ELISA-VIDITEST anti-hsv 1+2 IgA

ELISA-VIDITEST anti-hsv 1+2 IgA OD-283 Návod k použití soupravy VÝROBCE: VIDIA spol. s r.o., Nad Safinou II č. 365, Vestec, 252 42 Jesenice, www.vidia.cz, tel.: +420 261 090 565 1. NÁZEV SOUPRAVY ELISA-VIDITEST anti-hsv 1+2 IgA - ELISA souprava pro stanovení IgA protilátek proti viru herpes simplex typu 1 a 2 (HSV 1+2) v lidském séru. 2. POUŽITÍ Souprava je určena pro diagnostiku chorob vyvolaných nebo spojených s HSV1 nebo HSV2, např. genitálního a labiálního herpesu, herpetické gingivostomatitidy, herpetické keratokonjunktivitidy. Soupravu lze též využít pro diferenciální diagnostiku očních infekcí a kožních exanthematických onemocnění. Neodlišuje typ HSV1 a HSV2. Doplňkovými testy pro sérologické vyšetření HSV 1+2 jsou detekce IgM protilátek proti HSV 1+2 (ELISA-VIDITEST anti-hsv 1+2 IgM), či detekce IgG protilátek, případně stanovení intrathekálních protilátek proti HSV 1+2 v mozkomíšním moku (ELISA-VIDITEST anti-hsv 1+2 IgG (CSF). 3. PRINCIP TESTU ELISA-VIDITEST anti-hsv 1+2 IgA je imunoanalytický test na pevné fázi. Na povrch jamek je navázán nativní antigen HSV 1+2 nesoucí imunodominantní epitopy HSV1 a HSV2. Jsou-li v testovaných sérech přítomny příslušné protilátky, navážou se na imobilizované antigeny. Navázané protilátky pak v dalším kroku reagují s protilátkami proti lidskému IgA značenými křenovou peroxidázou. Množství navázaných značených protilátek se stanoví barevnou enzymatickou reakcí. Intenzita zabarvení substrátu odpovídá množství protilátek v testovaném vzorku. Negativní séra nereagují, mírná změna v zabarvení jamek je pozadím reakce. 4. OBSAH SOUPRAVY ELISA odlamovací stripy v manipulačním rámečku potažené specifickým antigenem STRIPS Ag 1 x 12 ks 1,3 ml kalibrátoru r.t.u. 1) CAL 1 lahvička 1,3 ml negativního kontrolního séra r.t.u. CONTROL - 1 lahvička 13 ml protilátek proti lidskému IgA značených peroxidázou (konjugát anti-iga Px) r.t.u. CONJ 1 lahvička 125 ml promývacího roztoku 10x konc. WASH 10x 1 lahvička 100 ml ředicího roztoku r.t.u. DIL 1 lahvička 13 ml chromogensubstrátového roztoku TMB r.t.u. TMB-O 1 lahvička 13 ml stop roztoku r.t.u. STOP 1 lahvička Sáček se zipem Návod k použití soupravy Certifikát kontroly kvality 1) r.t.u., ready to use (v pracovní koncentraci) 1

Chromogensubstrátový roztok TMB-O r.t.u. je zaměnitelný pouze mezi soupravami ELISA-VIDITEST, které obsahují TMB-O, a NENÍ VZÁJEMNĚ ZAMĚNITELNÝ s ostatními roztoky TMB použitými v jiných soupravách ELISA-VIDITEST (TMB, TMB-BF). 5. POTŘEBNÝ MATERIÁL NEDODÁVANÝ SE SOUPRAVOU Destilovaná/deionizovaná voda pro ředění promývacího roztoku, pipetovací zařízení, zařízení pro rozplňování roztoků a promývání stripů, spektrofotometr/kolorimetr s filtrem 450 nm (doporučený referenční filtr 620-690 nm). 