSTI... 11 13. VÝKONNOSTNÍ CHARAKTERISTIKY... 11 14. ODSTRAŇOVÁNÍ PROBLÉMŮ... 13 15. ODPOVĚDNOST... 13 16. LITERATURA... 14 17. SYMBOLY... 14 Edice 07-12 1 z 14 Manuál DH001
1. ÚČEL POUŽITÍ Souprava Hycult Dx human MBL ELISA je určena ke kvantitativnímu in vitro stanovení lidského MBL ve vzorcích séra a plazmy. Výsledky této soupravy jsou určeny k použití v kombinaci s dalším laboratorním a klinickým nálezem za účelem poskytování informací o patologickém stavu. Analýzu by měl být provést vyškolený laboratorní personál. 2. ÚVOD Lektin vázající manózu (MBL) je lektin typu C a důležitý prvek vrozené imunity. MBL patří do kolektinové rodiny bílkovin sestávající z domény podobné kolagenu a domény rozpoznávání sacharidů (CRD). Díky tomu MBL na patogenech rozpoznává sacharidy (např. manózu a N- acetylglukosamin). MBL tvoří několik velikostí oligomerů, které jsou složeny ze podjednotek tří identických polypeptidů 32 kda. MBL je receptor rozpoznávající vzory a po rozpoznání infekčního agens MBL spustí aktivaci lektin-komplementové cesty přes připojené serinové proteázy podobné C1r/C1s, označené MASP. Komplex MBL-MASP proteolyticky štěpí C4, C2 a C3. Cesta lektinu je nezávislá na protilátce a C1q, tedy nezávislá na klasické a alternativní cestě aktivace komplementu. MBL je syntetizován hepatocyty a byl izolován z jater nebo séra několika druhů obratlovců. Normální lidská plazma obsahuje koncentrace MBL v rozmezí od 10 do 5000 ng/ml. Až u 12 % zdravých kavkazských dárců krve je koncentrace MBL nižší než 100 ng/ml. Nízké plazmatické koncentrace jsou spojovány s dědičnou vadou opzonizace. Při infekčních onemocněních je koncentrace MBL zvýšena. Měření MBL je indikováno při opakovaných infekcích (především u dětí), primárních/sekundárních imunodeficiencích, arterioskleróze/ischemické chorobě srdeční, cystické fibróze, transplantaci, autoimunitních onemocněních (SLE/revmatoidní artritida) a při habituálním potratu. Měření MBL není ovlivněno přítomností protilátek proti mananu. Při analýze (stanovení) lidského MBL byl eliminován jakýkoli vliv klasické cesty použitím speciálního vazebného pufru MBL, který inhibuje vazbu C1q na imunokomplexy a narušuje komplex C1, přičemž zachovává funkci komplexu MBL neporušenou. 3. PARAMETRY SOUPRAVY Doba zpracování 4 hodiny. Minimální měřitelná koncentrace 0,41 ng/ml. Rozsah měřitelné koncentrace 0,41 až 100 ng/ml. Pracovní objem 100 µl na jamku. Manuál DH001 2 z 14 Edice 07-12
4. PŘEHLEDNÉ SCHÉMA PROTOKOLU potažená mananem Aktivace destičky 150 µl 30 min 37 o C Promytí 4x Zředěný standard, vzorky, kontroly 100 µl 60 min 37 o C Promytí 4x Indikátor protilátek s navázaným biotinylem 100 µl Promytí 4x 60 min 20-25 o C Streptavidin-peroxidáza konjugát 100 µl Promytí 4x 60 min 20-25 o C 100 µl 30 min 20-25 o C 100 µl Měření při 450 nm a 20-25 C Hycult Dx human MBL ELISA je ligand-lektinová enzymová imunoanalýza na pevné fázi připravená k použití, s dobou zpracování 4 hodiny. Účinný formát 1 destičky s dvanácti jednorázovými 8 jamkovými stripy umožňuje výběr velikosti dávky pro danou analýzu. Vzorky, standardy a kontroly se inkubují v mikrotitračních jamkách potažených mananem. Během této inkubace se vlastnost funkčního lidského MBL vázat manan používá k zachycení lidského MBL pevně navázaným mananem. Do jamek se přidá indikátor protilátek proti lidskému MBL s navázaným biotinylem. Pokud je přítomen ve vzorku funkční lidský MBL vázající manan, na lidský MBL s navázaným mananem se navážou