Kat.č.: 5539 Pouze pro in vitro diagnostiku PYLORITOP Ag+ 1. Použití PYLORITOP Ag+ je rychlý, imunochromatografický test pro kvalitativní detekci antigenu Helicobacter pylori ve vzorcích lidské stolice. Tento test je určen jako pomůcka při diagnostice infekce Helicobacter pylori. Test je doporučen pro profesionální použití. 2. Souhrn Helicobacter pylori je gramnegativní bakterie, která infikuje sliznici žaludku. Infekce může vést k chronické gastritidě a je predispozicí k žaludečním a duodenálním vředům. Infekce H. pylori je velmi častá a výskyt v populaci se odhaduje na 40 50 % ve vyspělých zemích a 80 90 % populace rozvojových oblastí. K diagnostice infekce H. pylori se využívá několik technik, jak invazivních tak neinvazivních. V neinvazivní diagnostice je používám dechový test s močovinou značenou uhlíkem. Princip testu je založen na detekci značeného oxidu uhličitého, jenž vzniká štěpením substrátu enzymem ureázou, která je jako povrchový protein produkována H. pylori. Sérologické testy jsou založeny na detekci specifických anti-h. pylori protilátek, většinou třídy IgG v krvi pacienta. Jednou s invazivních metod je endoskopická biopsie žaludku k detekci H. pylori speciálním barvením jako je Giemsa, kultivací nebo rychlým ureázovým testem. Tyto metody vyžadují speciální laboratorní vybavení a vyškolený personál. Také kultivační metoda trvá dlouhou dobu k dosažení výsledku. Sérologický přístup zjistí imunitní odpověď pacienta na infekci, ale neumožňují lékaři odlišit aktuální aktivní infekci od infekce již proběhnuté. Kromě toho se během léčby nemění titry protilátek. Základem pro diagnostiku infekce H. pylori testem s fekálním antigenem je detekce všech izotypů přítomných ve vzorku stolice. 3. Princip testu PYLORITOP Ag+ test byl navržen k detekci antigenu ve vzorcích stolice vizuální interpretací barevných proužků vzniklých v testovací kazetě. Testovací kazeta obsahuje membránový proužek, na kterém jsou naneseny protilátky proti H. pylori v oblasti proužku testu (T) a kozí anti-myší protilátky v oblasti kontrolního proužku (C). Anti-H. pylori protilátky konjugované s barevnými částicemi jsou umístěny na konci membrány. Vzorek vzlíná membránou za pomoci nosného pufru a během migrace roztoku membránou se na anti-h. pylori protilátky konjugované s koloidními částicemi zlata naváže antigen H. pylori přítomen ve vzorku stolice. Při migraci této směsi přes oblast T proužku komplex protilátek s antigenem vytvoří viditelnou linii. Pokud H. pylori není ve vzorku přítomen, barevný proužek v testovací oblasti (T) nevznikne. Proto přítomnost barevné linie v oblasti testu (T) znamená pozitivní výsledek. Zabarvení kontrolního bandu C prokazuje, že test funguje správně. 4. Obsah soupravy 10 kazet, zabalených jednotlivě zkumavky na odběr vzorků: každá obsahuje 1,5 ml 0,02 M Tris-HCl a 0,9 % NaCl (s 0,02 % azidu sodného) návod na použití 5. Další potřebný materiál čisté suché kontejnerky nebo nádoby na odběr vzorků stolice kus buničiny k předejití rozstříknutí tekutiny 6. Skladování a stabilita Skladovat v rozmezí 2 30 C. Nemrazit. Používat soupravu před uplynutím doby expirace 7. Bezpečnostní opatření Test je pouze pro profesionální použití a pouze pro in vitro diagnostiku Testovací kazeta musí zůstat v uzavřeném obalu až do doby použití. Nepoužívejte po uplynutí doby expirace. LABOSERV s.r.o., Hudcova 78b, 612 00 Brno, ZP 1/5 verze: 5; 27.2.2012