6. PŘÍPRAVA REAGENCIÍ a. Vytemperujte všechny složky soupravy na laboratorní teplotu. b. Těsně před vyšetřením důkladně zamíchejte vzorky vyšetřovaných sér a kontrolní séra. Testovaná séra řeďte ředicím roztokem 101x (např. 5 μl séra + 500 μl ředicího roztoku). Kontrolní séra neřeďte, jsou v pracovní koncentraci (r.t.u., ready to use). c. Připravte pracovní koncentraci promývacího roztoku jeho naředěním 10x ve vhodném objemu destilované/deionizované vody (např. 100 ml promývacího roztoku + 900 ml H 2 O). Pokud jsou v koncentrovaném roztoku krystaly soli, rozpusťte je zahřátím na vodní lázni při +32 až +37 o C a před naředěním dobře promíchejte. Nespotřebovaný promývací roztok v pracovní koncentraci lze skladovat 1 týden při teplotě +2 až +10 o C. d. Chromogensubstrátový roztok TMB-O, stop roztok a konjugát anti-iga Px neřeďte, jsou v pracovní koncentraci (r.t.u.). 7. PRACOVNÍ POSTUP a. Stripy, vakuově zatavené s desikantem, nechte před otevřením sáčku vytemperovat na laboratorní teplotu, aby nedošlo k orosení destičky. Připravte si potřebný počet stripů pro reakci. Nepoužité stripy společně s desikantem dobře uzavřete do sáčku se zipem nebo vakuově zatavte. b. Naplňte jamky po 100 μl kalibrátorem, negativním kontrolním sérem a ředěnými testovanými séry následujícím způsobem: První jamku naplňte samotným ředicím roztokem (DIL) pro stanovení pozadí reakce. Dvě jamky naplňte kalibrátorem (CAL) a jednu jamku negativním kontrolním sérem (CONTROL -). Zbývající jamky naplňte ředěnými testovanými séry (S1, S2, S3, ). Viz Schéma aplikace vzorků. Každé sérum stačí aplikovat na jednu jamku. Pokud chcete vyloučit případnou laboratorní chybu, aplikujte Kalibrátor na tři jamky, negativní kontrolní sérum a vyšetřovaná séra aplikujte po dvou jamkách. Inkubujte 60 minut (± 5 min.) při laboratorní teplotě. c. Odsajte obsah jamek do pojistné sběrné láhve obsahující vhodný dezinfekční prostředek (viz Bezpečnostní předpisy). Jamky poté 4x promyjte 250 μl promývacího roztoku. Vyvarujte se přetékání roztoku ven z jamek. Obsah jamek odsajte a destičku vyklepněte na přířez buničité vaty. d. Důkladně promíchejte lahvičku s konjugátem anti-iga Px r.t.u. (CONJ) a napipetujte do jamek po 100 μl konjugátu anti-iga Px r.t.u. (CONJ). Inkubujte 60 minut (± 5 min.) při laboratorní teplotě. e. Tekutinu z jamek odsajte a promyjte je 4x 250 μl promývacího roztoku. Odsajte a vyklepněte. f. Napipetujte do jamek po 100 μl chromogensubstrátového roztoku TMB-O. Inkubujte 10 minut (± 30 sec.) v temnu při laboratorní teplotě. Dobu inkubace začněte měřit po napipetování 1. stripu destičky. Dodržujte toto pravidlo, vyvarujete se tak nedodržení 2

časového intervalu. Pipetujte rychle v pravidelném rytmu, případně použijte vhodný dispenzor. Překryjte stripy alobalem, neprůhledným víčkem, nebo je po dobu reakce uložte na temné místo. g. Zastavte reakci přidáním 100 μl stop roztoku. Pipetujte ve stejném rytmu jako při rozplňování chromogensubstrátového roztoku TMB, aby enzymatická reakce probíhala ve všech jamkách po stejnou dobu. Zkontrolujte, zda nejsou v jamkách bubliny, pokud ano, jemným poklepem na rámeček destičky je odstraňte. h. Intenzitu barevné reakce změřte na spektrofotometru/kolorimetru při 450 nm nejpozději do 10 minut po zastavení reakce. Doporučujeme použít referenční filtr 620-690 nm. SCHÉMA APLIKACE VZORKŮ Kvalitativní a semikvantitativní hodnocení protilátek v séru 