protilátky indikátoru. Streptavidin-peroxidáza se naváže na protilátku indikátoru s navázaným biotinylem. Streptavidin-peroxidáza bude reagovat se substrátem, tetrametylbenzidinem (TMB). Enzymatická reakce se zastaví přidáním kyseliny šťavelové. Spektrofotometrem se změří absorbance při vlnové délce 450 nm. Získá se standardní křivka vynesením absorbance (lineární) vůči odpovídajícím koncentracím lidských standardů MBL (log). Ze standardní křivky lze určit koncentraci lidského MBL vzorků a kontrol analyzovaných společně se standardy. Edice 07-12 3 z 14 Manuál DH001
5. KOMPONENTY SOUPRAVY A POKYNY PRO UCHOVÁVÁNÍ Položka č. Komponenta soupravy Množství Barva kódu víčka Lahvička 1 1 lahvička (6 ml) Šedá Lahvička 2 1 lahvička (20 ml) Šedá Lahvička 3 2 lahvičky (20 ml) Zlatá Lahvička 4 1 lahvička (10 ml) Zlatá Lahvička 5 1 lahvička, 0,5 ml, lyofilizovaný Žlutá Lahvička 6 1 lahvička, 0,1 ml, lyofilizovaný Purpurová Lahvička 7 1 lahvička, 0,1 ml, lyofilizovaný Červená Lahvička 8 1 lahvička, 1 ml, lyofilizovaný Zelená Lahvička 9 1 lahvička, 1 ml, lyofilizovaný Modrá Lahvička 10 1 lahvička (11 ml) Hnědá Lahvička 11 1 lahvička (20 ml) Červená Položka 12 Položka 13 Osvědčení o kontrole jakosti 1 Položka 14 Manuál 1 Položka 15 Formulář sběru dat 2 1 desička Tabulka 1 Po obdržení uchovávejte jednotlivé komponenty při teplotě 2-8 C chráněné před mrazem. Komponenty nepoužívejte po uplynutí doby použitelnosti vytištěné na štítku soupravy. Po rekonstituci jsou, a stabilní 12 hodin, pokud se uchovávají při teplotě 2 8 C. Pro delší stabilitu doporučujeme uchovávat alikvoty při teplotě -20 C. Pokud se standardy a kontroly uchovávají při teplotě -20 C, budou stabilní jeden měsíc. Přesná koncentrace standardu je uvedena na štítku lahvičky a na osvědčení o kontrole jakosti. Po rekonstituci jsou a stabilní 1 měsíc, pokud se uchovávají při teplotě 2-8 C. Po obdržení musí být ochranný sáček komponenty vakuově utěsněný a neporušený. Jakékoli odchylky od výše uvedených podmínek mohou ovlivnit účinnost destičky při analýze. Jakékoli odchylky od výše uvedených podmínek mohou ovlivnit účinnost destičky při analýze. Nepoužité stipy okamžitě vraťte do ochranného sáčku s vloženým desikantem a obal po celém okraji těsně uzavřete. Jakost zaručena až 1 měsíc, pokud se uchovávají při teplotě 2-8 C. Materiály požadovány, ale neposkytnuty Kalibrované mikropipety a jednorázové špičky. Destilovaná nebo deionizovaná voda. Polypropylénové zkumavky. Kalibrovaná čtečka destiček ELISA schopná měřit absorbanci při vlnové délce 450 nm. Odstředivka pro odběr vzorků a manipulaci. Inkubátor pro teplotu 37 C. Adhezivní krycí fólie lze objednat zvlášť. Obraťte se na místního distributora. Manuál DH001 4 z 14 Edice 07-12
6. VAROVÁNÍ A BEZPEČNOSTNÍ OPATŘENÍ Tuto soupravu smí používat pouze kvalifikovaný laboratorní personál. V žádném případě nepřidávejte azid sodný jako konzervační prostředek pro jakoukoli komponentu. Komponenty soupravy nepoužívejte po datu expirace. Nezaměňujte reagencie z různých souprav a šarží. Reagencie byly standardizovány jako celek pro danou šarži. Používejte pouze reagencie dodávané výrobcem. Analýza byla optimalizována pro uvedený rozsah standardu. Neměňte rozsah standardu., a lahvičky by po rekonstituci měly být otevřeny. Lahvičky otevírejte opatrně: v lahvičkách je podtlak. Nepožívejte žádnou komponentu soupravy. Jako konzervační prostředek se v reagenciích soupravy používá 2-chloroacetamid. 