Dako EnVision+ System- HRP Labelled Polymer Anti-Rabbit Kód K4002 15 ml Kód K4003 110 ml Použití In vitro diagnostikum. Tento návod platí pro výrobek Dako EnVision + System-HRP. Tento kit je určen k použití v kombinaci s primárními králičími protilátkami dodanými uživatelem ke kvalitativní identifikaci antigenů pomocí světelné mikroskopie v normálních a patologických tkáních zalitých do parafínu, kryostaticky zpracovaných tkáních nebo buněčných preparátech. Používat lze tkáně zpracované pomocí různých fixačních prostředků včetně etanolu, B-5, Bouinova fixačního roztoku, vodného roztoku formaldehydu a zinku a neutrálního pufrovaného formalíu. Imunohistochemické postupy jsou uvedeny v Obecných pokynech imunohistochemického barvení nebo v Pokynech k detekčního systému, kde naleznete: (1) princip metody, (2) potřebné materiály, jež nejsou součástí dodávky, (3) podmínky skladování, (4) popis přípravy vzorků, (5) postupy barvení, (6) kontrolu kvality, (7) odstraňování potíží, (8) interpretaci barvení a (9) obecná omezení. Souhrnné informace a vysvětlení Princip metody Dodané činidlo Systém EnVision+ Systém-HRP je dvoustupňová imunohistochemická metoda barvení. Tento systém je založen na polymeru značeném křenovou peroxidázou (HRP), konjugováaném se sekundárními protilátkami. Značený polymer neobsahuje avidin ani biotin. V důsledku toho jsou eliminovány nebo podstatně sníženy nespecifické výsledky barvení, způsobené endogenní avidin-biotinovou aktivitou v játrech, ledvinách, lymfoidních tkáních a kryostatických řezech. Činidla v systému EnVision + System-HRP jsou připravena k okamžitému použití. Tento systém je mimořádně citlivou metodou a v důsledku toho jsou optimální ředění primárních protilátek až 20 vyšší než v tradičních technologiích s využitím komplexu peroxidáza antiperoxidáza (PAP), a jsou mnohonásobně vyšší než v tradičních metodách, jako je ABC nebo metoda používající značený streptavidin-biotin (LSAB). Tento protokol nabízí vylepšený systém generování signálu sloužících k detekci antigenů přítomných v nízkých koncentracích nebo u primárních protilátek s nízkým titrem. Primární protilátky vytvářené králíkem se značeným polymerem dobře reagují. Interpretace jakéhokoliv pozitivního obarvení nebo jeho nepřítomnosti by měla být doplněna morfologickými a histologickými studiemi s použitím odpovídajících kontrol. Endogenní aktivita peroxidázy je utlumena inkubací vzorku s vhodným činidlem, blokujícím tyto endogenní aktivity. Vzorek se poté inkubuje se zředěnou králičí primární protilátkou s vhodnými charakteristikami. Poté následuje inkubace se značeným polymerem, skládající se ze dvou po sobě jdoucích třicetiminutových inkubací. Je třeba poznamenat, že u protilátek, jež vyžadují enzymatické natrávení nebo odmaskování cílové struktury, může být potřebné zvýšit inkubační dobu primární protilátky a značeného polymeru o 5 až 10 minut. Barvení je skončeno po 5 10 minutách inkubace s vhodnou kombinací substrát-chromogen, Kód K4002: Následující přípravek stačí pro 150 tkáňových řezů při spotřebě 100 µl na jeden řez. Množství Popis 1 15 ml Značený polymer: Peroxidázou značený polymer konjugovaný s kozími imunoglobuliny proti králičím protilátkám v pufru Tris-HCl s obsahem stabilizačního proteinu a antimikrobiálního činidla. Kód K4003: Následující přípravek stačí pro 1100 tkáňových řezů při spotřebě 100 µl na jeden řez. Množství Popis 1 110 ml Značený polymer: Peroxidázou značený polymer konjugovaný s kozími imunoglobuliny proti králičím protilátkám v pufru Tris-HCl s obsahem stabilizačního proteinu a antimikrobiálního činidla. (107942-004) 302063CZ_003 str. 1/6
