ELISA-VIDITEST anti-vzv IgM

ELISA-VIDITEST anti-vzv IgM OD-197 Návod k použití soupravy VÝROBCE: VIDIA spol.s r.o., Nad Safinou II č. 365, Vestec, 252 42 Jesenice, tel.: +420 261 090 565, www.vidia.cz 1. NÁZEV SOUPRAVY: ELISA-VIDITEST anti-vzv IgM: souprava pro detekci protilátek třídy IgM proti viru varicella zoster (VZV) v séru. 2. POUŽITÍ: Souprava je určena pro diagnostiku chorob vyvolaných nebo spojených s VZV, např. planých neštovic a pásového oparu. Soupravu lze též využít pro diferenciální diagnostiku očních infekcí a kožních exanthematických onemocnění. Doplňkovými testy pro sérologické vyšetření VZV jsou detekce IgG, IgA a stanovení avidity IgG protilátek proti VZV (ELISA-VIDITEST anti-vzv IgG, ELISA-VIDITEST anti-vzv IgA, ELISA-VIDITEST anti- VZV IgG a avidita IgG), u neuroinfekcí též průkaz intrathekálních protilátek proti VZV (ELISA-VIDITEST anti-vzv IgG (CSF)). 3. PRINCIP TESTU: ELISA-VIDITEST anti-vzv IgM je imunoanalytický test na pevné fázi. Na povrch jamek je navázán nativní antigen VZV. Jsou-li v testovaných sérech přítomny příslušné protilátky, navážou se na imobilizovaný antigen. Navázané protilátky pak v dalším kroku reagují s protilátkami proti lidskému IgM značenými křenovou peroxidázou. Množství navázaných značených protilátek se stanoví barevnou enzymatickou reakcí. Intenzita zabarvení substrátu odpovídá množství protilátek v testovaném vzorku. Negativní séra nereagují, mírná změna v zabarvení jamek je pozadím reakce. 4. OBSAH SOUPRAVY: ELISA odlamovací stripy (bezbarvé) v manipulačním rámečku potažené směsí specifických antigenů STRIPS Ag 1 x 12 ks 1,3 ml pozitivního kontrolního séra r.t.u. 1) CTRL - 1 lahvička 1,3 ml negativního kontrolního séra r.t.u. CTRL + 1 lahvička 1,3 ml kalibrátoru r.t.u. CAL 1 lahvička 13 ml protilátek proti lidskému IgM značených peroxidázou, r.t.u. CONJ 1 lahvička 55 ml promývacího roztoku 10x konc. WASH 10x 1 lahvička 60 ml ředicího roztoku r.t.u. DIL 1 lahvička 13 ml chromogensubstrátového roztoku TMB r.t.u. TMB 1 lahvička 13 ml stop roztoku r.t.u. STOP 1 lahvička 2 ml RF sorbentu 25x konc. RF SORB 25x 1 lahvička Sáček se zipem Návod k použití soupravy Certifikát kontroly kvality 1) r.t.u., ready to use (v pracovní koncentraci) Chromogensubstrátový roztok TMB r.t.u. je zaměnitelný pouze mezi soupravami ELISA-VIDITEST, které obsahují TMB, a NENÍ VZÁJEMNĚ ZAMĚNITELNÝ s ostatními roztoky TMB použitými v jiných soupravách ELISA-VIDITEST TMB-O, TMB-BF. 1

5. POTŘEBNÝ MATERIÁL NEDODÁVANÝ SE SOUPRAVOU: Destilovaná/deionizovaná voda pro ředění promývacího roztoku, pipetovací zařízení, zařízení pro rozplňování roztoků a promývání stripů, spektrofotometr/kolorimetr. 6. PŘÍPRAVA REAGENCIÍ: a. Vytemperujte všechny složky soupravy na laboratorní teplotu. b. Těsně před vyšetřením důkladně zamíchejte vzorky vyšetřovaných sér a standardy. Připravte si ředicí roztok plus (DIL PLUS pro ředění sér následujícím způsobem: Přidejte 1 díl RF sorbentu RF SORB 25x k 24 dílům ředicího roztoku r.t.u. DIL ředění 25x (např. 1 ml RF sorbentu + 24 ml ředicího roztoku r.t.u.). Řeďte jen takové množství, které spotřebujete pro ředění sér v testu. Testovaná séra řeďte ředicím roztokem plus 101x (např. 5 μl séra + 500 μl ředicího roztoku plus) a inkubujte 10 min. při