2- chloroacetamid je zdraví škodlivý při styku s kůží a toxický při požití. V případě nehody či nevolnosti okamžitě vyhledejte lékařskou pomoc. bezbarvý. je citlivý na světlo, chraňte před ostrým světlem. Až do použití musí být roztok obsahuje 2 % kyselinu šťavelovou a může způsobit podráždění či poleptání dýchacích cest, kůže a očí. Přímému kontaktu s kůží a očima je třeba se důsledně vyhnout. Jestliže ke kontaktu dojde, postižené místo okamžitě opláchněte vodou a vyhledejte lékařskou pomoc. Nedodržení předepsané inkubační doby, inkubační teploty nebo objemů pipetování může vést k chybným výsledkům. Mikrotitrační jamky nepoužívejte opakovaně a připravené reagencie nevracejte zpět do lahviček. Se všemi biologickými vzorky zacházejte jako s potencionálně nebezpečnými, schopnými přenášet nemoci. Hemolyzované, hyperlipemické, tepelně ošetřené nebo kontaminované vzorky mohou vést k chybným výsledkům. Pro přípravu standardu a vzorků používejte polypropylenové zkumavky. Nepoužívejte polystyrénové zkumavky nebo destičky na vzorky. Standard je lidského původu. Byl testován na různé viry a shledán negativní. Protože žádná testovací metoda nemůže poskytnout úplnou jistotu absence infekčních agens, zacházejte s touto reagencií jako s jakýmkoli potenciálně infekčním lidským sérem nebo krevním vzorkem. Se všemi materiály přicházejícími do styku s touto reagencií zacházejte v souladu s předpisy pro prevenci přenosu infekcí přenášených krví. Edice 07-12 5 z 14 Manuál DH001
7. PŘÍPRAVA VZORKŮ Odběr, manipulace a uchovávání Sérum nebo plazma Odběr krve proveďte použitím běžných aseptických technik. Krevní vzorky se musí uchovávat na ledu.pokud se používá sérum, sérum oddělte od krve po sražení při pokojové teplotě do 1 hodiny odstředěním (1500xg při teplotě 4 C po dobu 15 minut). Sérum přeneste do čisté polypropylénové zkumavky. Pokud se používá plazma, plazmu oddělte od krve do 20 minut po odběru krve odstředěním (1500xg při teplotě 4 C po dobu 15 minut). Plazmu přeneste do čisté polypropylénové zkumavky. Nejspolehlivějších výsledků je dosaženo při použití heparinu nebo citrátové plazmy. EDTA plazma se nedoporučuje. Uchovávání Vzorky uchovávejte v polypropylénových zkumavkách při teplotě nižší než -20 C, nejlépe při teplotě -70 C. Uchovávání při teplotě -20 C může ovlivnit výtěžnost lidského MBL. Vzorky použijte do 24 hodin po rozmrazení. Vyhněte se více cyklům zmrazení-rozmrazení, které mohou způsobit ztrátu aktivity lidského MBL a vést k chybným výsledkům. Nepoužívejte hemolyzované, hyperlipemické, tepelně ošetřené nebo kontaminované vzorky. Před provedením analýzy je nutno vzorky ohřát na pokojovou teplotu (20-25 C) a opatrně promíchat. Před zahájením postupu analýzy si připravte všechny vzorky (kontroly a zkušební vzorky). Zamezte tvorbě pěny. Postupy ředění Vzorky séra nebo plazmy Lidský MBL lze přesně měřit, jestliže se vzorky séra nebo plazmy naředí alespoň 50x v 100x dodaným v polypropylenových zkumavkách. Nejspolehlivějších výsledků je dosaženo při použití heparinu nebo citrátové plazmy. EDTA plazma se nedoporučuje. Komentář týkající se doporučeného ředění vzorků Doporučené ředění vzorků by se mělo použít jako určité vodítko. Výtěžnost lidského MBL z neředěného vzorku není 100 % a může se u jednotlivých vzorků lišit. Při testování méně naředěných vzorků je vhodné provést experimenty výtěžnosti pro určení vlivu matrice na detekci lidského MBL. Na přípravu nebo ředění vzorků nepoužívejte polystyrénové zkumavky nebo destičky na vzorky. Manuál DH001 6 z 14 Edice 07-12