Nemíchejte zkumavky na odběr vzorků z různých šarží. Se vzorky pacientů zacházejte jako s potenciálním infekčním materiálem. Pufr obsahuje Azid sodný jako konzervační prostředek. Nepoužívejte kovové zkumavky pro přenos reagencií. Tyto reagencie proto nevylévejte do odpadu s kovovým potrubím (nebo je splachujte dostatečným proudem vody) nebezpečí tvorby explozivních azidů kovů. Pacienti by měli při odběru vzorku postupovat přesně podle instrukcí. 8. Odběr vzorků a jejich uchování Odeberte náhodný vzorek stolice do čistého suchého kontejnerku nebo nádoby. Odšroubujte a vyjměte tyčinku z odběrové zkumavky. Dávejte pozor, aby nedošlo k úniku nebo rozstřiku roztoku ze zkumavky. Tyčinkou odeberte vzorek z různých částí vzorku stolice. Vložte tyčinku zpět do zkumavky a řádně zašroubujte víčko. Dejte si pozor, aby nedošlo k ulomení špičky odběrové zkumavky. Vzorek je nyní možné uchovávat 4 týdny při 2 8 C. Vzorek stolice v pufru je stabilní po d obu 15 dnů při teplotě místnosti. 9. Pracovní postup Testovací kazetu, vzorek od pacienta a kontroly by měly být před vlastním testováním vytemperovány na teplotu místnosti (10 30 C). Neo tvírejte sáček dokud nejste nachystáni k provedení testu. Vyjměte kazetu z obalu a použijte, co nejdříve. Nejlepších výsledků dosáhnete, pokud je test proveden do hodiny. Kazetu označte číslem či kódem pacienta. Protřepte odběrovou zkumavku, aby došlo k řádnému rozmíchání vzorku stolice s extrakčním roztokem. Použijte kousek buničiny, otáčivým pohybem ulomte špičku odběrové zkumavky. Držte odběrovou zkumavku vertikálně a naneste 3 kapky roztoku do vzorkovacího políčka testovací kazety. Po 5 minutách odečtěte výsledek. Silně pozitivní výsledky mohou být pozorovány dříve. Déle jak po 20 minutách již neodečítejte! 10. Interpretace výsledků POZITIVNÍ Kontrolní band C je viditelný. Objeví se T band v testovací oblasti (červená barva). Intenzita proužku může být menší než u kontrolního proužku; stále to značí pozitivní výsledek. NEGATIVNÍ Kontrolní band C je viditelný. Testovací proužek T není zbarven. NEPLATNÝ Test není platný, pokud není viditelný po pěti minutách kontrolní proužek. Test se nezdařil nebo nebyl proveden správně pracovní postup. Ověřte pracovní postup a zopakujte test s novou testovací kazetou. LABOSERV s.r.o., Hudcova 78b, 612 00 Brno, ZP 2/5 verze: 5; 27.2.2012
11. Kontrola kvality Kontrola procedury je součástí testu. Objevení barevného proužku v kontrolní oblasti (C) je známkou správného provedení testu a funkčnosti kazety. Jasné pozadí testovacího okénka je považováno za vnitřní negativní kontrolu. Nicméně, při testování vzorků stolice se může pozadí zbarvit mírně nažloutle vzhledem k původní barvě stolice. Toto je přijatelné, pokud to nenarušuje odečítání výsledků testu. Test je neplatný, pokud pozadí není jasné a zakrývá čtení výsledku. 12. Limitace testu Tato testovací souprava je používána pro kvalitativní detekci antigenu H. pylori ve vzorcích lidské stolice. Pozitivní výsledek značí přítomnost antigenu H. pylori ve vzorcích stolice Jestliže je získán negativní nebo sporný výsledek, test by měl být zopakován na nové kazetě s jiným čerstvě získaným vzorkem stolice Jako u všech diagnostických testů, konečná klinická diagnóza by neměla být dělána na základě jednotlivého výsledku testu, ale měla by být provedena lékařem pouze po vyhodnocení všech zřejmých klinických a laboratorních nálezů. 