laboratorní teplotě. Ředicí roztok plus obsahuje anti-lidské IgG protilátky určené k vysycení IgG a revmatoidního faktoru (RF). Séra, naředěná v ředícím roztoku plus, vytvoří opalescenční roztok. Sraženinu není třeba před aplikací odstraňovat. Kontrolní séra a kalibrátor neřeďte, jsou v pracovní koncentraci (r.t.u., ready to use). c. Připravte pracovní koncentraci promývacího roztoku jeho naředěním 10x ve vhodném objemu destilované/deionizované vody (např. 50 ml promývacího roztoku + 450 ml H 2O). Pokud jsou v koncentrovaném roztoku krystaly soli, rozpusťte je zahřátím na vodní lázni při +32 až +37 o C a před naředěním dobře promíchejte. Nespotřebovaný promývací roztok v pracovní koncentraci lze skladovat 1 týden při teplotě +2 až +10 o C. d. Konjugát anti IgM/Px, chromogensubstrátový roztok TMB a stop roztok neřeďte, jsou v pracovní koncentraci (r.t.u.). 7. PRACOVNÍ POSTUP: a. Stripy, vakuově zatavené s desikantem, nechte před otevřením sáčku vytemperovat na laboratorní teplotu, aby nedošlo k orosení destičky. Připravte si potřebný počet stripů pro reakci. Nepoužité stripy společně s desikantem dobře uzavřete do sáčku se zipem nebo vakuově zatavte. b. Naplňte jamky po 100 L kontrolními séry a ředěnými testovanými séry následujícím způsobem: první jamku naplňte samotným ředicím roztokem (DIL PLUS) pro stanovení pozadí reakce. Dvě jamky naplňte kalibrátorem CAL. Další jamku pozitivním kontrolním sérem CTRL+ a další negativním kontrolním sérem CTRL- a zbývající jamky ředěnými testovanými séry (S1, S2, ) (viz Tab 1.). Každé sérum stačí aplikovat na jednu jamku. Pokud chcete vyloučit případnou laboratorní chybu, aplikujte CAL na tři jamky, vyšetřovaná a negativní kontrolní sérum aplikujte po dvou jamkách. Inkubujte 60 minut (+/- 5 min.) při laboratorní teplotě. c. Odsajte obsah jamek do pojistné sběrné láhve obsahující vhodný dezinfekční prostředek (viz Bezpečnostní předpisy). Jamky poté 4x promyjte 250 L promývacího roztoku. Vyvarujte se přetékání roztoku ven z jamek. Obsah jamek odsajte a destičku vyklepněte na přířez buničité vaty. d. Napipetujte do jamek po 100 L konjugátu anti-igm Px r.t.u. CONJ. Inkubujte 60 minut (+/- 5 min.) při laboratorní teplotě. e. Tekutinu z jamek odsajte a promyjte je 4x 250 L promývacího roztoku. Odsajte a vyklepněte. f. Napipetujte do jamek po 100 L chromogensubstrátového roztoku TMB. Inkubujte 10 minut ( 30 sec.) při laboratorní teplotě. Dobu inkubace začněte měřit po napipetování 1. stripu destičky. Dodržujte toto pravidlo, vyvarujete se tak nedodržení časového intervalu. Pipetujte rychle v pravidelném rytmu, případně použijte vhodný dispenzor. Překryjte stripy neprůhledným víčkem, nebo je po dobu reakce uložte na temné místo. g. Zastavte reakci přidáním 100 L stop roztoku STOP. Pipetujte ve stejném rytmu jako při rozplňování chromogensubstrátového roztoku TMB, aby enzymatická reakce probíhala ve všech jamkách po stejnou dobu. Zkontrolujte, zda nejsou v jamkách bubliny, pokud ano, jemným poklepem na rámeček destičky je odstraňte. h. Intenzitu barevné reakce změřte na spektrofotometru/kolorimetru při 450 nm nejpozději do 10 minut po zastavení reakce. Doporučujeme použít referenční filtr 620-690 nm 2