8. PŘÍPRAVA REAGENCIÍ Všechny reagencie by měly být před použitím vytemperovány na pokojovou teplotu (20-25 C). Ihned po použití vraťte do prostředí se správnými podmínkami pro uchovávání. Pufr pro aktivaci destiček Připravte pufr pro aktivaci destiček smícháním 3 ml produktu s 12 ml destilované nebo deionizované vody, který lze použít pro 1 x 96 testů. Pokud je požadován menší objem, připravte požadovaný objem promývacího roztoku zředěním 1 dílu se 4 díly destilované nebo de-ionizované vody. Promývací pufr Připravte promývací pufr smícháním 10 ml s 390 ml destilované nebo deionizované vody, který lze použít pro 1 x 96 testů. Pokud je požadován menší objem, připravte požadovaný objem promývacího roztoku zředěním 1 dílu se 39 díly destilované nebo de-ionizované vody. Ředicí pufr Připravte ředicí pufr smícháním 5 ml se 45 ml destilované nebo deionizované vody, který lze použít pro 1 x 96 testů. Pokud je požadován menší objem, připravte požadovaný objem ředicího pufru zředěním 1 dílu s 9 díly destilované nebo deionizované vody. může obsahovat krystalky. Pokud krystalky nezmizí při pokojové teplotě do 1 hodiny, lze koncentrovaný ředicí pufr zahřát na teplotu 37 C. S roztokem netřepejte. Roztok se standardem Standard se rekonstitutuováno napipetováním 0.5 ml destilované nebo de-ionizované vody. Každý lidský MBL standard připravte v polypropylenových zkumavkách sériovým zředěním standardu a, jak je uvedeno v tabulce 2*. Edice 07-12 7 z 14 Manuál DH001
Tabulka 2 ** CoA: osvědčení o kontrole jakosti, St: Standard, SOLN MBL BIND: Pozitivní kontrola a negativní kontrola a se rekonstitutuováno napipetováním 1 ml do lahvičky. Po rekonstituci jsou a připraveny k použití. Indikační roztok ise rekonstituuje napipetováním 1 ml destilované nebo de-ionizované vody. Zřeďte rekonstituovaný objem 1 ml s 11 ml ředicího pufru, který lze použít pro 1 x 96 testů. Pokud je požadován menší objem, připravte požadovaný objem indikátoru zředěním 1 dílu rekonstituovaného produktu s 11 díly ředicího pufru. Roztok streptavidin-peroxidázy se rekonstituuje napipetováním 1 ml destilované nebo de-ionizované vody. Zřeďte objem 0,5 ml rekonstituovaného produktu s 11,5 ml ředicího pufru, který lze použít pro 1 x 96 testů. Pokud je požadován menší objem, připravte požadovaný objem roztoku streptavidin-peroxidázy zředěním 1 dílu rekonstituovaného produktu se 23 díly ředicího pufru. Manuál DH001 8 z 14 Edice 07-12
9. PROTOKOL ELISA Před použitím nechte všechny reagencie vytemperovat na pokojovou teplotu (20-25 C). 1. Určete počet požadovaných testovacích jamek, vložte potřebné mikrojamkové stripy do dodaného rámečku a vyplňte formulář sběru dat. Nepoužité stripy vraťte do sáčku s desikantem, utěsněte a uchovávejte při teplotě 2-8 C. 2. Přeneste 150 µl zředěného pufru pro aktivaci destiček do přidělených jamek. Nedotýkejte se boční nebo horní části jamek. 3. Podnos přikryjte. Jemným poklepáním na podnos odstraňte případné vzduchové bubliny uvízlé v jamkách. Buďte opatrní, abyste nepostříkali krycí fólii tekutinou. 4. Inkubujte podnos po dobu 30 minut při teplotě 37 C. 5. Destičky 4 krát manuálně propláchněte promývacím pufrem jak následuje 1) : a. Opatrně odstraňte, přičemž zamezte rozlití. b. Vyprázdněte obsah destičky otočením desky a poklepáním obsahu nad dřezem, podržte destičku převrácenou a dosucha vyklepejte na silnou vrstvu savého papíru. c. Do každé jamky přidejte 200 µl promývacího pufru, počkejte 20 sekund a vyprázdněte obsah destičky, jak je popsáno v bodě 5b. d. Proces promývaní 5b/5c opakujte třikrát. e. Vyprázdněte obsah destičky a opatrrně vyklepejte na silnou vrstvu savého papíru. 