Enzymový imunologický test pro stanovení koncentrace deoxypyridinolinových můstků (DPD) v lidské moči Pro in vitro diagnostické použití RYCHLÝ NÁVOD K PROVEDENÍ STANOVENÍ 1. Přidejte 50 µl zředěných (1:10) standardů, kontrol a vzorků. 2. Přidejte 100 µl studeného enzymového konjugátu. 3. Nechte inkubovat v temnu 2 hodiny ± 5 minut při teplotě 28 C. 4. Propláchněte 3krát promývacím pufrem 1X. 5. Přidejte 150 µl roztoku pracovního substrátu o teplotě 2028 C. 6. Nechte inkubovat 60 ± 5 minut při teplotě 2028 C. 7. Přidejte 100 µl ukon čovacího roztoku a odečtěte hodnotu optické hustoty při 405 nm. POUŽITÍ Metra DPD je test určen ke stanovení koncentrace deoxypyridinolinových (DPD) můstků vylou čených do lidské moči, jakožto ukazatele resorpce (vstřebávání) kostní tkáně. Zvýšené množství DPD v moči poukazuje na zvýšenou resorpci kostní tkáně. Stanovení DPD je pomů ckou při sledování změn kostní tkáně u žen v postmenopauzálním období, které podstupují hormonální nebo bisfosfonátovou antiresorpční léčbu, a u osob s diagnózou osteoporózy. SHRNUTÍ A VYSVĚTLENÍ Přibližně 9 organické kostní matrix př edstavuje kolagen typu I, protein s trojitou šroubovicí. 1 Kostní kolagen typu I je sesítěný specifickými molekulami, které poskytují pevnost a houževnatost. Sesítění zralého kolagenu typu I v kostech tvoří pyridiniové můstky pyridinolin (PYD) a deoxypyridinolin (DPD). 1,2 DPD se tvoří enzymatickým působením lysyl oxidázy na aminokyselinu lysin. 3 DPD je do cirkulace uvolňován během resorpčního procesu kostní tkáně. 25 Močí je DPD vylučován v nemetabolizované podobě a není závislý na typu stravování 6, tudíž je vhodný k diagnostice. V kostech se neustále odehrává metabolický proces zvaný remodeling přestavba kostí. 2,7 Tento proces zahrnuje degradaci resorpci kostní tkáně zprostředkovanou činností osteoklastů, a stavební proces tvorbu kostí zprostředkovaný činností osteoblastů. 2,7 Remodeling je potřebný pro udržování a celkové zdraví kostí a jeho dvě fáze jsou těsně svázané. To znamená, že resorpce a tvorba kostí jsou v rovnováze. U abnormálního kostního metabolizmu se provázání těchto dvou fází kostní přestavby poruší. Když pak resorpce převýší tvorbu dochází k čisté ztrátě kostní hmoty. 7 Stanovení specifických produktů degradace kostní matrix pak poskytuje analytické údaje o míře kostního metabolizmu. 2,4,5 Osteoporóza je metabolické kostní onemocnění charakterizované abnormální přestavbou kostí. Jde o systémovou kostní chorobu charakterizovanou řídkou kostní hmotou a mikroarchitektonickým chátráním kostní tkáně s následnou zvýšenou náchylností ke zlomeninám. 8 Nejběžnější typ osteoporózy se vyskytuje u žen v postmenopauze a je zapříčiněn nedostatkem estrogenu v důsledku ukončení činnosti vaje čníků. 7 Obnova množství estrogenu typického pro období před menopauzou pomocí substituční terapie zabraňuje ztrátě kostní hmoty a osteoporóze. 710 Obnova množství estrogenu typického pro období před menopauzou pomocí substituční terapie zabraňuje ztrát ě kostní hmoty a osteoporóze. 712 Osteoporóza může rovněž být výsledkem vytvoření neadekvátní maximální kostní hmoty během období růstu. Jedná se o nerovnováhu přestavby kostí související s věkem, kdy dochází k čisté převaze. Osteoporózu můžou rovněž zapříčinit četné klinické stavy a terapie, které vyvolávají ztrátu kostní hmoty nebo nerovnováhu přestavby kostí. 7 Patří sem endokrinní onemocnění jako např. hypogonádizmus, hypertyroidizmus, hyperparatyroidizmus a hyperkortisolizmus, dále také choroby zažívacího traktu související s výživou a metabolizmem minerálů, onemocnění pojivových tkání, vícečetné myelomy, chronická nepohyblivost, alkoholizmus nebo kouření a chronická heparinová nebo kortikosteroidní terapie. 7 Dalšími onemocněními, které se projevují abnormální kostní přestavbou jsou Pagetova choroba a karcinomy s metastázemi do kostí. 3 U stanovení Metra DPD byla k získání monoklonální protilátky, která vykazuje specificitu vůč i DPD použita technologie protilátek. 