Médium MarrowGrow Informace o produktu Médium MarrowGrow MGM-100 100 ml UPOZORNĚNÍ: Při práci dodržujte zásady práce s biohazardním materiálem CytoGen GmbH, produktová informace verze 1.2 www.cytogen.info Str. 1 z 8
MarrowGrow Medium Návod k použití Katal. č. MGM-100 (100 ml zmraženého roztoku) Popis produktu Médium MarrowGrow je určeno pro použití v in vitro diagnostice a bylo vyvinuto pro kultivaci buněk kostní dřeně a leukemických krevních buněk, které mohou být následně použity při karyotypizaci, fluorescenční in situ hybridizaci (FISH) a dalších cytogenetických metodách. Médium MarrowGrow může být použito jako nespecifické médium pro kultivaci různých hematopoetických buněk (myeloidní a lymfoidní linie) přítomných v kostní dřeni nebo leukemických krevních vzorků. Médium MarrowGrow může být také použito spolu s migogenem specifickým pro B nebo T lymfocyty, kde jsou tyto specifické linie vyšetřovány (viz podrobněji v oddíle Protokol). Médium MarrowGrow je dodáváno zmražené a kompletní, připravené k použití ve 100 ml lahvičkách. Jeho základem je alpha-mem a obsahuje antibiotika, L-glutamin, zárodečné hovězí sérum (FBS), hormony a růstové faktory. Médium MarrowGrow je pufrováno bikarbonátem sodným a jako ph indikátor je použita fenolová červeň. Kompletnost média snižuje možnost technické chyby a kontaminace kultury. Navíc toto médium podporuje pevnější přisednutí buněk a buněčný růst, čímž je umožněná časná analýza chromozomů. Skladování Zmražené: Chlazené: Skladujte při 20ºC a v temnu až do konce exspirační doby uvedené na nálepce. Uchovávejte při 4ºC až 2 týdny. CytoGen GmbH, produktová informace verze 1.2 www.cytogen.info Str. 2 z 8
Návod k použití Médium MarrowGrow je kompletní médium, dodávané zmražené a sterilní. Filtrování média není potřebné. Úspěšnot kultivace závisí na použití vhodných aseptických technik. Následující doporučení vám můžou být při používání MarrowGrow užitečné. Rozmražení média MarrowGrow rozmražujte před použitím ve vodní lázni s teplotou 37ºC za občasného míchání. Alternativně můžete rozmrazit médium v CO 2 inkubátoru při 37ºC s povoleným víčkem, aby se umožnila normalizace ph. Teplé médium se správným ph je pro zahájení kultivace optimální. Kontrola ph MarrowGrow je dodáváno s optimálním ph 6,9 7,1, někdy se ale může ph lišit: MarrowGrow obsahuje ph indikátor fenolovou červeň: Růžová znamená vysoké ph. Fenolová červeň se mění na růžovou při ph 7,4. Růžové médium (příliš alkalické) lze napravit pootevřením víčka (asi o ¼ otáčky) a inkubací lahvičk v 5% CO 2 asi 1 hodinu. Médium zůstane sterilní a samovolně upraví svoje ph na správnou hodnotu. Žlutá znamená nízké ph. Fenolová červeň se změní na žlutou při ph 6,7. Žluté médium (příliš kyselé) lze napravit stejným způsobem, jako růžové médium. Alternativně lze lahvičku s médiem nebo kultivační nádobku nasytit plynným 5% CO 2 v laminárním boxu, dokud se nedosáhne červené barvy. Barvu lze v případě potřeby porovnat s lahvičkou čerstvého rozmraženého média. Antibiotika MarrowGrow obsahuje gentamycin, který je méně inhibující pro růst buněk ve srovnání s penicilinem a streptomycinem. CytoGen GmbH, produktová informace verze 1.2 www.cytogen.info Str. 3 z 8