6. Do příslušných jamek přeneste dvojmo 100 µl standardu, vzorků a kontrol 7. Podnos přikryjte. Jemným poklepáním na podnos odstraňte případné vzduchové bubliny. Buďte opatrní, abyste nepostříkali krycí fólii tekutinou. 8. Inkubujte destičku po dobu 1 hodiny při teplotě 37 C. 9. Opakujte postup promývání popsaný v kroku 5. 10. Do každé jamky přidejte 100 µl naředěného indikátoru použitím stejného pořadí pipetování, jaký se použil v kroku 6. Nedotýkejte se boční nebo horní části jamek. 11. Podnos přikryjte a inkubujte po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě. 12. Opakujte postup promývání popsaný v kroku 5. 13. Do každé jamky přidejte 100 µl naředěného substrátu streptavidin-peroxidázy použitím stejného pořadí pipetování, jaký se použil v kroku 6. Nedotýkejte se boční nebo horní části jamek. 14. Podnos přikryjte a inkubujte po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě. 15. Opakujte postup promývání popsaný v kroku 5. 16. Do každé jamky přidejte 100 µl roztoku použitím stejného pořadí pipetování, jaký se použil v kroku 6. Nedotýkejte se boční nebo horní části jamek. 17. Podnos přikryjte a inkubujte po dobu 30 minut při pokojové teplotě. Mikrojamkové stripy nevystavujte přímému slunečnímu světlu. Doporučuje se přikrýt destičku hliníkovou fólií. 18. Zastavte reakci přidáním 100 µl ve stejném pořadí a načasování, jak je použito v kroku 16. Jemným poklepáním na podnos promíchejte roztok a odstraňte vzduchové bubliny uvízlé v jamkách. 19. Pomocí čtečky destičky odečtěte destičku do 30 minut po přidání zastavovacího roztoku při vlnové délce 450 nm při pokojové teplotě, přičemž postupujte podle pokynů výrobce zařízení. 1) V případě, že používáte promývačku destiček: použití promývačky destiček může vést k vyšším hodnotám pozadí a poklesu citlivosti. Doporučujeme ověřit promývačku destiček manuální metodou. Doporučujeme ověřit, zda se promývačka destiček používá tak, jak je stanoveno pro manuální metodu. Další promývací pufr lze objednat zvlášť. Obraťte se na místního distributora. Edice 07-12 9 z 14 Manuál DH001
10. INTERPRETACE VÝSLEDKŮ Vypočtěte střední absorbanci pro každý soubor duplicitních standardů, kontrol a vzorků. V případě, že se duplicitní hodnoty absorbancí u jednotlivého vzorku, standardu nebo kontroly liší o více než 15% od odpovídající střední hodnoty, výsledek je považován za podezřelý a vzorek by se měl znovu testovat. Střední absorbance nulového standardu musí být menší než 0,3. Pomocí počítačového softwaru schopného vytvářet prokládané křivky vytvořte kalibrační křivku. Střední absorbance pro každou koncentraci standardu je vynesena na vertikální ose (Y) proti odpovídající koncentraci na horizontální ose (X) (logaritmické měřítko). Pokud byly vzorky zředěné, koncentrace odečtená ze standardní křivky se musí vynásobit faktorem ředění. Vzorky, které poskytují střední absorbanci přesahující absorbanci pro nejvyšší koncentraci standardu, jsou mimo rozsah stanovení. Tyto vzorky by měly být znovu testovány při vyšším zředění. 