13 Specificita monoklonální protilátky použité v stanovení Metra DPD umožňuje jednoduché, praktické, reprodukovatelné a přímé stanovení množství DPD v moči. PRINCIP Metra DPD je imunochemická reakce probíhající formou mikrotitru na proužku, při které se k zachycení DPD ze vzorku používá monoklonální protilátka proti DPD nanesená na proužku. DPD ve vzorku soutě ží s konjugovanou DPD alkalickou fosfatázou o protilátku a reakce je detekována pomocí pnpp substrátu. Hodnoty stanovené prostřednictvím testu Metra DPD jsou korigovány pomocí kreatininu, aby byla zohledněna koncentrace vzorku v moči. DODANÝ MATERIÁL A REAGENCIE 96 testů ke stanovení koncentrace deoxypyridinolinových můstků Souprava Metra DPD EIA obsahuje: A DPD standardy A F položky 4203 až 4208 po 0,3 ml (A = 0, B = 3, C = 10, D = 30, E = 100, F = 300 nmol/l DPD) B DPD purifikovaný z hovězích kostí v kyselině fosforečné 10 mmol/l s C azidem sodným (0,0) jako konzervačním prostředkem. D E F L Vysoká/nízka kontrola položky 4209, 4210 po 0,3 ml DPD purifikovaný z hovězích kostí v kyselině fosforečné 10 mmol/l s H azidem sodným (0,0) jako konzervačním prostředkem. Potažené proužky položka 4661 po 12 ks Purifikovaná myší monoklonální protilátka proti DPD adsorbovaná na proužkových zásobnících. Ukončovací roztok položka 4702 15 ml 1N NaOH Promývací pufr 10X položka 4703 55 ml Neiontový detergent v pufrovém roztoku obsahující azid sodný (0,0) jako konzervační prostředek. Pufr pro stanovení položka 4704 55 ml Neiontový detergent v pufrovém roztoku obsahující azid sodný (0,0) jako konzervační prostředek. Substrátový pufr položka 4705 3 x 10 ml Roztok dietanolaminu a chloridu horečnatého obsahující azid sodný (0,0) jako konzervační prostředek. Substrátové tablety položka 0012 3 x 20 mg pnitrofenyl fosfát Enzymový konjugát položka 4202 po 3 ks Lyofilizovaný DPD purifikovaný z hovězích kostí konjugovaný s alkalickou fosfatázou s obsahem pufrových solí a stabilizátorů. Kryt na proužky položka 0047 po 3 ks MATERIÁL DODÁVANÝ ZVLÁŠŤ Mikropipety na 50300 µl Pomůcky vhodné k měření objemu v rosahu 7300 ml Nádobka na ředění promývacího pufru Zkumavky na ředění vzorků, standardů a kontrol Deionizovaná nebo destilovaná voda Snímač proužků schopný snímat při vlnové délce 405 nm
Software pro aproximaci kalibrační křivky se 4 parametry Hodnoty koncentrace kreatininu (mmol/l) pro vzorky moči UPOZORNĚNÍ A BEZPEČNOSTNÍ OPATŘENÍ 1. Pro in vitro diagnostické použití. 2. Se vzorky nakládejte, jako by byly potenciálně infekční. Při práci se všemi komponenty a vzorky od pacientů se řiďte obecnými pravidly bezpečnosti práce. 3. Nádoby a jejich nepoužitý obsah likvidujte v souladu s federálními, státníma a místními předpisy. 4. Dodané reagencie použijte jako ucelenou soupravu před datem expirace vyznačeným na štítku na obalu. 5. Reagencie skladujte v souladu s uvedenými pokyny. 6. V případě že je sáček propíchnutý, potažené proužky nepoužívejte. 7. Každý vzorek stanovte dvojmo. 8. 1N NaOH má korosivní účinek a může způsobit vážné popáleniny. Nepožívejte. Zamezte kontaktu s kůží, očima a oblečením. Zasažené místo opláchněte vodou. Po požití vyhledejte lékaře. 9. Jako konzervační prostředek byl použit azid sodný. Náhodné požití nebo kontakt s pufrem obsahujícím azid sodný může způsobit podráždění kůže, očí a úst. Pufry používejte pouze k určenému účelu a zamezte kontaktu s kyselinami. Azid sodný může reagovat s olovem nebo mědí za vzniku vysoce výbušných azidů kovů. Likvidovaný materiál proto spláchněte větším množstvím vody, aby se zabránilo nahromadění azidu. 10. K zajištění včasného přísunu reagencií doporučujeme použít pipety s více kanálky nebo opakovací pipetovací přístroj. 11. Aby stanovení vzorků proběhlo správně je třeba přidávat přesné množství vzorku a standardu. Pipetujte pečlivě a používejte pouze kalibrované příslušenství. 12. Vzorky s koncentraci přesahující 300 nmol/l rozřeďte v pufru pro stanovení a stanovení opakujte. Zřeďovací poměr zahrňte do závěrečného výpočtu. 13. Toto stanovení je možné provést za použití jakékoliv schválené metody promývání. 14. Pokud nelze udržet teplotu místnosti na 2028 C a absorbance > 2,0 se neshoduje s Vaším snímačem proužků, sledujte vývoj substrátu v zásobnících standardu A. Reakci ukončete, když optická hustota dosáhne 1,21,5. Pak proužky odečtěte. 15. Standardy a kontroly jsou v roztoku kyseliny fosforečné 10 mmol/l. Zabraňte styku s kůží, očima a oblečením. Nepožívejte. Zasažené místo opláchněte vodou. Po požití vyhledejte lékaře. 