13. Funkčnost testu 1. Detekční limit Kultura bakterií H. pylori byla sonikována, centrifugována a byla stanovena koncentrace proteinu. Takto připravený referenční antigen H. pylori byl rozředěn v PBS-BSA pufru a otestován dle návodu k soupravě. ng/ml 256 128 64 32 16 8 4 2 0 výsledek + + + + + + + 0 0 Zjistili jsme, že za stanovených podmínek, s použitím referenčního antigenu Helicobacter pylori je detekční limit 4 8 ng/ml. 2. Hodnocení specificity a sensitivity Použití myších monoklonálních protilátek při vývoji soupravy PYLORITOP Ag+ zaručuje vysokou míru specificity pro antigen Helicobacter pylori. Na klinické srovnání byly použity vzorky stolice z nemocnic, diagnóza byla stanovena na základě klinického hodnocení. První malé hodnocení vyšlo následovně: PYLORITOP Ag+ Klinické hodnocení + - Celkem + 11 1 12-0 8 8 Celkem 11 9 20 Výsledky testu PYLORITOP Ag+ u vzorků ověřených klinickým hodnocením: Senzitivita > 99 % Specificita 89 % Pozitivní prediktivní hodnota 92 % Negativní prediktivní hodnota > 99 % Korelace 95 % LABOSERV s.r.o., Hudcova 78b, 612 00 Brno, ZP 3/5 verze: 5; 27.2.2012
3. Srovnávací studie Provedlo se srovnání testu PYLORITOP Ag+ (AllDiag) a jiných komerčních rychlých testů na detekci antigenu H. pylori. Bylo paralelně vyšetřeno 12 vzorků stolice podle daných instrukcí k soupravám. Pacienti měli gastrointestinální příznaky (like gastritis). PYLORITOP Klinické hodnocení Ag+ + - Celkem + 7 1 8-0 4 4 Celkem 7 5 12 jiný rychlý Klinické hodnocení test + - Celkem + 7 2 9-0 3 3 Celkem 7 5 12 PYLORITOP Ag+ Jiný komerční rychlý test na H.pylori Ag Senzitivita 100 % (> 99 %) 100 % (> 99 %) Specificita 80 % 60 % Pozitivní prediktivní hodnota 87,5 % 77,78 % Negativní prediktivní hodnota 100 % (> 99 %) 100 % (> 99 %) Korelace 91,67 % 83,33 % Závěr: Výsledky uvedené v obou tabulkách ukazují 100% sensitivitu (> 99 %) u testu PYLORITOP Ag+ a jiného rychlého testu. Tyto výsledky dále ukazují, že specificita, PPV a korelace u testu PYLORITOP Ag+ (AllDiag) je lepší než u jiného komerčního rychlého testu. Při detekci Helicobacter pylori je udávána 95 % shoda s jiným komerčním testem. Protilátky použité k vývoji testu PYLORITOP Ag+ rozpoznávají epitopy přítomné u antigenů nalezených ve vzorcích stolice pacientů, stejně jako u antigenu přípraveného z kultury bakterií. 14. Literatura 1.Buck, G.E., Gourley, W.K., Lee, W.K., Subramanyam, K., Latimer, J.M. and DiNuzzo, A.R.: Relation of Campylobacter Pyloridis to Gastritis and Peptic Ulcers. J. infect. Dis., Vol. 153 (1996): 664 9. 2. Martin j. Blaser.: Helicobacter pylori gastric diseases. BMJ, 316 (1998): 1507 10. 3. Tytgat, G.N.J., Axon, A.T.R., Dizon, M.F., Graham, D.Y., Lee, A. and Marshall, B.J.: Helicobacter Pylori: A Causal Agent in Peptic Ulcer Disease?. J. Gastroenterol. Hepatol., Vol. 6 (1991): 103 140. 4. Bruce E. Dunn, Hartjey Cohen and Martin J.Blasser.: Helicobacter pylori. Clin. Microbiol. Rev., 10 (4), Oct (1997): 720 741. 5. Pronovost, A.D., Rose, S.L., Pawlak, J.W., et al.: Evaluation of a New Immunodiagnostic Assay for Helicobacter Pylori Antibody Detection; Correlation with Histophatological and Microbiological Results. J. Clin. Microbiol., Vol. 32 (1994): 46. LABOSERV s.r.o., Hudcova 78b, 612 00 Brno, ZP 4/5 verze: 5; 27.2.2012
15. Kontakty Výrobce: ALL.DIAG 10, rue Ettore Bugatti BP6 67038 Strasbourg Cedex 2 tel: 03 88 78 80 88, fax: 03 88 78 76 78 www.alldiag.com; info@alldiag.com Distributor: LABOSERV s.r.o. Hudcova 78 b, 612 00 Brno Tel: +420 541 243 113, Fax: +420 541 243 114 email: laboserv@laboserv.cz http://www.laboserv.cz LABOSERV s.r.o., Hudcova 78b, 612 00 Brno, ZP 5/5 verze: 5; 27.2.2012