11. TECHNICKÉ TIPY Uživatel by měl být vyškolen a obeznámen s analýzou ELISA a postupem testu. Pokud uživatel není obeznámen s technikou ELISA, doporučuje se, aby uživatel provedl zkušební analýzu před vyhodnocením vašich vzorků. Proveďte analýzu se standardní křivkou pouze podle pokynů. Nesprávné nebo nedostatečné promytí v jakékoli fázi postupu bude mít za následek buď falešně pozitivní nebo falešně negativní výsledky. Zcela prázdné jamky před nadávkováním promývacího pufru naplňte promývacím pufrem, jak je uvedeno pro každý cyklus, a jamky po delší dobu neponechávejte odkryté nebo suché. Vzhledem k tomu, že se přesné podmínky mohou u jednotlivých analýz lišit, standardní křivka musí být stanovena pro každou analýzu. Vzorky by se měly vztáhnout ke standardnímu rozsahu připravenému na stejné destičce. Nemíchejte reagencie z různých šarží nebo jiné reagencie či stripy navzájem. Nespotřebovaný materiál se nesmí míchat s obsahem nově otevřených lahviček. Při každém použití soupravy se musí připravit čerstvé zředění, vzorku,,,,,, a. Víčka a lahvičky nejsou vzájemně zaměnitelné. Víčka se musí vyměňovat na odpovídajících lahvičkách. Aby se zabránilo vzniku zkřížené kontaminace, pipetovací špičky vyměňujte před přidáváním reagencií každého standardu, před přidáváním vzorků a před přidáváním reagencií. Rovněž tak používejte samostatné nádobky (zásobníky) pro jednotlivé reagencie. Chcete-li zajistit přesné výsledky, je nutná správná přilnavost adhezivních krycích fólií během jednotlivých kroků inkubace. Likvidaci odpadů je nutno provádět v souladu s předpisy vaší laboratoře. Manuál DH001 10 z 14 Edice 07-12
Technická podpora S dotazy a na technickou podporu týkající se produktu Hycult Dx human MBL ELISA se obracejte náš tým technické podpory na adrese support@hycultbiotech.com. Hycult Biotech, P.O. Box 30, 5400 AA Uden, Nizozemí T: +31 (0)413 251 335, F: +31 (0)413 248 353 12. KONTROLA JAKOSTI Osvědčení o kontrole jakosti obsažené v této soupravě je specifické pro danou šarži a je určeno k ověření výsledků získaných vaší laboratoří. Hodnoty absorpce uvedené v osvědčení o kontrole jakosti slouží pouze jako určité Výsledky získané vaší laboratoří se mohou lišit. Tato analýza je určena k eliminaci intereference způsobené solubilními receptory, vazebnými proteiny a dalšími faktory přítomnými v biologických vzorcích. Jestliže v imunoanalýze Hycult Biotech nebyly všechny faktory testovány, možnost interference nelze vyloučit. Pro dosažení optimální účinnosti této soupravy je doporučeno dodržovat zásady správné laboratorní praxe. 13. VÝKONNOSTNÍ CHARAKTERISTIKY Přesnost a reprodukovatelnost Přesnost a reprodukovatelnost "intra-assay" (v rámci testu) byla stanovena na vzorcích třech různých známých koncentrací, v 6 replikátech, provedených 3 různými operátory. Přesnost a reprodukovatelnost "inter-assay" (mezi testy) byla stanovena na vzorcích třech různých známých koncentrací, analyzovaných dvojmo v 6 samostatných analýzách. Testy byly provedeny 3 různými operátory: jedna série analýz jedním operátorem ve 2 různých dnech. Parametr Akceptační mez CV CV aktuální šarže Intra-assay 20 % 12,7 % Inter-assay 25 % 15,2 % Tabulka 3 Linearita Linearita analýzy byla určena sériově, zředěním vzorku obsahujícího 250 ng/ml lidského MBL. V této analýze byly změřeny naředěné vzorky. Sklon přímky byl 1,124 a korelační koeficient 0,997. 8 0 Observed concentration (ng/ml) 6 0 4 0 2 0 0 0 20 40 60 80 Expected concentration (ng/m l) Naměřená koncentrace (ng/ml) Očekávaná koncentrace (ng/ml) Edice 07-12 11 z 14 Manuál DH001