16. Deoxypyridinolinové standardy, kontroly a enzymový konjugát jsou citlivé na světlo. Nevystavujte dlouho světlu, zejména přímému a nepřímému slunečnímu záření. Nepoužívané reagencie skladujte v temnu. Na vzorky a reagencie nemá významný vliv běžné umělé laboratorní světlo, pokud je s nimi nakládáno v souladu s Postupem stanovení. PŘÍPRAVA REAGENCIÍ Promývací pufr viz poznámka k postupu v části POSTUP STANOVENÍ Zředěním koncentrovaného promývacího pufru 10X (viz tabulka v části POSTUP STANOVENÍ) v poměru 1:10 deionizovanou vodou připravte požadované množství promývacího pufru 1X. Skladujte při teplotě 20 28 C. Promývací pufr 1X spotřebujte do 21 dní od přípravy. Pokyny pro speciální promývání: Podle výše uvedeného postupu připravte promývací pufr 1X a do doby použití skladujte při teplotě 28 C. Enzymový konjugát Enzymový konjugát př ipravte nanejvýš 2 hodiny před použitím. Každou ampulku enzymového konjugátu rekonstituujte (viz tabulka) přidáním 7 ml pufru pro stanovení. Rekonstituovaný enzymový konjugát skladujte do doby použití při teplotě 28 C. Roztok pracovního substrátu Před zahájením stanovením je tř eba nechat substrátový pufr ustálit na teplotě 2028 C. (Doporučuje se nechat ustálit dvě hodiny až celou noc.) Roztok pracovního substrátu připravte nejvýše 1 hodinu před použitím. Do každé lahve se substrátovým pufrem o teplotě 20 28 C vložte po jedné substrátové tabletě (viz tabulka). Tablety nechte rozpouštět 3060 minut. Lahve důkladně protřepejte, aby se obsah dokonale promíchal. SKLADOVÁNÍ Soupravu skladujte při teplotě 2 8 C. Nezmrazujte. Nepoužité reagencie skladujte při teplotě 2 8 C. ODEBÍRÁNÍ A SKLADOVÁNÍ VZORKŮ Stanovení Metra DPD je možné provést za použití vzorků první ranní (FMV) nebo druhé ranní (SMV) moči bez konzervač ních prostředků. Doporučuje se moč odebírat před 10. hodinou ranní, aby se zamezilo možnému vlivu odchylek v rámci dne. Vzorky skladujte v chladu při teplotě 28 C p ři skladování kratším 7 dnů, při delším skladování zmrazte na teplotu 20 C. Vzorky opakovaně nerozmrazujte a nezmrazujte více než 5krát. Zamezte delšímu působení svě tla, zejména pak slunečního zá ření. Během obvyklého zpracování nemá běžné laboratorní světlo na vzorky žádný vliv. Při sledování léčby odeberte vzorky moči pro stanovení počátečních hodnot ještě pře zahájením léčby. Vzorky pro následné srovnání odebírejte ve stejnou dobu, jako počáteční vzorek. POSTUP STANOVENÍ Před zahájením stanovení si přečtěte celý návod. Před uskutečněním testu si přečtěte PŘÍPRAVU REAGENCIÍ. POZNÁMKA K POSTUPU: Stanovení Metra DPD je citlivé na zp ůsob promývání. Promývací krok je t řeba ukončit do 2 minut. Pokud promývání nelze ukončit do 2 minut, řiďte se Pokyny pro speciální promývání v částech PŘÍPRAVA REAGENCIÍ a Promývání. Podle počtu proužků, které budete používat, stanovte potřebné množství jednotlivých reagencií. Počet proužků 4 6 8 12 Počet vzorků (stanovených dvojmo) 8 16 24 40 Enzymový konjugát (ampulka) 1 1 2* 2* Substrát (láhev) 1 1 2* 2* Promývací pufr 1X (ml) 100 150 200 300 *Při použití více než jedné lahve nebo ampulky před použitím smíchejte jejich obsah a důkladně promíchejte. Inkubace vzorků/enzymového konjugátu 1. Vzorky, standardy a kontroly zřeďte v poměru 1:10 pufrem pro stanovení (např. 50 µl vzorku + 450 µl pufru pro stanovení). 2. Vyjměte ze sáčku stojánek s proužkovými zásobníky a požadovaný počet potažených proužků (Viz tabulka). Sáček obsahující nepoužité proužky poté důkladně uzavřete. 3. Požadovaný počet potažených proužků vložte do zásobníkového stojánku. Proužky označte, aby při jejich náhodném uvolnění ze stojánku nedošlo k jejich záměně. 4. Do každého zásobníku potažených proužků přidejte 50 µl zředěného standardu, kontroly nebo vzorku. Tento krok je třeba ukončit do 30 minut. 5. Enzymový konjugát připravte nejvýše 2 hodiny před použitím. Každou požadovanou ampulku (viz tabulka) enzymového konjugátu rekonstituujte přidáním 7 ml pufru pro stanovení. Do doby použití skladujte enzymový konjugát při teplotě 28 C. 6. Do každého zásobníku přidejte 100 µl rekonstituovaného enzymového konjugátu. Proužky přikryjte dodaným krytem. Nechte inkubovat 2 hodiny (± 5 minut) při teplotě 28 C. Tento inkubační krok provádějte v temnu. 7. Roztok pracovního substrátu připravte nejvýše 1 hodinu před použitím. Do každé lahve se substrátovým pufrem o teplotě 20 28 C vložte po jedné substrátové tabletě (viz tabulka). Tablety nechte 3060 minut rozpouštět. Lahve řádně protřepejte, aby se obsah úplně promíchal. Promývání 8. Zředěním koncentrovaného promývacího pufru 10X v poměru 1:10 deionizovanou vodou připravte požadované množství promývacího pufru 1X (viz tabulka). Proužky ručně obraťte/vyberte. Do každého zásobníku přidejte alespoň 250 µl promývacího pufru 1X a proužky ručně obraťte/vyberte. Postup ještě dvakrát zopakujte, aby promývání proběhlo celkem třikrát. Po posledním promytí nechte proužky důkladně oschnout na papírových utěrkách. Když jsou pružky otočené, opatrně otřete spodek proužků papírovým ručníkem co nepouští
