Vyšetření albuminurie vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií 1,2 Fořtová M., 1 Klapková E., 1 Kotaška K., 1 Průša R. 1 Ústav lékařské chemie a klinické biochemie 2. LF UK a FN Motol, 2 Klinika nefrologie 1. LF UK a VFN
Albuminurie časná predikce diabetické nefropatie rizikový faktor kardiovaskulárních onemocnění (nejen u diabetiků) nefropatie u hypertenze časná diagnostika nefropatie jiného původu (hereditární, renovaskulární, infekční nefropatie) kontrola těhotenského diabetu patologické těhotenství (preeklampsie)
Typ vzorku mikroalbuminurie Sběr moči 30-300 mg/24hod Časovaný vzorek Náhodný vzorek 20-200 ug/min 2,8-28 g/mol kreat * (25-250 mg/g kreat) * M >2,5 g/mol, Ž > 3,5 g/mol Prokázaná mikroalbuminurie : dosažení uvedených hodnot ve dvou ze tří po sobě následujících vzorcích v intervalu 3-6 měsíců proteinurie 1g/24h 0,1 g proteinu/ mmol kreat
Metody stanovení albuminurie Imunoturbidimetrie, imunonefelometrie RIA, ELISA Elektroforéza HPLC LC-MS/MS Lieske, J.C., Bondar, O., Miller, W.G., Bachmann, L.M., Narva, A.S. et al. A reference system for urinary albumin: current status. Clin. Chem. Lab. Med. CCLM FESCC, 2013, 51(5), p. 981-989.
Východisko Mnohými studiemi bylo zjištěno, že albuminurie stanovená vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií je především v pásmu mikroalbuminurie až 4x vyšší než albuminurie stanovená rutinními imunochemickými metodami. Rozdíl mezi metodami se vysvětluje dvěma zcela odlišnými způsoby: 1) sníženou imunoreaktivitou močového albuminu, 2) nespecifičností HPLC metody pro vyšetření albuminurie. Comper, W.D., Osicka, T.M., Clark, M., Maclssac, R.J., Jerums, G. Earlier detection of microalbuminuria in diabetic patients using a new urinary albumin assay. Kidney Int., 2004, 65, p.1850-1855. Osicka, T.M., Comper W.D. Characterization of immunochemically nonreactive urinary albumin. Clin.Chem., 2004, 50, p.2286-2291. Magliano, D.J., Polkinghorne, K.R., Barr, E.L.M. et al. HPLC-detected albuminuria predicts motrality. J.Am.Soc.Nephrol., 2007, 18, p.3171-3176. Sviridov, D., Meilinger, B., Drake S.K., Hoehn, G.T., Hortin G.L. Coelution of other proteins with albumin during site-exclusion HPLC: Implications for analysis of urinary albumin. Clin.Chem., 2006, 52, p.389-397.
Imunochemické metody hrubě podhodnocují koncentrace albuminu v moči Příčinou ztráta části imunoreaktivity albuminu???
Ztráta imunoreaktivity albuminu: fragmenty albuminu určitý podíl intaktního albuminu (Mr 66 500) při průchodu proximálními tubuly ledvin proteolyticky štěpen lyzozomálními enzymy na fragmenty o Mr 500-15000 nicked albumin konformačně změněný albumin (v důsledku přítomnosti fragmentů albuminu), velikost molekuly zůstává nezměněna, pravděpodobně dojde ke ztrátě některých disulfidových můstků
Rozdíl imunochemické metody vs. HPLC podstatně výraznější u diabetiků než u nediabetiků.
Detekce zvýšených koncentrací imunochemicky nereaktivního albuminu v moči metodou HPLC umožní diagnostikovat diabetickou nefropatii v průměru o 4 roky dříve u DM I. typu a o 2,5 roku u DM II. typu Mikroalbuminurie zachycená HPLC (imunochemicky negativní) koreluje se zvýšenou mortalitou též u jedinců z obecné populace tito jedinci by mohli významně profitovat z běžných preventivních opatření Comper, W.D., Osicka, T.M., Jerums, G. High prevalence of immuno-unreactive albumin in urine of diabetic patients. Am.J.Kidney Dis., 2003, 41, p.336-342. Comper, W.D., Osicka, T.M., Clark, M., Maclssac, R.J., Jerums, G. Earlier detection of microalbuminuria in diabetic patients using a new urinary albumin assay. Kidney Int., 2004, 65, p.1850-1855. Osicka, T.M., Comper W.D. Characterization of immunochemically nonreactive urinary albumin.clin.chem., 2004, 50, p.2286-2291. Magliano, D.J., Polkinghorne, K.R., Barr, E.L.M. et al. HPLC-detected albuminuria predicts motrality. J.Am.Soc.Nephrol., 2007, 18, p.3171-3176.
Kontroverzní zjištění: zvýšené hodnoty albuminu získané HPLC nejsou způsobeny imunochemicky nereaktivním albuminem, ale koelucí některých močových proteinů z kolony (α-1-kyselý glykoprotein, transferin, α-1-antitrypsin, hemopexin ) HPLC tedy není schopna rozlišit albumin od těchto močových proteinů a poskytuje falešně zvýšené výsledky Sviridov, D., Meilinger, B., Drake S.K., Hoehn, G.T., Hortin G.L. Coelution of other proteins with albumin during site-exclusion HPLC: Implications for analysis of urinary albumin. Clin.Chem., 2006, 52, p.389-397.