Výtěžnost Normální vzorky lidské krve (plazma) obsahující bazální hladiny lidského MBL byly obohaceny lidským MBL o koncentraci 5 a 50 ng/ml. Vzorky s lidským MBL a bez lidského MBL byly inkubovány 1 hodinu při pokojové teplotě. Vzorky byly měřeny pomocí metody ELISA. Hodnoty lidského MBL se pohybovaly od 90,6 % do 101, 5% (průměr 93,9 %). Mez detekovatelnosti Minimální měřitelná koncentrace lidského MBL je 0,41 ng/ml. Minimální detekovatelná velikost lidského MBL byla stanovena přidáním tří standardních odchylek ke střední hodnotě optické hustoty 8 replikátů nulového standardu a z kalibrační křivky se vypočítala odpovídající koncentrace. Detekční rozsah Hycult Dx human MBL ELISA má rozsah měřitelné koncentrace od 0,41 do 100 ng/ml. Specificita/zkřížená reaktivita Hycult Dx human MBL ELISA byla vyvinuta pro kvantitativní měření přirozeného lidského MBL. V soupravě Hycult Dx human MBL ELISA nebyly detekovány žádné zkříženě reagující proteiny. Omezení Abnormální vysoké nebo nízké koncentrace lidského MBL nemusí nutně znamenat existenci nějaké nemoci. Hodnoty získané z této analýzy jsou pouze pomůckou pro stanovení diagnózy. Každý lékař musí interpretovat tyto výsledky ve světle anamnézy pacienta, fyzikálního nálezu a dalších diagnostických postupů. Při manipulaci s měřenými vzorky je nutno postupovat velice opatrně, protože imunoreaktivita lidského MBL je do značné míry ovlivněna podmínkami uchovávání. Vzorky by měly být zmrazeny co nejrychleji a rozmrazovat by se měly až těsně před testováním. Manuál DH001 12 z 14 Edice 07-12
14. ODSTRAŇOVÁNÍ PROBLÉMŮ Garanční nároky a reklamace v souvislosti s nedostatky musí být uplatněny před uplynutím data použitelnosti výrobku. Písemnou reklamaci obsahující číslo šarže produktu a experimentální údaje je možné odeslat na adresu support@hycultbiotech.com Doporučení shrnuty v tabulce č. 4 níže lze použít jako určité vodítko v případě neočekávaných výsledků analýzy. Nízká absorbance Vysoká absorbance Slabé duplikáty Všechny jamky pozitivní Všechny jamky negativní Možná příčina Materiály nebo reagencie soupravy jsou kontaminovány nebo prošlé Byly použity nesprávné reagencie Lyofilizované reagencie nejsou řádně rekonstituovány Nesprávné ředění nebo chyby při pipetování Na přípravu standardu a/nebo vzorků byly použity nevhodné plastové materiály Nesprávné inkubační doby nebo teplota Analýza provedena před tím, než reagencie dosáhly pokojové teploty Postup nebyl správně dodržen Opomenutí reagencie nebo určitého kroku Nedostatečné míchání vzorků Nízká čistota vody Stripy byly ponechány příliš dlouho suché při nebo po promytí Nedostatečné promytí Zkřížená kontaminace od jiných vzorků nebo od pozitivní kontroly Roztok TMB není čirý nebo bezbarvý Špatný filtr ve čtečce mikrotitračních destiček Vzduchové bubliny Nedokonalé utěsnění destičky po použití Špatné podmínky pro uchovávání Lampa čtečky mikrodestiček nefunguje optimálně Tabulka 4 15. ODPOVĚDNOST Pro diagnostické použiti in vitro pouze v Evropě. Ve zbylé části světa pouze pro výzkumné účely. Tato souprava je určena pouze k in vitro stanovení lidského MBL v lidském séru nebo plazmě. Tato souprava je určena pouze pro použití kvalifikovaným personálem provádějícím výzkum či in vitro diagnostické aktivity. Pokud příjemce této soupravy předá soupravu jakýmkoli způsobem třetí osobě, musí být tento pokyn přiložen a příslušný příjemce na vlastní riziko zajistí ve prospěch společnosti Hycult Biotech všechna zde zmiňovaná omezení odpovědnosti. Společnost Hycult Biotech nenese odpovědnost za jakékoliv škody či ztráty způsobené použitím této soupravy jakýmkoli jiným způsobem, než jak je výslovně uvedeno v těchto pokynech. Odpovědnost společnosti Hycult Biotech v žádném případě nepřekročí tržní hodnotu soupravy. Společnost Hycult Biotech nenese za žádných okolností odpovědnost za nepřímé, zvláštní nebo následné škody, včetně, ale nikoli jen, ztráty zisku. Edice 07-12 13 z 14 Manuál DH001