Optical Density (405 nm) chloupky, aby byl spodek těchto proužků čistý. Pokyny pro speciální promývání: Postupujte podle výše uvedených bodů za použití studeného (28 C) promývacího pufru 1X. Po posledním promytí nechte proužky sušit 510 minut na papírovém ručníku než přidáte substrát. Inkubace substrátu 9. Do každého zásobníku přidejte 150 µl roztoku pracovního substrátu. 10. Nechte inkubovat 60 minut (± 5 minut) při teplotě 2028 C. Ukončení/Odečtení 11. Do každého zásobníku přidejte 100 µl ukončovacího roztoku. Ukončovací roztok přidávejte stejným způsobem a ve stejných časových intervalech jako roztok substrátu. 12. Odečtěte optickou hustotu při 405 nm. V zásobnících nesmí být žádné větší bublinky a spodek proužků musí být čistý. Proužky je nutno odečíst do 15 minut od přidání ukončovacího roztoku. 13. Výsledky testu Metra DPD zpracujte pomocí softwaru určujícího koncentraci pomocí rovnice aproximace kalibrační křivky se 4 parametry. Rovnice: y = (AD)/(1 + (x/c)^b) + D 14. Koncentraci vzorků a kontrol stanovte z kalibrační křivky. 15. Kontrolní hodnoty by měly být v rámci rozmezí uvedeném na certifikátu analýzy dodaném se soupravou. KONTROLA KVALITY Certifikát analýzy přiložený k této soupravě je specifický pro danou šarži a slouží k ověření, zda jsou výsledky naměřené ve vaší laboratoři obdobné jako výsledky získané ve společnosti Quidel. Uvedené jsou hodnoty optické hustoty, které mají sloužit pouze jako vodítko. Výsledky stanovené vaší laboratoří se mohou lišit. Rozmezí hodnot kontroly kvality jsou rovněž uvedena. Kontrolní hodnoty mají sloužit ke kontrole správnosti křivky a hodnot naměřených ve vzorku. Každá laboratoř si má určit vlastní parametry př ijatelného rozmezí výsledků stanovení. Pokud se kontrolní hodnoty nachází MIMO přijatelného rozmezí určeného vaší laboratoří, výsledky stanovení je nutné pokládat za nevěrohodné a stanovení vzorku je třeba opakovat. Pokud je hodnota optické hustoty standardu A testu Metra DPD nižší než 0,8, výsledky stanovení je nutné pokládat za nevěrohodný a stanovení vzorku je třeba opakovat. VYHODNOCENÍ VÝSLEDKŮ Výsledky získané pomocí testu Metra DPD je třeba upravit o rozdíly v koncentraci moči podělením hodnoty DPD (nmol/l) hodnotou kreatininu (mmol/l) pro každý vzorek (kreatinin mg/dl x 0,088 = mmol/l). Konečný výsledek bude vyjádřený v nmol DPD/mmol kreatininu. Standardní množství DPD: 0, 3, 10, 30, 100, 300 nmol/l OMEZENÍ METODY Stanovení Metra DPD se používá k indikaci resorpce kostní tkáně, není ale určeno k předpovědi vývoje osteoporózy nebo náchylnosti ke zlomeninám. Použití tohoto stanovení není rovn ěž vhodné při hyperparatyroidizmu nebo hypertyroidizmu. Při monitorování léčby pomocí testu Metra DPD můžou být výsledky stanovení matoucí u pacientů trpících chorobami, které ovlivňují resorpci kostní tkán ě jako jsou metastázy na kostech, a také výše uvedenými onemocněními a stavy. Výsledky stanovení Metra DPD je třeba interpretovat v souvislosti s klinickým nálezem a ostatními diagnostickými výsledky a neměly by být jediným rozhodujícím faktorem pro zahájení nebo změnu léčby. HODNOTY NAMĚŘENÉ VE VZORCÍCH Referenční rozmezí pro stanovení Metra DPD byla určena pomocí vzorků od zdravých mužů (n = 121) a zdravých žen p řed menopauzou (n = 312) ve věku od 25 let. Definice zdravého jedince pro účely stanovení referenčních rozmezí je: V zásadě zdravý člověk bez onemocnění kostí a bez endokrinní nebo chronické choroby Žena s pravidelným menstruačním cyklem (ženy) Netěhotná a nekojící žena (ženy) Osoba, která v současnosti neužívá žádné léky o kterých se ví, že ovlivňují kostní metabolizmus (např. kortikosteroidy, analogy GnRH, antikonvulziva, heparin, léky na štítnou žlázu) Naměřené hodnoty můžou být ovlivněny skutečnostmi jako jsou nízká produkce estrogenu, nízký přísun vápníku, nedostatečná fyzická aktivita, nebo chorobami, které ovlivňují metabolizmus kostí jako jsou osteoporóza, Pagetova