Potřebný materiál, který není součástí dodávky Absorpční materiál pro otírání Kontrolní tkáň, pozitivní a negativní Kontrastní barvivo; na vodné bázi, například Mayerův hematoxylin nebo Mayerův hematoxylin modifikovaný podle Lillieho kód S3309 Krycí sklíčka Destilovaná voda Činidlo blokující endogenní peroxidázu, např. Dual Endogenous Enzyme Block (kód S2003) Etanol, absolutní a 95% Světelný mikroskop (20 800 ) Fixační média například Glycergel Mounting Medium (kód C0563) nebo Faramount, Aqueous Mounting Medium, Ready-to-use (kód S3025), nebo bezvodé permanentní fixační médium Ultramount (kód S1964). Primární protilátky a negativní kontrolní činidlo Podložní sklíčka potažená poly-l-lysinem nebo silanizovaná (kód S3003) Barvicí nádobky nebo lázně Roztok substrát-chromogen, například AEC+ Substrate-Chromogen (kód K3469, 110 ml, k okamžitému použití) nebo Liquid DAB+ (kód K3468). Časovač (s možností nastavení intervalu 3 40 minut) Promývací láhve Roztok promývacího pufru Xylen, toluen nebo náhrady xylenu Doplňkové materiály, které nejsou součástí dodávky Hydroxid amonný, 0,015 mol/l, zředěný na 0,037 mol/l PAP Pen (kód S2002) Upozornění Uchovávání 1. Pouze pro profesionální uživatele. 2. Činidla nepoužívejte po uplynutí doby použitelnosti uvedené pro předepsaný způsob uchovávání. Jsou-li činidla uchovávána v jiných podmínkách, než je uvedeno na příbalovém letáku, musí uživatel provést jejich validaci. 3. Nenahrazujte činidla činidly z jiných šarží nebo ze souprav jiných výrobců. 4. Enzymy a substrát-chromogeny mohou být nepříznivě ovlivněny působením nadměrného světla. Komponenty neuchovávejte v prostředí se silným osvětlením, jako například na přímém slunečním světle, ani za takových podmínek neprovádějte barvení. 5. Jiné časy inkubace a inkubační teploty než ty, které jsou zde uvedeny, mohou být příčinou chybných výsledků. Jakékoli změny tohoto druhu musí uživatel validovat. 6. Stejně jako u jiných výrobků z biologických zdrojů i zde dodržujte správné postupy zacházení. 7. Aby nedošlo ke kontaktu s očima a kůží, používejte vhodné pomůcky osobní ochrany. 8. Nespotřebovaný roztok je třeba zlikvidovat v souladu s místními, celostátními, případně federálními předpisy. Přípravek EnVision+, HRP je třeba uchovávat při teplotě 2 8 C. Nezmrazujte. Nepoužívejte po uplynutí doby použitelnosti uvedené na nádobkách s činidly a na etiketě produktu. Změna vzhledu kteréhokoliv činidla (například srážení) může znamenat nestabilitu nebo zhoršení kvality. V takových případech činidla nepoužívejte. Nestabilita výrobku není signalizována žádnými zřetelnými příznaky. Proto je třeba testovat současně se vzorky pacientů i pozitivní a negativní kontroly. Pokud dojde k nečekanému zbarvení, které nelze vysvětlit odchylkami v laboratorních postupech, a máte-li podezření na problém s danou sadou, kontaktujte Technickou podporu společnosti Dako. (107942-004) 302063CZ_003 str. 2/6