SCHÉMA APLIKACE VZORKŮ: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 a DIL PLUS S4 b CAL S c CAL d CTRL + e CTRLf S1 g S2 h S3 8. HODNOCENÍ TESTU: Nejdříve odečtěte absorbanci jamky se samotným ředicím roztokem (DIL PLUS = pozadí reakce) od hodnot kontrolních a testovaných sér. 8.1. Kvalitativní orientační hodnocení 1. Spočítejte průměrnou hodnotu OD Kalibrátoru CAL ze dvou jamek. Pokud jste aplikovali kalibrátor na tři jamky a OD v některé z nich se liší o více než 20% od průměru, nepoužívejte ji k výpočtu a spočítejte průměr ze zbývajících dvou hodnot. 2. Stanovte cut-off hodnotu tak, že průměrnou hodnotu OD Kalibrátoru vynásobíte korekčním faktorem. Hodnota korekčního faktoru pro danou šarži soupravy je uvedena v Certifikátu kontroly kvality. Séra s hodnotou OD < 90% cut-off jsou negativní a séra s hodnotou OD > 110% cut-off jsou považována za pozitivní. Séra s OD v rozmezí 90-110% CO jsou nejednoznačná, jejich testování je nutno opakovat, nebo vyšetřit další odběr od pacienta o 1-2 týdny později. 8.2. Semikvantitativní hodnocení Stanovte cut-off hodnotu jako v předešlém způsobu hodnocení (čl. 8.1, bod 2) 1. Stanovte hodnotu indexu pozitivity pro jednotlivé vzorky sér tak, že vydělíte hodnotu OD testovaného séra hodnotou cut-off. 2. Odečtěte v tabulce (viz HODNOCENÍ VÝSLEDKŮ) odpovídající stupeň reaktivity séra. HODNOCENÍ VÝSLEDKŮ: Hodnota indexu Vyhodnocení < 0,90 Negativní 0,90-1,10 +/- 1,11-2,00 + 2,01-3,00 ++ > 3,00 +++ Pozn.: Hodnocení +/- znamená, že sérum leží v rozmezí šedé zóny. V případě tohoto výsledku test opakujte. Leží-li sérum po opakovaném testování opět v rozmezí šedé zóny, opakujte testování alternativní metodou, nebo použijte sérum odebrané od téhož jedince o 1-2 týdny později. Příklad: Získaná OD Kalibrátoru = 1,063; 0,987; 1,025 Průměrná hodnota OD = 1,025 OD vzorku séra = 0,800 Korekční faktor = 0,32 Cut-off hodnota = 1,025 x 0,32 = 0,328 Hodnota indexu = 0,800 / 0,328 = 2,44 3

9. HODNOCENÍ VÝSLEDKŮ: IgM protilátky proti VZV jsou prokazatelné zejména po prodělané primární infekci. Při rekurentních infekcích se tvoří specifické IgM jen v nízkých titrech a nemusí být ELISA testem prokazatelné. Negativní výsledek testu proto nevylučuje probíhající nebo recentně proběhlou aktivní infekci. Vzorky od pacientů s polykolonální aktivací imunitního systému (EB-virová nebo cytomegalovirová infekční mononukleoza, toxoplazmoza, některá autoimunitní a lymfoproliferativní onemocnění) mohou poskytovat v testu falešně pozitivní výsledky. Pro určení diagnózy je nutno výsledky testu interpretovat vždy v kontextu s klinickými příznaky a výsledky dalších laboratorních vyšetření. 10. CHARAKTERISTIKY TESTU: 10.1. Platnost testu Hodnota absorbance samotného ředícího roztoku DIL (DIL PLUS = pozadí reakce) by měla být < 0,100. Hodnoty OD standardů/ kontrolních sér a poměr hodnot OD standardů CTRL+ / CAL by měly být v rozmezích uvedených v Certifikátu kontroly kvality dané šarže. Test je určen pro stanovení specifických IgM protilátek v lidském séru. 10.2. Přesnost testu Pro stanovení variability mezi jednotlivými testy reprodukovatelnosti (interassay) a během testu opakovatelnosti (intraassay) bylo provedeno srovnání vzorků s různými hodnotami OD. 10.2.1. Opakovatelnost (intraassay) Variační koeficient opakovatelnosti je maximálně 5%. Je měřen pro každou