choroba, hyperparatyroidizmus, hypertyroidizmus a metastázy na kostech. Nedostatek estrogenu u žen v postmenopauzálním období může způsobit zvýšenou resorpci kostní tkáně. K interpretaci výsledků u žen v postmenopauzálním období se doporučuje použít referenční rozmezí odpovídající období před menopauzou. Každá laboratoř by si měla vytvořit vlastní normální referenční rozmezí. Rozmezí jsou vyjádřena jako neparametrické referenční intervaly (9 interval spolehlivosti). Střední Standardní Věk (roky) hodnota odchylka Rozmezí (nmol DPD/mmol kreatin) Ženy 25 44 5,0 1,4 3,0 7,4 Muži 25 55 3,8 1,0 2,3 5,4 Variabilita výsledků jednoho jednotlivého jedince byla stanovena ze vzorků moči od 49 zdravých osob odebíraných pět dní (nejdoucích po sobě) v rámci dvou týdnů. Průměr podélné variace jednotlivých jedinců byl 15,. Variabilitu výsledků různých jedinců se odráží ve výše uvedených neparametrických referenčních intervalech. ZNAKY METODY Specificita protilátek Monoklonální protilátka proti DPD vykazuje selektivní, vysokou afinitu vůči volnému DPD. Vázání na DPD peptidy a na volný pyridinolin nebo na peptid navázaný pyridinolin (PYD) je zanedbatelné. % Reaktivita Volný DPD 10 Volný PYD < 1% PYD/DPD peptidy 1000 mol. hm. < 2. 3500 mol. hm. < 2. Deoxypyridinoline (nmol/l) Citlivost Minimální množství DPD zjistitelné pomocí testu Metra DPD je 1,1 nmol/l, určené horním limitem 3 standardních odchylek v studii přesnosti s nulovým standardem. Typická kalibrační křivka
< 3.0 3.0 3.9 4.0 4.9 5.0 5.9 6.0 6.9 7.0 7.9 8.0 8.9 9.0 9.9 10.0 10.9 11.0 11.9 12.0 12.9 13.0 13.9 14.0 14.9 15.0 < 3.0 3.0 3.9 4.0 4.9 5.0 5.9 6.0 6.9 7.0 7.9 8.0 8.9 9.0 9.9 10.0 10.9 11.0 11.9 12.0 12.9 13.0 13.9 14.0 14.9 15.0 Zpětná výtěžnost zpětná výtěžnost s přídavkem Zpětná výtěžnost s přídavkem byla stanovena přidáním známého množství purifikovaného DPD do vzorků moči s různým množstvím endogenního DPD. Charakteristické výsledky jsou uvedeny níže. Naměřená Zpětná Endogenní Přídavek Vzorek hodnota výtěžnost (nmol/l) (nmol/l) (nmol/l) 1 3,1 27,3 32,0 106 2 11,2 27,3 38,8 101 3 18,2 27,3 44,9 98 Zpětná výtěžnost linearita Linearita byla určena sériovým řed ěním vzorků a porovnáním naměřených hodnot s hodnotami očekávanými. Charakteristické výsledky jsou uvedeny níže. Vzorek Poměr Naměřená Očekávaná Zpětná ředění hodnota hodnota výtěžnost (nmol/l) (nmol/l) 1 čistý 65,5 1:2 31,8 32,8 97 1:4 15,4 16,4 94 2 čistý 84,6 1:2 39,3 42,3 93 1:4 19,4 21,1 92 3 čistý 132,6 1:2 65,6 66,3 99 1:4 30,2 33,2 91 1:8 16,8 16,6 101 Přesnost Přesnost v rámci stanovení byla určena pro 21 replikátů ze 3 vzorků na 2 proužcích z každé ze 3 šarží souprav (celkem 6 proužků). Přesnost mezi jednotlivými stanoveními byla určena pro 3 vzorky stanovené na 9 samostatných proužcích z každé ze 3 šarží souprav (celkem 27 proužků). Hodnoty naměřené na níže uvedených vzorcích představují rozmezí hodnot v nmol/l. Pro ženu s koncentrací kreatininu 4,5 mmol/l, vzorky 13 odpovídají spodní normální, horní normální a zvýšené resorpci (2,4 nmol/mmol, 6,7 nmol/mmol a 38,8 nmol/mmol, v uvedeném pořadí). Variační Variační koef. DPD (nmol/l koef. v rámci mezi Vzorek DPD) stanovení 1 stanoveními 2 % % 1 10,7 8,4 4,8 2 30,0 4,3 4,6 3 174,7 5,5 3,1 1 2 n=21 n=9 testů Stř ední (± 1standardní odchylka) počáteční koncentrace DPD (7,56 ± 2,27 vs. 7,94 ± 3,25 nmol/mmol, p = 0,304) a BMD bederní páteř e (0,97 ± 0,17 vs. 0,97 ± 0,15 g/cm 2, p = 0,792) byly obdobné pro skupinu CTL i HRT. Rozdělení hodnot DPD naměřených na začátku zkoušky u HRT a CTL skupiny v procentech jedinců s odpovídající koncentrací se nachází na obr. 1. Obr. 1: Rozdělení koncentrace DPD na začátku zkoušky Baseline CTL 3 Baseline HRT 2 2 Hodnoty koncentrace DPD po 12 m ěsících byly podstatně nižší u skupiny HRT než CTL (5,27 ± 1,78 vs. 8,08 ± 3,63 nmol/mmol, p < 0,00001). Pravděpodobnost, že koncentrace DPD u osob ze skupiny HRT bude po 12 měsících 7,4 nmol/mmol (89% vs. 51%, p < 0,00001) byla vyšší než u osob ze skupiny CTL, i když na začátky byla tato procenta pro obě skupiny obdobná (CTL 56%, HRT 53%, 7,4 nmol/mmol). Rozdělení hodnoty DPD naměřené po 12 měsících u HRT a CTL skupin se nachází na obr. 2. Obr. 2: Rozdělení koncentrace DPD po 12 měsících léčby estrogenem/progestinem (HRT) nebo podávání placeba (CTL) 3 2 2 12 month CTL 12 month HRT KLINICKÉ STUDIE Použití testu Metra DPD ke sledování hormonální antiresorpční léčby u žen v postmenopauze Spolehlivost a účinnost testu Metra DPD určeného ke sledování změn koncentrace DPD vyloučeného do moči v souvislosti s estrogenenovou/progestinovou antiresorpční léčbou byla prokázána úspěšnou kontrolovanou zkouškou s náhodným rozdělením provedenou na různých místech. Zvýšená resorpce kostní tkáně a významný úbytek kostní hmoty č asto souvisí s nedostatkem estrogenu v postmenopauzálním období. Nahrazení chybějícího estrogenu se ukázalo být ú činným způsobem snižujícím kostní resorpci a chránícím stávající kostní hmotu. 