Příprava činidel Před barvením je vhodné připravit si následující činidla. Roztok promývacího pufru Doporučeným promývacím pufrem pro automatickou a ruční imunochemickou detekci je TBST, 0,05 mol/l fyziologický roztok pufrovaný Tris s Tween 20 (kód S3006). Jako promývací pufr pro ruční barvení je vhodný rovněž TBS, 0,05 mol/l fyziologický roztok pufrovaný Tris (kód S1968) a PBS, 0,02 mol/l fyziologický roztok pufrovaný fosfátem. Nedoporučuje se používat roztoky promývacích pufrů obsahující azid sodný. Azid sodný inaktivuje křenovou peroxidázu (HRP) a výsledkem je negativní zbarvení. Nepoužitý pufr uchovávejte při teplotě 2 8 C. Jestliže se pufr začne zakalovat, zlikvidujte ho. K promývání činidla blokujícího peroxidázu, substrátu a kontrastního barviva lze použít destilovanou vodu. Primární protilátka K použití s vysoce citlivými detekčními systémy Dako Plus jsou optimalizovány a doporučeny protilátky NP- Series "Plus" typu "ready-to-use". Od společnosti Dako si lze rovněž objednat koncentrované protilátky. Optimalizaci koncentrovaných protilátek musí provést koncový uživatel. Ředění je třeba připravit pomocí ředidla protilátek (Antibody Diluent, kód S0809) nebo ředidla s obsahem pufru 0,05 mol/l Tris-HCl s 1 % hovězím sérovým albuminem (BSA). K použití s vysoce citlivými detekčními systémy Dako Plus nejsou optimalizovány protilátky Dako N-Series typu "ready-to-use". Pro většinu primárních protilátek používaných s tímto kitem je dostačující inkubační dobou 30 minut. Negativní kontrolní činidlo V ideálním případě negativní kontrolní činidlo obsahuje protilátku, jež nevykazuje žádnou specifickou reaktivitu s lidskými tkáněmi nebo s normálním / neimunním sérem ve stejné matrix / roztoku jako zředěná primární protilátka. Negativní kontrolní činidlo by mělo být stejné podtřídy a živočišného druhu jako primární protilátka, mělo by být zředěno na stejnou koncentraci imunoglobulinu nebo proteinu jako zředěná primární protilátka a mělo by být ředěno pomocí stejného roztoku pro ředění. Doba inkubace negativního kontrolního činidla by měla odpovídat době inkubace primární protilátky. Při použití protilátek Dako NP-Series Plus typu "ready-to-use" se doporučuje používat jako negativní kontrolní činidlo Universal Negative Control+, které je optimalizováno pro použití s králičími (kód NP001) protilátkami NP-Series Plus typu "ready-to-use". Konkrétní informace o přípravě negativního kontrolního činidla naleznetev části Kontrola kvality. Kontrastní barvivo Barevný výsledný produkt barvicí reakce je nerozpustný v alkoholu a lze ho používat s kontrastními barvivy na bázi alkoholu nebo na vodné bázi (například s Mayerovým hematoxylinem nebo Mayerovým hematoxylinem modifikovaným podle Lillieho kód S3309). Kontrastní barvení hematoxylinem by mělo být následováno důkladným propláchnutím destilovanou vodou a ponořením sklíček s tkáňovým řezem do lázně s 0,037 mol/l čpavku nebo podobného modřicího činidla. Vodný roztok amoniaku 0,037 mol/l se připraví smícháním 2,5 ml (koncentrovaného) 0,015 mol/l hydroxidu amonného s 1 litrem vody. Nepoužitý 0,037 mol/l amoniak lze skladovat za pokojové teploty (20 25 C) v dobře uzavřené nádobě po dobu až 12 měsíců. Alternativní metody kontrastního barvení jsou uvedeny v pokynech výrobce. Fixační prostředky Pro fixaci ve vodném médiu doporučujeme fixační roztok Glycergel Mounting Medium (kód C0563) nebo Faramount, Aqueous Mounting Medium, ready-to-use (kód S3025). Glycergel se musí před použitím zahřát nejméně na 50 C. Použít lze také bezvodé permanentní fixační médium (Ultramount, kód S1964). Příprava vzorku Informace naleznete v části Obecné pokyny k imunohistochemickému barvení anebo ve specifikaci protilátek. Před IHC barvením musí být tkáně fixovány a zpracovány. Fixace brání autolýze a rozkladu zkoumaných tkání, uchovává antigenní vlastnosti, zvyšuje index lomu součástí tkáně a zvyšuje odolnost buněčných prvků při zpracování tkání. Zpracování tkání zahrnuje dehydrataci, odstranění dehydratačních činidel, infiltraci zalévacích médií, zalévání a řezání tkání. Nejběžnější fixační prostředky k přípravě tkání pro imunohistochemické barvení jsou uvedeny ve Všeobecných pokynech pro imunohistochemické barvení. Jedná se však pouze o obecné pokyny. Optimální postupy musí stanovit a ověřit uživatel. (107942-004) 302063CZ_003 str. 3/6