Stabilita MarrowGrow je ve zmraženém stavu stabilní až do data expirace vyznačeného na štítku. Nepoužívejte po vyznačeném datu exspirace. MarrowGrow můžete používat až 2 týdny po rozmražení, pokud ho uchováte při 4ºC, následně ale glutamin degraduje. Můžete ho doplnit (ale pouze jednou) L-glutaminem až do 2,0 mm (1/100 objemu 200 mm glutaminového zásobního roztoku). Vyvarujte se opakovaného zahřívání a chlazení, stejně jako expozici světlu. Test kvality MarrowGrow je testováno na ph, osmolaritu, a kontaminace bakteriální, mykoplazmatickou i plísňovou. Vedle těchto standardních specifikací je každá výrobní šarže testována na buněčný růst přední evropskou cytogenetickou laboratoří a kvalita produktu je porovnána s referenčním standardem. Certifikát kvality vám na požádání zašleme. Upozornění Kontaktujte přímo Sales & Marketing Department výrobce CytoGen GmbH pro jakékoli pochybnosti o kvalitě média. Nepoužívejte médium, jestliže je Obal jakkoli porušen. Médium kalné, nebo obsahuje viditelný precipitát. Pokud obdržíte produkt rozmražený, nebo částečně rozmražený, okamžitě ho zamražte na 20ºC a kontaktujte distributora. Limitace Každá laboratoř si musí médium sama otestovat ve vlastním provozu a v návaznosti na vlastní zavedené postupy před začleněním do systému in vitro diagnostiky. Příspěvkem firmy CytoGen je pouze kultivace buněk, respektive dodávka kvalitního média. CytoGen nemůže zodpovídat za výsledky testů, které se po kultivaci následně provádějí. CytoGen GmbH, produktová informace verze 1.2 www.cytogen.info Str. 4 z 8
Kultivační protokoly Výběr metody (podle Rooney D.E. aj.) K dispozici je několik metod a výběr té nejvhodnější závisí na odzkoušených podmínkách a v následující tabulce nabízíme doporučené postupy: Diagnóza Vzorek Minimální kultury Poznámka CGL/CML PB/BM ONC, S D, 48h AML (except APL) BM/PB ONC, S 24h, 48h APL BM/PB ONC, 24h, S 48h MDS BM ONC, S 24h, 72h ONC MPD BM ONC, S 24h, 72h ONC ALL (non B/T) BM/PB ONC, S D, 24h, 48h ALL (T cell) BM/PB ONC, S D, 24h, 48h, 3d ALL (B cell) BM/PB ONC, 3d + PMA D, S, 24h, 48h 5d + PMA; 2d + PHA CLL (B cell) PB/BM ONC, 3d + PMA 3d 5d + PMA; 2d + PHA CLL (T cell) PB/BM ONC, 3d + PHA 3d 3d PMA T-cell lymphoma LN/BM ONC, 3d + PHA 3d 3d + PMA B-cell lymphoma LN/BM ONC, 3d + PMA 3d 5d + PMA Other lymphoid BM ONC, 3d +/- PMA S disorders 5d +/- PMA APL akutní promyelotická leukémie, MPD myoloproliferativní onemocnění, PB periferní krev, BM kostní dřeň, LN lymfatické uzliny, ONC expozice colcemidu přes noc, S synchronizovaná kultura, PHA fytohemaglutinin, PMA 4-forbol 12- myristát 13-acetát Následující protokol je návodem k provádění kultivací buněk kostní dřeně s použitím MarrowGrow. Může být použit dle uvážení zákazníka k náhradě buď části nebo celého kultivačního protokolu. Většina cytogenetických laboratoří má vlastní protokoly a MarrowGrow může být ve většině případů použito v rámci těchto protokolů. Nejběžnější kultivační metody používají otevřený systém. CytoGen GmbH, produktová informace verze 1.2 www.cytogen.info Str. 5 z 8
Velmi důležité upozornění: Definice otevřeného systému: kultury pěstované v Petriho miskách s mírně zdviženým víčkem nebo v lahvičkách s povoleným víčkem v 5% CO 2 atmosféře (CO 2 inkubátor), kde je umožněna ventilace plynů. Definice uzavřeného systému: kultury rostoucí ve standardním suchém inkubátoru v hermeticky uzavřených nádobách. Doporučení pro použití otevřeného systému Reagencie MarrowGrow kompletní médium Roztok colcemidu (10 µg/ml) Roztok hypochloritu sodného NaClO (2,5%) Protokol pro zakládání kultur a kultivaci buněk kostní dřeně 1 1. Když obdržíte vzorek kostní dřeně v transportním médiu nebo od pacienta na chemoterapii, centrifugujte 10 minut při 150 170 g. Pro kostní dřeň dodanou v heparinu jděte přímo na krok 3. 2. Odstraňte supernatant včetně veškerého tuku a nečistot plovoucích na povrchu vzorku. Postupujte opatrně, ať nepoškodíte pelet. 2 3. Přidejte 5 ml MarrowGrow média do každé zkumavce ve stojánku. 