šarži minimálně na 12 paralelních jamkách téže destičky. Příklad: (n = počet paralelních jamek na téže destičce) n A ơ CV opak. 14 2,268 0,094 4,1 % 10.2.2. Reprodukovatelnost (interassay) Variační koeficient reprodukovatelnosti je maximálně 15%. Je měřen pro každou šarži porovnáním jamek téhož séra v několika po sobě jdoucích testech. Příklad: (n = počet testů určitého vzorku) n A ơ min max CVrepro 10 0,674 0,090 0,567-0,779 13,4% 9 0,832 0,061 0,729-0,927 7,3% 7 1,116 0,069 1,048-1,221 6,2% 10.3. Diagnostická citlivost a specifita testu Stanovení diagnostické citlivosti a specifity testu bylo provedeno v rámci studie diagnostické účinnosti soupravy. Výsledky testu byly porovnány s výsledky, získanými na dvou nezávislých komerčních testech. panel sér celk. poč pozitivní hraniční negativní hodnocení pozitivní 41 37 4 0 citlivost: 100% negativní 180 3 10 167 specifita: 98,2% Vzorky s hraničním výsledkem nebyly do kalkulace zahrnuty 10.4. Interference Hemolytické a lipemické vzorky nevykazují žádný vliv na výsledek testu minimálně do 50 mg/ml pro hemoglobin, 5 mg/ml pro bilirubin a 50 mg/ml pro triglyceridy. Přesto lze testovat takové vzorky pouze s výhradami. Přídavek RF sorbentu do ředícího roztoku pro séra odstraňuje interferenci revmatoidního faktoru u většiny vzorků. Vzorky s vysokou hladinou revmatoidního faktoru mohou poskytovat falešně pozitivní výsledky. 4

11. BEZPEČNOSTNÍ PŘEDPISY: Všechny složky soupravy jsou určeny pouze pro laboratorní účely. Lidská séra použitá v soupravě byla testována na nepřítomnost HBsAg, HCV a protilátek anti-hiv-1,2. Přesto s nimi nakládejte jako s infekčním materiálem a předměty, které s nimi přišly do styku, autoklávujte 1 hodinu při 121 C nebo dezinfikujte minimálně 30 minut 3% roztokem chloraminu. Tekutý odpad rovněž dekontaminujte v 3% chloraminu nebo jiném vhodném desinfekčním prostředku. Odpad vzniklý při promývání stripů dezinfikujte v odpadní nádobě pomocí vhodného dezinfekčního roztoku (např. Incidur, Incidin, chloramin,...) v koncentraci doporučené výrobcem. Tekuté odpady obsahující stop roztok (roztok kyseliny sírové) před likvidací neutralizujte 4% roztokem hydrogenuhličitanu sodného. Se stop roztokem pracujte opatrně, aby nedošlo k potřísnění kůže nebo sliznice. Stane-li se tak, omyjte postižené místo větším množstvím tekoucí vody. Při práci nejezte, nepijte a nekuřte. Nepipetujte ústy, ale vhodnými pipetovacími zařízeními. Používejte ochranné rukavice a po práci si důkladně umyjte ruce. Dbejte, aby nedošlo k rozlití vzorků a k tvorbě aerosolu. 12. UPOZORNĚNÍ: a. Výrobce zaručuje použitelnost soupravy jako celku. b. Promývací roztok, chromogensubstrátový roztok TMB r.t.u., stop roztok r.t.u. a ředicí roztok r.t.u. pro séra jsou vzájemně zaměnitelné mezi jednotlivými soupravami ELISA-VIDITEST, pokud není v návodu k použití soupravy uvedeno jinak. c. Pracujte asepticky, aby nedošlo k mikrobiální kontaminaci sér a reagencií. d. Při odebírání, ředění a skladování reagencií postupujte tak, aby nedošlo k jejich vzájemné kontaminaci či kontaminaci látkami inhibujícími enzymatickou aktivitu. e. Kalibrátor, kontrolní séra, ředicí roztok, chromogensubstrátový roztok TMB a konjugát anti-igm Px jsou konzervovány ProClinem 300. f. Chromogensubstrátový