Postup barvení Poznámky k postupu Uživatel by si měl před použitím pečlivě přečíst tyto pokyny a důkladně se seznámit s obsahem produktu. Toto činidlo a poskytnuté instrukce byly zpracovány tak, aby poskytovaly optimální výsledky, Další ředění činidla nebo změna inkubační doby nebo teploty mohou přinést chybné výsledky. Všechna činidla by měla být před imunobarvením ohřátá na pokojovou teplotu (20 25 C). Podobně platí, že všechny inkubace by se měly provádět za pokojové teploty. Během procesu barvení nesmí tkáňové řezy vyschnout. U vyschlých tkáňových řezů může docházet ke zvýšenému nespecifickému obarvení. Sklíčka vystavená průvanu zakryjte. Při použití prodloužené inkubace umístěte tkáně do vlhkého prostředí. Citlivost systému EnVision+ System, HRP, lze dále zvýšit prodloužením inkubační doby kroku 2 a 3 o 5 10 minut. Protokol barvení KROK 1 PEROXIDASE BLOCK (ČINIDLO BLOKUJÍCÍ PEROXIDÁZU) Poklepáním odstraňte přebytek pufru. Pomocí materiálu, jež nezanechává vlákna (například gázové tampony nebo tampony Kimwipe ) pečlivě otřete okolí vzorku, aby se odstranila zbývající tekutina a činidla zůstala pouze ve zpracovávané oblasti. Na vzorek naneste z láhve 1 dostatek bloku peroxidázy tak, aby byl vzorek pokrytý. Inkubujte 5 minut (±1 minuta). Jemně opláchněte destilovanou vodou nebo pufrovým roztokem z promývací láhve (proud promývacího roztoku nesměřujte přímo na tkáň) a vzorek umístěte do čerstvé pufrové lázně. KROK 2 PRIMÁRNÍ PROTILÁTKANEBO NEGATIVNÍ KONTROLNÍ ČINIDLO Poklepáním odstraňte přebytek pufru a otřete sklíčka stejným způsobem jako v předchozím kroku. Na vzorek naneste dostatečné množství optimálně ředěné primární protilátky nebo negativního kontrolního činidla, aby byl vzorek pokryt. Inkubujte 30 minut (±1 minuta). Jemně opláchněte pufrovým roztokem z promývací láhve (proud promývacího roztoku nesměřujte přímo na tkáň) a vzorek umístěte do čerstvé pufrové lázně. Jestliže je třeba proces barvení přerušit, lze sklíčka uchovat po inkubaci primární protilátky (krok 2) v pufrové lázni až po dobu jedné hodiny za pokojové teploty (20 25 C), aniž by tím byl nepříznivě ovlivněn proces barvení. KROK 3 POLYMER ZNAČENÝ PEROXIDÁZOU Poklepáním odstraňte přebytek pufru a otřete sklíčka stejným způsobem jako v předchozím kroku. Na vzorek naneste z láhve 2 dostatečné množství značeného polymeru tak, aby byl vzorek pokrytý. Inkubujte 30 minut (±1 minuta). Sklíčka opláchněte stejně jako v kroku 2. KROK 4 SUBSTRÁT-CHROMOGEN Sklíčka otřete stejně jako v předchozích krocích. Na vzorek naneste dostatek substrát-chromogen tak, aby byl vzorek pokrytý. Inkubujte po dobu 5 10 minut. Jemně opláchněte destilovanou vodou z promývací láhve (proud vody nesměřujte přímo na tkáň). Použitý roztok substrát-chromogen shromažďujte v nádobě na nebezpečné materiály, aby mohl být zlikvidován náležitým způsobem. KROK 5 KONTRASTNÍ BARVIVO HEMATOXYLIN (volitelný krok) Sklíčka ponořte do lázně vodného hematoxylinu (kód S3309). Délka inkubace závisí na koncentraci použitého hematoxylinu. Sklíčka jemně opláchněte v lázni s destilovanou vodou. Sklíčka 10krát ponořte do lázně s 0,037 mol/l čpavku nebo podobného modřicího činidla. Sklíčka oplachujte v lázni s destilovanou nebo deionizovanou vodou po dobu 