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 a DIL b CAL c CAL d CONTROL- e S1 f S2 g S3 h S4 S5 S 8. HODNOCENÍ TESTU Nejdříve odečtěte absorbanci jamky se samotným ředicím roztokem (DIL = pozadí reakce) od hodnot kontrolních a testovaných sér. 8.1. Kvalitativní orientační hodnocení 1. Spočítejte průměrnou hodnotu OD kalibrátru (CAL) ze dvou jamek. (Pokud aplikujete CAL na tři jamky a některá z těchto hodnot OD se liší o více než 20% od průměru, nepoužívejte ji k výpočtu a spočítejte průměr ze zbývajících dvou hodnot). 2. Stanovte cut-off hodnotu tak, že průměrnou hodnotu OD kalibrátru (CAL) vynásobíte korekčním faktorem. Hodnota korekčního faktoru (CAL) se určuje pro každou šarži soupravy a je uvedena v Certifikátu kontroly kvality dané šarže. 3. Séra s hodnotou OD < 90% cut-off jsou negativní a séra s hodnotou OD > 110% cut-off jsou považována za pozitivní. Séra s OD v rozmezí 90-110% cut-off jsou nejednoznačná, jejich testování je nutno opakovat, nebo vyšetřit další odběr od pacienta o 1-2 týdny později. 8.2. Semikvantitativní hodnocení Stanovte cut-off hodnotu jako v předešlém způsobu hodnocení (čl. 8.1, bod 2) 1. Stanovte hodnotu indexu pozitivity pro jednotlivé vzorky sér tak, že vydělíte OD testovaného séra cut-off hodnotou. 3

2. Odečtěte v tabulce (viz HODNOCENÍ VÝSLEDKŮ) odpovídající stupeň reaktivity séra. HODNOCENÍ VÝSLEDKŮ: Hodnota indexu Vyhodnocení < 0,90 Negativní 0,90-1,10 +/- 1,11-2,00 + 2,01-3,00 ++ > 3,00 +++ Pozn.: Hodnocení +/- znamená, že sérum leží v rozmezí šedé zóny. V případě tohoto výsledku test opakujte. Leží-li sérum po opakovaném testování opět v rozmezí šedé zóny, opakujte testování alternativní metodou, nebo použijte sérum odebrané od téhož jedince o 1-2 týdny později. Příklad: Získaná OD CAL = 1,063; 1,108; 1,156 Průměrná hodnota OD CAL = 1,109 Korekční faktor CAL = 0,31 Cut-off hodnota = 1,109 x 0,31 = 0,344 OD vzorku séra = 0,800 Hodnota indexu = 0,800 / 0,344 = 2,33 9. INTERPRETACE VÝSLEDKŮ IgA protilátky proti HSV jsou odezvou na aktivní infekci (primární infekci nebo reaktivaci, včetně asymptomatických forem). Proto mohou být přítomny i u některých zdravých séropozitivních jedinců. U sér od pacientů s polyklonální aktivací imunitního systému (infekční mononukleoza, toxoplasmoza, některá autoimunitní onemocnění) nelze vyloučit falešně pozitivní výsledky. Pro určení diagnózy je nutno výsledky testu interpretovat vždy v kontextu s klinickými příznaky a výsledky dalších laboratorních vyšetření. 10. CHARAKTERISTIKY TESTU 10.1. Platnost testu Hodnota OD Kalibrátoru (CAL) by měla být v rozmezí uvedeném v Certifikátu kontroly kvality dané šarže. Hodnoty absorbance kontrolních sér by měly být: CONTROL - < CAL Hodnota OD samotného ředicího roztoku (DIL = pozadí reakce) by měla být < 0,100. 10.2. Přesnost testu Pro stanovení variability mezi jednotlivými testy reprodukovatelnosti (interassay) a během testu opakovatelnosti (intraassay) bylo provedeno srovnání vzorků s různými hodnotami OD. 10.2.1. Opakovatelnost (intraassay) Variační koeficient opakovatelnosti je maximálně 5%. Je měřen pro každou šarži minimálně na 12 paralelních jamkách téže destičky. Příklad: (n = počet paralelních jamek na téže destičce) n A ±σ CV opak. 14 2,268 0,094 4,1 % 4