16. LITERATURA 1. Kirkpatrick, B et al; Serum mannose-binding lectin deficiency is associated with cryptosporidiosis in young Haitian children. Clin Infect Dis 2006, 43: 289 2. Druszczynska, M et al; Tuberculosis bacilli still posing a threat. Polymorphism of genes regulating anti-mycobacterial properties of macrophages. Pol J Microbiol 2006, 55: 7 3. Wang, X et al; Mannose-binding lectin gene polymorphisms and the development of coal workers pneumoconiosis in Japan. Am J Ind Med 2008, 51: 548 4. Ribeiro, L et al; Serum mannose-binding lectin levels are linked with respiratory syncytial virus (RSV) disease. J clin immunol 2008, 28: 166 5. Koutsounaki, E et al; Mannose-binding lectin MBL2 gene polymorphisms and the outcome of hepatitis C virus-infected patients. J Clin Immunol 2008, 28: 495 17. SYMBOLY Symbol Vysvětlení European Conformity / CE-Konfirmitäts-kennzeichnung / Conforme aux normes européennes / CE prohlášení o shodě In vitro diagnostic medical device / In-vitro-Diagnostikum / Ussage Diagnostic in vitro / Diagnostický zdravotnický prostředek in-vitro Catalogue number / Katalog-Nr. / Référence / Katalogové číslo Lot. No. or Batch code / Chargen-Nr. / No. de lot / Č. nebo kód šarže Caution! / Vorsicht! / Attention! / Pozor! Consult instructions for use / Gebrauchsanweisung beachten / Consulter les instructions d utilisation / Viz návod k použití Storage Temperature teplota / Lagerungstemperatur / Temperature de conservation / Skladovací Expiration date / Verwendbar bis / Date limite d utilisation / Datum expirace Contains sufficient for <n> tests / Ausreichend für n Ansätze / Contenu suffisant pour n tests / Lze použít pro <n> testů Plate activation buffer concentrate (5x) / Platte aktivierungskonzentrat (5x) / Concentré de tampon pour activation de Plaque (5x) / Koncentrát pufru pro aktivaci (5x) Washing solution concentrate (40x) / Waschlösungskonzentrat (40x) / Concentré de tampon de lavage (40x) / Koncentrát promývacího roztoku (40x) MBL Binding buffer (1x) for samples and standard / Proben und standard MBL bindung verdünnungspuffer / MBL binding solution pour dilution de l échantillon et standard / Vazebný pufr MBL (1x) pro vzorky a standard Dilution Buffer concentrate (10x) / Verdünnungspuffer konzentrat (10x) / Concentré de tampon de dilution (10x) / Koncentrát ředicího pufru (10x) Standard Positive control / Positiv kontrolle / Contrôle positif / Pozitivní kontrola Negative control / Negativ kontrolle / Contrôle négatif / Negativní kontrola Tracer concentrate (12x), biotin / Tracerkonzentrat (12x), biotin / Traceur concentre (12x), biotine / Koncentrát indikátoru (12x), biotin Enzyme conjugate concentrate (24x) / Enzymekonjugat konzentrat (24x) / Concentré de conjugué enzymatique (24x) / Koncentrát enzymového konjugátu (24x) TMB substrate solution / TMB Substratlösung / Solution substrat TMB / Substrátový roztok TMB Stopping solution / Stoplösung / Solution d arrêt / Zastavovací roztok Microtiter plate (12 strips) / Mikrotiterplatte (12 Streifen) / Microplaques sensibilisèes (12 strips) Hycult Biotech P.O. Box 30 5400 AA Uden Tel: +31413251335 www.hycultbiotech.com info@hycultbiotech.com Tabulka 5 Manuál DH001 14 z 14 Edice 07-12