2 5 minut. KROK 6 FIXACE Vzorky lze fixovat na sklíčka a překrýt krycími sklíčky pomocí vodného fixačního média, například Glycergel Mounting Medium (kód C0563) nebo Faramount (kód S3025), nebo pomocí nevodného permanentního fixačního média Ultramount (kód S1964). Sklíčka lze také dehydratovat a fixovat trvale. Kontrola jakosti Rozdíly ve zpracování tkání a v technických postupech v uživatelově laboratoři mohou způsobit podstatné odchylky výsledků, jež vyžadují pravidelné kontroly v rámci daného pracoviště. Další informace naleznete v pokynech týkajících se kontroly kvality Certifikačního programu organizace Colege of American Pathologists (CAP) pro imunohistochemii a v literárních odkazech 1 až 3. Podrobnosti o citlivosti a imunoreaktivitě jsou uvedeny ve specifikacích jednotlivých primárních protilátek. Další informace o pozitivních a negativních kontrolách naleznetev části Obecné pokyny k imunohistochemickému barvení. Interpretace barvení Pokyny k interpretaci jsou uvedeny v čýsti Obecné pokyny k imunohistochemickému barvení. (107942-004) 302063CZ_003 str. 4/6
Specifická omezení produktu Obarvení tkáně závisí na správné manipulaci a zpracování tkání před barvením. Nesprávná fixace, zmražení, rozmražení, promývání, sušení, ohřívání, řezání nebo kontaminace jinými tkáněmi nebo kapalinami mohou způsobit vnzik artefaktů, zachycování protilátek nebo falešně negativní výsledky. Použití starých nebo nepufrovaných fixačních prostředků nebo vystavení tkání nadměrnému teplu (nad 60 C) během zpracování může mít za následek sníženou citlivost barvení. V hemoproteinech, jako je například hemoglobin, myoglobin, cytochrom a kataláza, v neutrofilech, monocytech a eosinofilech lze zjistit endogenní aktivitu peroxidázy nebo pseudoperoxidázy. 4,5 Tuto aktivitu lze potlačit inkubací vzorků s činidlem blokujícím peroxidázu (Peroxidase Block) po dobu pěti minut ještě před aplikací primární protilátky. Krevní nátěry a nátěry kostní dřeně a zmražené tkáňové řezy lze rovněž zpracovat pomocí tohoto činidla. Tento postup však neodstraní červenohnědé zbarvení hemoproteinů. Alternativně lze použít také roztok metanolu a peroxidu vodíku.. Tímto postupem se však mohou některé antigeny denaturovat. Tkáně osob infikovaných virem hepatitidy B a obsahující povrchový antigen viru hepatitidy B (HBsAg) se mohou nespecificky barvit křenovou peroxidázou. 6 Normální / neimunní séra ze stejného živočišného druhu, použitá jako sekundární antiséra v blokačních krocích, mohou způsobit falešně negativní nebo falešně pozitivní výsledky, dané působením autoprotilátek nebo přirozených protilátek. Činidla dodávaná v tomto kitu byla optimálně naředěna. Další ředění může mít za následek ztrátu schopnosti detekovat antigeny. Odstraňování potíží Problém Pravděpodobná příčina Navrhovaná akce 1. Žádné sklíčok není obarveno 1a. Činidla nebyla použita ve správném pořadí. 1b. Azid sodný v pufrové lázni. 1a. Zkontrolujte použití činidel. 1b. Použijte čerstvý pufr bez obsahu azidu 2.Všechna sklíčka jsou obarvena slabě 3.Všechna sklíčka mají nadměrné obarvené pozadí 2a. Po promytí zůstalo v řezech příliš mnoho roztoku. 2b. Sklíčka nebyla dostatečně dlouho inkubována s protilátkami nebo směsí substrátu. 3a. Vzorky obsahují vysokou aktivitu endogenní peroxidázy. 3b. Parafin nebyl úplně odstraněn. 3c. Sklíčka nejsou řádně opláchnuta. 3d. Rychlejší reakce substrátu než obvykle například následkem příliš vysoké teploty prostředí. 3e. Během procesu barvení sklíčka zaschla. 