10.2.2. Reprodukovatelnost (interassay) Variační koeficient reprodukovatelnosti je maximálně 15%. Je měřen pro každou šarži porovnáním jamek téhož séra v několika po sobě jdoucích testech. Příklad: (n = počet testů určitého vzorku) n A ±σ min max CVrepro 10 0,674 0,090 0,567-0,779 13,4% 9 0,832 0,061 0,729-0,927 7,3% 7 1,116 0,069 1,048-1,221 6,2% 10.3. Diagnostická citlivost a specifita testu Stanovení diagnostické citlivosti a specifity testu bylo provedeno v rámci studie diagnostické účinnosti soupravy. Výsledky testu byly porovnány s výsledky získanými na dvou nezávislých komerčních soupravách určených pro IVD. panel sér celkový počet pozitivní hraniční negativní hodnocení pozitivní 59 49 8 2 citlivost: 96,1% * negativní 69 1 2 66 specifita: 98,4% * * Hraniční výsledky nebyly brány při hodnocení v potaz. Test poskytl pozitivní výsledek u 11/56 (20%) vzorků od zdravých dospělých dárců. Ve srovnávacích testech bylo 7 z nich rovněž pozitivních, 3 hraniční a jeden negativní. 10.4. Interference Hemolytické a lipemické vzorky nevykazují žádný vliv na výsledek testu minimálně do 50 mg/ml pro hemoglobin, 5 mg/ml pro bilirubin a 50 mg/ml pro triglyceridy. 11. BEZPEČNOSTNÍ PŘEDPISY Všechny složky soupravy jsou určeny pouze pro laboratorní účely. Lidská séra použitá v soupravě byla testována na nepřítomnost HBsAg, HCV a protilátek anti-hiv-1,2. Přesto s nimi nakládejte jako s infekčním materiálem a předměty, které s nimi přišly do styku, autoklávujte 1 hodinu při 121 C nebo dezinfikujte minimálně 30 minut 3% roztokem chloraminu. Odpad vzniklý při promývání stripů dezinfikujte v odpadní nádobě pomocí vhodného dezinfekčního roztoku (např. Incidur, Incidin, chloramin,...) v koncentraci doporučené výrobcem. Tekuté odpady obsahující stop roztok (roztok kyseliny sírové) před likvidací neutralizujte 4% roztokem hydrogenuhličitanu sodného. Se stop roztokem pracujte opatrně, aby nedošlo k potřísnění kůže nebo sliznice. Stane-li se tak, omyjte postižené místo větším množstvím tekoucí vody. Při práci nejezte, nepijte a nekuřte. Nepipetujte ústy, ale vhodnými pipetovacími zařízeními. Používejte ochranné rukavice a po práci si důkladně umyjte ruce. Dbejte, aby nedošlo k rozlití vzorků a k tvorbě aerosolu. 5

12. UPOZORNĚNÍ a. Výrobce zaručuje použitelnost soupravy jako celku. b. Promývací roztok, chromogensubstrátový roztok TMB-O r.t.u., stop roztok r.t.u. a ředicí roztok r.t.u. pro séra jsou vzájemně zaměnitelné mezi jednotlivými soupravami ELISA- VIDITEST, pokud není v návodu k použití soupravy uvedeno jinak. c. Pracujte asepticky, aby nedošlo k mikrobiální kontaminaci sér a reagencií. d. Při odebírání, ředění a skladování reagencií postupujte tak, aby nedošlo k jejich vzájemné kontaminaci či kontaminaci látkami inhibujícími enzymatickou aktivitu. e. Kontrolní séra, ředicí roztok a konjugát anti-iga Px jsou konzervovány ProClinem 300. f. Chromogensubstrátový roztok TMB-O nesmí přijít do styku s oxidačními látkami a