Cíl studie Zavést HPLC metodu pro stanovení albuminurie. Potvrdit či vyvrátit tvrzení, že HPLC poskytuje falešně vyšší hodnoty albuminurie díky koeluci dalších bílkovin (α-1-kyselý glykoprotein, transferin, α-1-antitrypsin, hemopexin ) z chromatografické kolony. Testovat hypotézu o přítomnosti imunochemicky nereaktivního albuminu. Porovnat hodnoty albuminurie stanovené imunoturbidimetricky a chromatograficky v pacientských vzorcích.
Podmínky chromatografické analýzy Složení mobilní fáze: složka A: voda, složka B: acetonitril, složka C: 100 mm NaH 2 PO 4, složka D: 1 % trifluoroctová kyselina Kontinuální gradient mobilní fáze Průtok mobilní fáze 2 ml/min Teplota analýzy 22 ºC UV detekce při 280 nm Trvání analýzy: 8 minut Kolona Zorbax 300 SB-C3, 3,5 μm, 4,6 cm x 50 mm (Agilent Technologies, USA)
Kapalinový chromatograf Agilent 1200, Agilent Technologies, USA
Analýza standardního vzorku albuminu
Analýza směsného vzorku standardů bílkovin
Analýza standardního vzorku α-1-antitrypsinu
Analýza standardního vzorku α-1-antichymotrypsinu
Analýza standardního vzorku prealbuminu
Analýza směsného vzorku standardů albuminu (o koncentraci 100 mg/l) a prealbuminu (o koncentraci 50 mg/l)
Analýza pacientské moči PŘÍKLAD 1 albuminurie IT: 46,3 mg/l HPLC: 60,0 mg/l
Analýza pacientské moči PŘÍKLAD 2 albuminurie IT: 213,0 mg/l HPLC: 280,8 mg/l
Analýza 1. směsného vzorku moči Směsný vzorek připraven z 30 IT negativních močí (4,4 mg/l), přidán standardu albuminu, výsledná koncentrace stanovená IT: 79,1 mg/l HPLC: 82,5 mg/l + 4 %
Analýza 2. směsného vzorku moči Směsný vzorek připraven z 30 IT mikroalbuminurických vzorků, koncentrace stanovená IT: 79,5 mg/l HPLC: 99,9 mg/l + 26 %
Soubor pacientů N = 1092, 595 mužů a 497 žen věk 43,3 25,6 let 636 diabetiků a 456 nediabetiků
albuminurie [mg/l] Albuminurie IT vs. HPLC 80 p < 0,0001 p < 0,0001 p < 0,0001 70 60 41,2 ± 27,6 50 40 31,6 ± 16,9 20,0 ± 15,0 14,6 ± 19,3 25,3 ± 21,1 30,1 ± 23,6 30 20 10 0 celý soubor diabetici nediabetici imunoturbidimetrie HPLC Median ± SEM, test normality D Agostina a Pearsona, Mann-Whitneyův test
albumin/kreatinin [mg/mmol] Poměr albumin/kreatinin u jednotlivých pacientů s imunoturbidimetricky stanovenou normoalbuminurií 9 8 7 6 5 4 mikroalbuminurie 3 2 1 0 0 100 200 300 400 500 číslo pacie nta imunoturbidimetrie HPLC normoalbuminurie
Závěr I Zavedenou metodou lze účinně separovat α-1-kyselý glykoprotein, transferin a hemopexin. Za testovaných podmínek nedošlo k eluci α-1-antitrypsinu ani α-1-antichymotrypsinu, tyto bílkoviny tedy s albuminem neinterferují. Eluční křivka prealbuminu se štěpí na několik píků, z nichž některé z nich s albuminem koeluují. Vzhledem k nízkým sérovým a močovým koncentracím prealbuminu lze usuzovat, že je tato interference klinicky nevýznamná. Tyto výsledky a výsledky analýz směsných vzorků moči nasvědčují na existenci imunochemicky nereaktivního albuminu.
Závěr II Byl zjištěn statisticky významný rozdíl mezi metodami v pacientských vzorcích moči, a to jak u diabetiků, tak i u nediabetiků, nejvýznamnější v oblasti imunoturbidimetricky zjištěné normoalbuminurie. Do oblasti HPLC zjištěné mikroalbuminurie se posunulo 30 % pacientů s imunoturbidimetricky zjištěnou normoalbuminurií.
Závěr III Naše výsledky svědčí pro vyšší senzitivitu HPLC metody pro zachycení mikroalbuminurie. Nepotvrdili jsme nespecifičnost této metody. V budoucnu by vyšetření albuminurie metodou HPLC mohlo najít uplatnění u vybraných rizikových skupin pacientů. Pro zavedení do rutinní praxe však nepřichází hlavně pro svoji časovou náročnost a nutnost obsluhy pouze vysoce proškoleným personálem s dostatečnou praxí v úvahu.
Děkuji vám za pozornost