3f. Nespecifické navázání činidel ke tkáňovému řezu. 3g. Protilátky jsou příliš koncentrované. sodného. 2a. Jemným poklepáním odstraňte přebytek roztoku a poté otřete okolí vzorku. 2b. Zkontrolujte doporučené inkubační doby. 3a. Použijte delší inkubační dobu bloku peroxidázy, láhev 1. 3b. Použijte čerstvou xylenovou nebo toluenovou lázeň. Jestliže se barví několik sklíček najednou, je třeba, aby druhá xylenová lázeň obshaovala čerstvý xylen. 3c. V pufrových lázních a promývacích lahvích použijte čerstvé roztoky. Alternativně použijte TBST 0,05 mol/l pufr Tris, s obsahem 0,3 mol/l NaCl, a 0,1 % Tween (kód S3306). 3d. Použijte kratší inkubační dobu v roztoku substrát chromogen. 3e. Použijte vlhkou komůrku. Před aplikací činidla otřete vždy jen tři až čtyři sklíčka najednou. 3f. Použijte blokovací roztok obsahující irelevantní protein. 3g. Viz vyšší ředění primární protilátky. POZNÁMKA: Jestliže daný problém nelze připsat žádné z výše uvedených příčin, nebo jestliže navrhovaná nápravná akce jako řešení problému selže, vyžádejte si laskavě další pomoc u služby technické podpory společnosti Dako. Další informace o technikách barvení a přípravě vzorků lze najít v následujícíh pramenech: Handbook - Immunochemical Staining Methods 7 (k dostání u společnosti Dako), Atlas of Immunohistology 8 a Immunoperoxidase Techniques, A Practical Approach to Tumor Diagnosis. 9 (107942-004) 302063CZ_003 str. 5/6
Literatura 1. Elias JM, et al. Special report: Quality control in immunohistochemistry. Amer J Clin Pathol 1989; 92:836 2. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Internal quality control testing: principles and definitions; approved guideline. Villanova, PA 1991; Order code C24-A:4 3. Herman GE and Elfont EA. The taming of immunohistochemistry: The new era of quality control. Biotech & Histochem 1991; 66:194 4. Escribano LM, et al. Endogenous peroxidase activity in human cutaneous and adenoidal mast cells. J Histochem Cytochem 1987; 35:213 5. Elias JM. Immunohistopathology: A practical approach to diagnosis. Chicago: Amer Soc of Clin Pathol Press 1990; 46 6. Omata M, et al. Nonimmunologic binding of horseradish peroxidase to hepatitis B surface antigen: A possible source of error in immunohistochemistry. Amer J Pathol 1980; 73:626 7. Naish SJ (ed). Handbook immunochemical staining methods. Carpinteria: Dako 1989 8. Tubbs RR, et al. Atlas of immunohistology. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press 1986 9. Nadji M and Morales AR. Immunoperoxidase techniques, a practical approach to tumor diagnosis. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press 1986 Doplňková literatura Cartun RW. Immunohistochemistry of infectious diseases. J Histotechnol 1995; 18(3):195 Heras A, et al. Enhanced labelled-polymer system for immunohistochemistry. XVth Eur Cong Pathol. Copenhagen, Denmark 1995; Sept 3 8 Bisgaard K and Pluzek K-P. Use of polymer conjugates in immunohistochemistry: A comparative study of a traditional staining method to a staining method utilizing polymer conjugates. Abstract. XXI Intl Cong Intl Acad Pathol and 12th World Cong Acad Environ Pathol. Budapest, Hungary 1996; Oct 20 25 Pileri SA, et al. EnVision Plus: A new powerful tool for diagnosis and research. Symposium. XXI Intl Cong Intl Acad Pathol and 12th World Cong Acad Environ Pathol. Budapest, Hungary 1996; Oct 20 25 Bisgaard K. EnVision Plus Introduction to a new technology. Abstract. Dako Symposium. XXI Intl Cong Intl Acad Pathol. Budapest, Hungary 1996; Oct 20 25 Edition 11/12 (107942-004) 302063CZ_003 str. 6/6