4. Zaočkujte příslušným množstvím kostní dřeně s využitím sterilní Pasteurovy pipety (v závislosti na koncentraci buněk). Konečná koncentrace buněk v kultuře by měla být 10 6 /ml. 5. Upravte kultury podle předběžné diagnózy: a) Přímé kultury: přidejte 100 µl roztoku colcemidu na 1-2 hodiny. b) Krátkodobé kultury: inkubujte přes noc. Následující ráno přidejte 100 µl roztoku colcemidu na 1-2 hodiny. c) Expozice colcemidu přes noc: přidejte 50 µl roztoku colcemidu co nejpozději odpoledne. Inkubujte přes noc při 37ºC. 1 Proveďte všechny kroky v biohazardním boxu třídy II, používejte sterilní pipety, pokud není řečeno jinak. Nefixovaný materiál shromažďujte v nádobce s hypochloritem sodným. Používejte pipety a špičky s příslušným objemem. 2 Pokud má vzorek velký počet bílých krvinek, pelet může být velmi snadno poškozen. Postupujte v tomto kroku velice opatrně. CytoGen GmbH, produktová informace verze 1.2 www.cytogen.info Str. 6 z 8
d) Krátkodobá kultura + expozice colcemidu přes noc: inkubujte při 37ºC 24, 48 nebo 72 hodin. Potom jako v kroku 5c. e) Kultury se stimulovanými lymfocyty B: přidejte 100 µl PMA a/nebo PWM a inkubujte 2-4 dny při 37ºC. Přidejte 100 µl roztoku colcemidu a inkubujte přes noc při 37ºC. f) Kultury se stimulovanými lymfocyty T: přidejte 100 µl PHA a inkubujte 72 hodin při 37ºC. Přidejte 100 µl colcemidu na 1-2 hodiny. Protokol pro sklizeň buněk kostní dřeně 1. Buňky jsou následně centrifugovány 5 minut při 1500 ot./min. 2. Odstraňte supernatant. 3. Resuspendujte pelet. 4. Přidejte 6 ml předehřátého KCl a inkubujte zkumavky při 37ºC. 5. Centrifugujte zkumavky při 1500 otáčkách 5 minut. 6. Odstraňte supernatant. 7. Přidejte do zkumavky 5 ml fixativa (3 díly methanolu, 1 díl kyseliny octové). Pomalu přidávejte za stálého jemného míchání vždy několik kapek fixativa. Přidávejte fixativum, dokud se všechny shluky buněk nerozdělí a buněčná suspenze je maximálně homogenní. 8. Centrifugujte při 1500 otáčkách 5 minut. 9. Opakujte kroky 9-10 dvakrát. 10. Po posledním promytí odstraňte supernatant co nejblíže k peletu bez jeho poškození. Následně pelet rozpusťte v příslušném množství fixativa pro vytvoření mikroskopického preparátu. CytoGen GmbH, produktová informace verze 1.2 www.cytogen.info Str. 7 z 8
Doporučení pro uzavřený systém MarrowGrow lze využít pro kultivaci buněk v uzavřeném systému, pokud je ph ve fyziologické oblasti (ph je mezi 6,9 a 7,4). Uzavřené systémy závisejí na vnitřní pufrovací kapacitě média bez výhody vyplývající z rovnováhy mezi uhličitany v médiu a 5% CO 2 přítomnému v otevřeném systému inkubátoru. Uzavřené systémy fungují nejlépe při kultivacích s nízkou koncentrací buněk, jelikož vyšší koncentrace produkuje kyselé metabolity, které můžou okyselit médium nad jeho fyziologickou pufrovací kapacitu. Udržování ph může být dosaženo v uzavřeném systému jednou z následujících 3 metod: 1. Metoda 1: Přidejte k MarrowGrow 2% (v/v) sterilního zásobního roztoku 1,0 M HEPES. Sterilní 1,0 M HEPES může být opraveno na ph 7,0 při 20ºC přidáním 1,0 M NaOH. Upravené médium HEPES je následně smícháno s buňkami a inkubováno při 37ºC v uzavřených kultivačních baňkách. 2. Metoda 2: Předinkubujte kultivační baňky s MarrowGrow a buňkami v 5% CO 2 inkubátoru 1 hodinu před uzavřením víčka a kultivací při 37ºC. 3. Metoda 3: Probublejte jednotlivé kultivační baňky obsahující MarrowGrow a buňky směsí 5% CO 2 95% vzduchu sterilní pipetou 20 s. Poté uzavřete víčko a kultivujte v uzavřeném systému při 37ºC. Nejlépe je připojit ke zdroji CO 2 sterilní zazátkovanou Pasteurovu pipetu, čímž se zajistí sterilita vstupujícího plynu. Bibliografie: Rooney D.E. a Czepulkowshi B.H. Human Chromosome Preparation. (1997). Výrobce: CytoGen GmbH, Bienenweg 28, D-35764 Sinn, Německo Distributor pro Českou republiku: PentaGen s.r.o., www.pentagen.cz CytoGen GmbH, produktová informace verze 1.2 www.cytogen.info Str. 8 z 8