7 10 Předmětem zkoušek byly ženy v postmenopauzálním období ve věku 45 až 64 let (střední hodnota 56 ± 4 roky), které byly v průb ěhu posledních maximálně 10 let v přirozené, nebo chirurgickým zákrokem vyvolané, menopauze. Na začátku byly vhodné osoby náhodně rozděleny buď do skupiny aktivní léčby (HRT): Premarin (0,625 mg denně) s placebo progestinem, Premarin (0,625 mg denně) a aktivní progestin (Provera 2,5 mg/den nepř etržitě, Provera 10 mg/den periodicky, nebo mikromletý progesteron 200 mg/den periodicky), anebo do kontrolní skupiny (CTL): placebo estrogen a placebo progestin. Na začátku a po 12 měsících byly od všech osob odebrány vzorky první nebo druhé ranní moči. Výsledky získané pomocí testu Metra DPD byly korigovány pomocí kreatininu o rozdíly v koncentraci moči a vyjádřeny v nmol DPD/mmol kreatininu.
3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0 < 3.0 3.9 4.9 5.9 6.9 7.9 8.9 9.9 10.9 11.9 12.9 13.9 14.9 15.0 < 5 50.0 to 40.1% 40.0 to 30.1% 30.0 to 15.1% 15.1 to 0.1% 0.0 to 9.9% 10.0 to 19.9% 20.0 to 29.9% 30.0 to 39.9% 40.0 to 49.9% 50. < 3.0 3.0 3.9 4.0 4.9 5.0 5.9 6.0 6.9 7.0 7.9 8.0 8.9 9.0 9.9 10.0 10.9 11.0 11.9 12.0 12.9 13.0 13.9 14.0 14.9 15.0 Proportion of Stř ední (± 1 standardní odchylka) koncentrace DPD u osob ze skupiny CTL se po 12 měsících mírně zvýšila oproti výchozím hodnotám na + 11,7% (± 49,7%) (p = 0,278), zatímco koncentrace DPD u osob ze skupiny HRT se po 12 měsících oproti výchozím hodnotám snížila na 29,1 ± 23,8% (p < 0,0001). Rozdělení procentních změn oproti počátečním hodnotám koncentrace DPD po 12 měsících u skupin HRT a CTL je zobrazeno na obr. 3. Obr. 3: Rozdělení procentní změny koncentrace DPD po 12měsíční léčbě estrogenem/progestinem (HRT) nebo podávání placeba (CTL) CTL Stř ední (± 1 standardní odchylka) počáteční koncentrace DPD (7,35 ± 3,30 vs. 7,74 ± 3,47 nmol/mmol, p = 0,278) a hodnoty LSBMD (0,75 ± 0,09 vs. 0,74 ± 0,10 g/cm 2, p = 0,426) byly obdobné pro skupinu ALN i CTL. Rozdělení počátečních hodnot DPD pro skupiny ALN a CTL jsou zobrazeny na obr. 4. 3 Obr. 4: Rozdělení počátečních hodnot DPD Baseline CTL Baseline ALN 2 HRT 2 2 2 % Change V tabulce 1 jsou uvedeny hodnoty BMD bederní páteře, které po 12 měsících dosáhly osoby ze skupiny HRT ve srovnání se skupinou CTL (p < 0,00001). Tabulka 1. Změny BMD bederní páteře (stř. hodnota ± standardní odchylka) n Počáteční Hodnota po hodnota 12 měsících (g/cm 2 ) (g/cm 2 ) CTL 57 0,97±0,17 0,95±0,17 1,6±2,7 HRT 244 0,97±0,15 1,01±0,15 +3,7±2,7 Tyto výsledky ukazují, že test Metra DPD je spolehlivý a účinný pro sledování antiresorpčního účinku hormonální substituční léčby žen v postmenopauzálním období. Použití testu Metra DPD ke sledování antiresorpční bisfosfonátové léčby osteoporózy Spolehlivost a účinnost testu Metra DPD určeného ke sledování změn koncentrace DPD vyloučeného do moči v souvislosti s aminobisfosfonátovou (alendronátovou) antiresorpční léčbou byla prokázána úspěšnou kontrolovanou zkouškou s náhodným rozdělením provedenou na různých místech. Předmětem zkoušky byly ženy v postmenopauzálním období ve vě ku 45 až 84 let (střední hodnota 64 ± 7 let) s diagnózou osteoporózy (stanovené na základě klinické prezentace nebo základní minerální hustoty kostí bederní páteře [LSBMD] vyšší než 2,5 krát standardní odchylka pod střední hodnotou pro dospělé ženy před menopauzou). Na počátku byly vhodné osoby náhodně rozděleny do skupin, které dostávaly buď 10 mg alendronátu a 500 mg vápníku denně (ALN) nebo 500 mg vápníku denně (CTL). Vzorky druhé ranní moči byly od všech osob odebrány na začátku zkoušky, a pak po 3, 6 a 12 měsících. Výsledky získané pomocí testu Metra DPD byly korigovány pomocí kreatininu o rozdíly v koncentraci moči a vyjádřeny v nmol DPD/mmol kreatininu. Hodnoty