roztok TMB nesmí přijít do styku s oxidačními látkami a kovovými povrchy. g. Dodržujte přesně pokyny uvedené v návodu. Nereprodukovatelné výsledky mohou vzniknout zejména: * nedostatečným promícháním reagencií a vzorků před použitím * nepřesným pipetováním a nedodržováním času inkubací uvedených v bodě 7. * špatnou technikou promývání a potřísněním okrajů jamek vzorky nebo konjugátem * použitím stejné špičky při pipetování různých roztoků nebo záměnou uzávěrů. * kontaminací pipety, používané pro aplikaci vzorků, kontrol nebo chromogensubstrátového roztoku TMB, Px konjugátem (doporučujeme pro aplikaci konjugátu používat pipetu, vyhrazenou pouze pro tyto účely). 13. SKLADOVÁNÍ A EXPIRACE: a. Soupravu a její složky skladujte v suchu a temnu při teplotě +2 až +10 C. Za těchto podmínek je expirační doba celé soupravy uvedena na centrálním štítku na obalu soupravy, expirace jednotlivých složek je uvedena na jejich obalu. b. Nespotřebované stripy vložte zpět do obalu a zatavte, nebo dobře uzavřete do sáčku se zipem společně s desikantem. c. Soupravy se přepravují v termotaškách s ledem, doba přepravy do 72 hodin nemá na expiraci vliv. Jestliže po obdržení soupravy zjistíte vážné poškození obalu jakékoliv složky soupravy, ihned informujte výrobce. d. Nespotřebovaná testovaná séra uchovávejte v neředěném stavu rozplněná na alikvoty a zmrazená při teplotě -18 až -28 C. Časté zmrazování a rozmrazování se nedoporučuje. Pokud skladujete séra při teplotě +2 až +10 C, pak je spotřebujte do jednoho týdne. e. Roztoky testovaných sér nelze skladovat. Připravujte je vždy čerstvé. 5

14. TESTOVACÍ SCHÉMA: Krok 1. Připravte reagencie a testovaná séra v pracovním ředění Krok 2. Aplikujte 100 L/ jamku kontrolních a testovaných sér Inkubujte 60 minut při laboratorní teplotě 4x promyjte (250 L/ jamku), vyklepněte Krok 3. Aplikujte 100 L/ jamku konjugátu anti-igm Px r.t.u. Inkubujte 60 minut při laboratorní teplotě 4x promyjte (250 L/ jamku), vyklepněte Krok 4. Aplikujte 100 L/ jamku chromogensubstrátového roztoku TMB Inkubujte 10 minut v temnu při laboratorní teplotě Krok 5. Krok 6. Aplikujte 100 L/ jamku stop roztoku Změřte absorbanci při 450/620-690 nm do 10 minut Doporučená literatura: Provost PJ, Krah DL, Kuter BJ, Morton DH et al. Antibody assays suitable for assesing immune response to live varicella vaccine. Vaccine 1991; 9: 111 Wasmuth EH, Miller WJ. Sensitive enzyme-linked immunosorbent assay for antibody to varicella zoster virus using purified VZV glycoprotein antigen. J med Virol 1990; 32: 189-93. Leung J, Harpaz R, Baughman AL, Heath K et al. Evaluation of laboratory methods for diagnosis of varicella. Clin Infect Dis 2010; 51: 23-32. Landry ML, Cohen SD, Mayo DR, Fong,CKY et al. Comparison of fluorescent antibody to membrane antigen test, indirect immunofluorescence assay and commercial enzyme linked immunoassay for determination of antipody to varicella zoster virus. J Clin Microbiol 1987; 25: 832-835. Gershon AA, Steinberg SP. Antibody response to varicella zoster and the role of antibody in host defense. Amer J Med Sci 1981;282: 12-17 Souprava byla vyvinuta za finanční podpory ze státních prostředků poskytnutých prostřednictvím Ministerstva průmyslu a obchodu. Datum poslední verze tohoto návodu: 05/2015 6