kovovými povrchy. g. Dodržujte přesně pokyny uvedené v návodu. Nereprodukovatelné výsledky mohou vzniknout zejména: * nedostatečným promícháním reagencií a vzorků před použitím * nepřesným pipetováním a nedodržováním času inkubací uvedených v kapitole 7. * špatnou technikou promývání a potřísněním okrajů jamek vzorky nebo konjugátem * použitím stejné špičky při pipetování různých roztoků nebo záměnou uzávěrů * kontaminací pipety, používané pro aplikaci vzorků, kontrol nebo chromogensubstrátového roztoku, Px konjugátem (doporučujeme pro aplikaci konjugátu používat pipetu, vyhrazenou pouze pro tyto účely) 13. SKLADOVÁNÍ A EXPIRACE a. Soupravu a její složky skladujte v suchu a temnu při teplotě +2 až +10 C. Za těchto podmínek je expirační doba celé soupravy uvedena na centrálním štítku na obalu soupravy, expirace jednotlivých složek je uvedena na jejich obalu. b. Nespotřebované stripy vložte zpět do obalu a zatavte, nebo dobře uzavřete do sáčku se zipem společně s desikantem. c. Soupravy se přepravují v termotaškách s ledem, doba přepravy do 72 hodin nemá na expiraci vliv. Jestliže po obdržení soupravy zjistíte vážné poškození obalu jakékoliv složky soupravy, ihned informujte výrobce. d. Nespotřebovaná testovaná séra uchovávejte v neředěném stavu rozplněná na alikvoty a zmrazená při teplotě -18 až -28 C. Časté zmrazování a rozmrazování se nedoporučuje. Pokud skladujete séra při teplotě +2 až +10 C, pak je spotřebujte do jednoho týdne. e. Roztoky testovaných sér v pracovní koncentraci nelze skladovat. Připravujte je vždy čerstvé. 6

14. DOPORUČENÁ LITERATURA Coleman RM,Pereira L, Bailey PD, Dondero, D et al. Determination of herpes simplex virus type-specific antibodies by enzyme-linked immunosorbent assays. J Clin Microbiol 1983; 18: 287-291. Gilman SC, Docherty JJ. Detection of antibodies specific for herpes simplex virus in human sera by enzyme linked immunosorbent assay. J Infect Dis 1977; 163, Supl. 2: S286-S293. Ashley R, Cent V, Maggs V, Nahmias A et al.: Inability of enzyme-linked immunoassays to discriminate between infections with herpes simplex virus types 1 and 2. Ann Intern Med 1991; 115: 520-526. Cowan FM, Johnson AM, Ashley R, Corey L et al. Relationship between antibodies to herpes simplex virus (HSV) and symptoms of HSV infection J Infect Dis 1996; 174: 470-475. 7

15. TESTOVACÍ SCHÉMA Krok 1. Krok 2. Krok 3. Krok 4. Připravte reagencie a testovaná séra v pracovním ředění Aplikujte kontrolní a testovaná séra (100 μl / jamku) Inkubujte 60 minut při laboratorní teplotě 4x promyjte (250 μl / jamku), vyklepněte Aplikujte konjugát anti-iga Px (100 μl / jamku) Inkubujte 60 minut při laboratorní teplotě 4x promyjte (250 μl / jamku), vyklepněte Aplikujte chromogensubstrátový roztok TMB-O (100 μl / jamku) Inkubujte 10 minut v temnu při laboratorní teplotě Krok 5. Krok 6. Aplikujte stop roztok (100 μl / jamku) Změřte absorbanci při 450 / 620-690 nm do 10 minut Souprava byla vyvinuta za finanční podpory ze státních prostředků poskytnutých prostřednictvím Ministerstva průmyslu a obchodu. Datum poslední verze tohoto návodu: 04/2013 8