DPD byly podstatn ě nižší ve skupině ALN než CTL po 3 měsících (5,45 ± 2,61 vs. 7,56 ± 3,08 nmol/mmol, p < 0,00001), 6 měsících (4,83 ± 1,94 vs. 7,09 ± 3,33 nmol/mmol, p < 0,00001) i 12 měsících (4,78 ± 1,75 vs. 6,73 ± 2,98 nmol/mmol, p < 0,00001). Po 3, 6, a 12 měsících mělo 84%, 89% a 91% (v uvedeném pořadí) osob ze skupiny ALN hodnoty koncentrace DPD 7,4 nmol/mmol. U osob ze skupiny ALN byla vyšší pravděpodobnost než u CTL, že hodnoty koncentrace DPD budou v každém časovém úseku 7,4 nmol/mmol (p = 0,002), i když vzájemný poměr obou skupin na začátku byl obdobný (CTL 60,4%, ALN 57,8% 7,4 nmol/mmol, v uvedeném pořadí). Rozdělení hodnot DPD ve skupinách ALN a CTL po 12 měsících je zobrazeno na obr. 5. Obr. 5: Rozdělení koncentrace DPD po 12 měsících léčby alendronátem (ALN) nebo vápníkem (CTL) 3 2 2 12 month CTL 12 month ALN Střední (± 1 standardní odchylka) hodnoty koncentrace DPD u osob ze skupiny CTL postupně klesaly z počáteční hodnoty na 4,9% (± 34,9%) po 12 měsících (p = 0,003), což může odrážet mírný antiresorpční účinek vápníku. 15 Střední koncentrace DPD u osob ze skupiny ALN se snížila na 22,9 ± 37,4% po 3 měsících, 28,6 ± 25,8% po 6 měsících a 29,5 ± 26,7% po 12 měsících. Rozdělení procentních změn po 12 měsících vůči počátečním hodnotám DPD pro skupiny ALN a CTL jsou zobrazeny na
M e t r a D P D < 50. 50.0 to 40.1% 40.0 to 30.1% 30.0 to 15.1% 15 to 0.1% 0.0 9.9% 10.0 19.9% 20.0 29.9% 30.0 39.9% 40.0 49.9% 5 Proportion of Metra DPD obr. 6. Obr. 7 Obr. 6: Rozdělení procentní změny koncentrace DPD po 12 měsících léčby alendronátem (ALN) nebo vápníkem (CTL) HPLC PYD Zvýšené Nezvýšené + + 31 20 2 Control Alendronate 14 129 2 V jiné studii byly hodnoty naměřené pomocí testu Metra DPD porovnány v rámci smíšeného souboru 39 vzorků od zdravých jedinců a 69 vzorků od pacientů s Pagetovou chorobou. I když Pagetova choroba představuje model pro identifikaci aktivní kostní resorpce, někteří z pacientů z tohoto výzkumu podstupovali léčbu, nebo se mohli nacházet v remisi a nemuseli mít v čase odebírání vzorků zvýšenou kostní resorpci. V rámci této studie se zdraví jedinci pohybovali v rozmezí 2,3 až 6,4 nmol/mmol a pacienti s Pagetovou chorobou v intervalu 1,7 až 50,4 nmol/mmol. K definování optimální relativní citlivosti a specificity v daném souboru byla použita metoda ROC za použití diagnózy Pagetovy choroby jakožto klasifikační metody. Relativní citlivost a specificita jsou uvedeny v tabulce 4. Na obr. 8 je kontingenční tabulka dvě na dvě. Tabulka 4 % Change V tabulce 2 jsou uvedeny hodnoty BMD bederní páteře, které měly osoby ze skupiny ALN ve srovnání se skupinou CTL (p < 0,00001) po 12 měsících. Tabulka 2. Změny BMD bederní páteře (stř. hodnota ± standardní odchylka Počáteční Hodnota po n hodnota 12 měsících (g/cm 2 ) (g/cm 2 ) CTL 167 0,75 ± 0,09 0,74 ± 0,09 0,8 ± 3,3 ALN 156 0,74 ± 0,09 0,78 ± 0,10 +5,7 ± 4,2 Obr. 8 Metra DPD Relativní citlivost 91% Specificita 97% Pagetova choroba Ano Ne + 63 1 6 38 Tyto výsledky ukazují, že test Metra DPD je spolehlivý a účinný pro sledování antiresorpčního účinku aminobisfospfonátové (alendronátové) léčby jedinců s osteoporózou. Další studie Prostřednictvím klinických studiích bylo vyhodnoceno množství deoxypyridinolinu v moči naměřené pomocí testu Metra DPD versus množství určené HPLC analýzou 14 a klinickou diagnózou. První z těchto studií se uskutečnila na klinických výzkumných pracovištích na 54 vzorcích od zdravých dobrovolníků a 140 vzorcích od pacientů se známým kostním onemocněním (včetně osteoporózy, Pagetovy choroby, hyperparatyroidizmu a hypertyroidizmu). Tyto choroby se často pojí s nadměrným resorpcím kostní tkáně a tito jedinci byli pokládáni za rizikovou skupinu. Nepředpokládalo se však, že by všichni sledovaní jedinci měli při odběru vzorků zvýšenou kostní resorpci. Sto tři ze 140 pacientů s nějakým onemocněním nevykázalo zvýšené hodnoty množství pyridinolinu naměřeného pomocí HPLC. Hodnoty deoxypyridinolinu stanovené testem Metra DPD u zdravých jedinců se pohybovaly od 2,3 do 11,2 nmol/mmol a u pacientů to bylo od 1,2 do 37,3 nmol/mmol. V rámci studie bylo stanovení Metra DPD porovnáno s výzkumnou metodou měření pyridinolinu pomocí HPLC 14. Prahové množství pro HPLC metodu bylo stanoveno ve studii, která zahrnovala 84 zdravých jedinců, a to 50 nmol/mmol pro muže a 60 nmol/mmol pro ženy (9 horní hranice intervalu spolehlivosti pro každé pohlaví). K definování optimální relativní citlivosti a specificity v uvedeném souboru byla aplikována metoda ROC (receiver operating characteristic) za použití zvýšeného množství pyridinolinu určeného pomocí HPLC jakožto klasifikační metody. Relativní citlivost a specificita jsou uvedeny v tabulce 3. V kontingenční tabulce dvě na dvě je uveden počet jedinců v každé klasifikační skupině (tabulka 7). Tabulka 3 Metra DPD Relativní citlivost 69% Specificita 87% ODKAZY 1. Seyedin SM, Rosen DM. Matrix Proteins of the Skeleton. Curr.Opin.Cell Biol. 1990;2:914919. 2. Delmas PD. Biochemical markers for the assessment of bone turnover. In: Riggs BL, Melton LJ,III (eds): Osteoporosis: etiology, diagnosis, and management. Philadelphia: LippincottRaven Publishers, 1995, pp. 319333. 3. Seibel MJ, Robins SP, Bilezikian JP. Urinary pyridinium crosslinks of collagen. Specific markers of bone resorption in metabolic bone disease. Trends Endocrinol.Metab. 1992;3:263270. 4. Delmas PD, Schlemmer A, Gineyts E, Riis B, Christiansen C. Urinary excretion of pyridinoline crosslinks correlates with bone turnover measured on iliac crest biopsy in patients with vertebral osteoporosis. J.Bone Miner.Res. 1991;6:639644. 5. Eastell R, Colwell A, Hampton L, Reeve J. Biochemical markers of bone resorption compared with estimates of bone resorption from radiotracer kinetic studies in osteoporosis. J.Bone Miner.Res. 1997;12:5965. 6. Colwell A, Russell RG, Eastell R. Factors affecting the assay of urinary 3hydroxypyridinium crosslinks of collagen as markers of bone resorption. Eur.J.Clin.Invest. 1993;23:341349. 7. Riggs BL. Overview of osteoporosis. West.J.Med. 1991;154:6377. 8. Consensus Development Statement. Who are candidates for prevention and treatment for osteoporosis? Osteoporosis Int. 1997;7:16. 9. Bush TL, Wells HB, James MK, Barrett Connor E, Marcus R, Greendale G, Hunsberger S, McGowan J. Effects of Hormone Therapy on Bone Mineral Density: Results from the postmenopausal estrogen/progestin interventions (PEPI) trial. J.Am.Med.Assoc. 1996;276(17):13891396.
10. Hesley RP, Shepard KA, Jenkins DK, Riggs BL. Monitoring estrogen replacement therapy and identifying rapid bone losers with an immunoassay for deoxypyridinoline. Osteoporosis Int. 1998;8:159 164. 11. Chesnut CH,III, McClung MR, Ensrud KE, et al. Alendronate treatment of the postmenopausal osteoporotic woman: Effect of multiple dosages on bone mass and bone remodeling. Am.J.Med. 1995;99:144152. 12. Devogelaer JP, Broll H, CorreaRotter R, et al. Oral alendronate induces progressive increases in bone mass of the spine, hip, and total body over 3 years in postmenopausal women with osteoporosis. Bone 1996;18:141150. 13. Robins SP, Woitge H, Hesley R, Ju J, Seyedin S, Seibel MJ. Direct enzymelinked immunoassay for urinary deoxypyridinoline as a specific marker for measuring bone resorption. J.Bone Miner.Res. 1994;9:16431649. 14. Pratt DA, Daniloff Y, Duncan A, Robins SP. Automated analysis of the pyridinium crosslinks of collagen in tissue and urine using solidphase extraction and reversedphase highperformance liquid chromatography. Anal.Biochem. 1992;207:168175. 15. Reid IR, Ames RW, Evans MC, Gamble GD, Sharpe SJ. Longterm effects of calcium supplementation on bone loss and fractures in postmenopausal women: A randomized controlled trial. Am.J.Med. 1995;98:331335. 16. Centers for Disease Control. Recommendations for prevention of HIV transmission in healthcare settings. MMWR 1987;36 (suppl no. 2S):001. Covered by U.S. Patent Nos. 5,620,861, 5,700, 694, 6,121, 002, and 5,283,197. TECHNICKÁ PODPORA S objednávkou, nebo žádostí o technickou podporu, se, prosím, obraťte na zástupce firmy Quidel na čísle 8005246318 nebo 4086164301, od pondělí do pátku mezi 8:00 a 17:00 (tichomořské časové pásmo). Objednávky lze také faxovat na číslo 4086164310. Mimo území Spojených států Vám služby poskytne Váš místní prodejce. KATALOGOVÉ Č. REF 8007 Metra DPD EIA Kit AUTORIZOVANÝ ZÁSTUPCE Quidel Deutschland GmbH Betrieb Marburg Emilv.BehringStraße 76 Gebäude M 213 35041 Marburg QUIDEL CORPORATION Worldwide Headquarters 10165 McKellar Court San Diego, CA 92121 USA www.quidel.com BIOVENDOR LABORATORNÍ MEDICÍNA A.S. Karásek 1767/1, 621 00 Brno, Česká republika Tel: 549 124 111 Info@biovendor.cz www.biovendor.cz 0263M (2003/11)