Specializace buněčných povrchů Spojení buněk Molekulární koncepce biologického motoru Ústav histologie a embryologie Doc. MUDr. Zuzana Jirsová, CSc. Předmět: Obecná histologie a obecná embryologie B02241 Přednáška 2. paralelky 8. 10. 1013
SPECIALIZACE BUNĚČNÝCH POVRCHŮ polární uspořádání EPITHELOVÉ BUŇKY JSOU POLARIZOVANÉ Volný, apikální povrch: mikroklky, řasinky (kinocilie), stereocilie Laterální povrch v těsném kontaktu s povrchem sousední buňky speciální buněčné adhesivní molekuly interdigitace, specializovaná buněčná spojení Bazální povrch připojení epithelu k bazální membráně (adhesní spojení) bazální labyrint (transport iontů) apikální povrch cytoplasmatická membrána (červeně) laterální povrch bazální povrch bazální membrána (zeleně)
SPECIALIZACE BUNĚČNÉHO POVRCHU Specializace, které zvětšují apikální povrch Mikrořasy (microplicae) záhyby na apikálním povrchu vrstevnatého dlaždicového epithelu, napomáhají udržení tekutého filmu (rohovka) Mikroklky prstovité výběžky apikálního povrchu buňky (délka 1-2 µm), jejich kostru tvoří svazek aktinových filament. Hustě a pravidelně uspořádané mikroklky tvoří žíhaný (kartáčový) lem resorpčního epithelu Stereocilie štíhlé, nepohyblivé výběžky apikálního povrchu buňky (délka 5-10µm, průměr 0,1-0,2 µm), jejich kostru tvoří svazek aktinových filament. Výskyt: epithel vývodních pohlavních cest muže, vláskové buňky vnitřního ucha Kinocilie, bičík pohyblivé výběžky s vysoce organizovanou MT strukturou
SPECIALIZACE BUNĚČNÉHO POVRCHU Zvětšení bazolaterálního povrchu Prstovité výběžky na laterálním a bazálním povrchu. Na laterálním povrchu mohou prstovité výběžky vytvářet s výběžky sousední buňky interdigitace Bazální labyrint vytvářejí záhyby (invaginace) cytoplasmatické membrány do bazální cytoplasmy, kterou člení v kompartmenty, které obsahují mitochondrie. Cytoplasmatická membrána bazálního labyrintu obsahuje Na + K + ATP-ázu; hydrolýzou ATP se uvolňuje energie, která slouží k aktivnímu transportu iontů (epithel žíhaných vývodů slinných žláz, proximálních a distálních tubulů ledviny). Ve světelném mikroskopu se bazální labyrint jeví jako eosinofilní bazální žíhání.
Prstovité výběžky, laterální povrch buňky Apikální povrch s ojedinělými mikroklky Interdigitace sousedních epithelových buněk L E Mi Mi Mi J L A L lamina basalis B A: elektronogram epitelové buňky tubulu mesonefros L = lysosom, E = endocytotická vakuola, J = jádro Mi = mitochondrie (doc. MUDr. Z. Jirsová) B: elektronogram folikulárních buněk vaječníku (prof. MUDr. J. Martínek)
Schéma struktury bazálního labyrintu epithelová buňka distálního tubulu ledviny Krstic, Illustrated Encycl. of Human Histology, 1984 Modré šipky: invaginace cytoplasmatické membrany, Mi: tyčinkovité mitochondrie mikroklky ZO jádro Golgiho komplex ZO Mi Submikroskopický průkaz aktivity Na + K + ATP-ázy v membráně bazálního labyrintu epithelu proximálního tubulu (červené šipky) Elektronogram: doc. MUDr. Z. Jirsová jádro Mi Mi Mi jádro lamina basalis
Uspořádání aktinových filament v mikroklku espin villin fimbrin AF fascin myosin I spektrin kortikální síť myosin II Připojení AF k CM Svazky AF tvořící kostru mikroklku Připojení svazků AF (kořínků) do aktinového kortexu pomocí spektrinu cytokeratinová IMF Schéma: Histology, Ross, Pawlina, 2011 cytokeratinová intermediární filamenta EM, metoda mrazového lomu demonstrující filamenta: Ross, Pawlina, Histology, 2006
kortikální síť mikroklky glykokalyx svazek aktinových filament cytoplasmatická membrána Střevní epithel žíhaný lem Elektronogram: Junqueira, Carneiro, Basic Histology, 2003
ŽÍHANÝ LEM - hustě a pravidelně uspořádané mikroklky na povrchu resorpčního epithelu. Na membránu mikroklků je vázaná alkalická fosfatáza (černé tečky) Průkaz aktivity alkalické fosfatázy v žíhaném lemu střevního epithelu (1) a epithelu proximálního tubulu ledviny (2). Azokopulační metoda. Mikrofotografie: Sbírka ÚHIEM 1 Golgiho komplex 2 jádro bazální membrána SCHÉMA ENTEROCYTU resorpční buňka střevního epithelu
STEREOCILIE dlouhé nepohyblivé výběžky ezrin fimbrin aktinová filamenta espin Kanálek nadvarlete stereocilie (šipky) cytoplasmatické můstky α-aktinin aktinová filamenta α-aktinin Schéma: Histology, Ross, Pawlina, 2011 Dvouřadý cylindrický epithel W. Kühnel, Atlas, 2003
1a KINOCILIE transmisní elektronový mikroskop Junqueira s Basic Histology, Mescher, 2010 KINOCILIE světelný mikroskop Mikrofotografie: sbírka ÚHIEM řasinky J 1b Elektronogram: 1a = podélný řez, 1b = příčný řez řasinkou; MV - mikroklky, B - bazální tělísko řasinky, hlavička šipky mikrotubuly axonemyřasinky Řasinkové buňky epithelu vejcovodu (Heidenhainova metoda). J jádro, šipky kinetosomy, bazální tělíska kinocilií
ŘASINKY, KINOCILIE (délka: 5-10 µm, průměr: 0,2 µm) Kinocilie jsou protáhlé pohyblivé výběžky na povrchu epithelových buněk, jsou zakotveny v povrchové cytoplasmě v bazálních tělískách - kinetosomech (má funkci MTOC, stavba jako centriol). Volnáčást řasinky je složena z mikrotubulů, které tvoří axonemu: 9 periferních dvojic mikrotubulů, dublet (A mikrotubulus tvoří 13 protofibril, B - 10) a jeden centrální pár mikrotubulů. Při pohybu kinocilie dochází k vzájemnému posunu mikrotubulů, který je zajištěn motorickým proteinem dyneinem (proteinem s ATP-ázovou aktivitou). nexin spojovací protein dyneinové raménko radiální paprsky CM B Centrální pochva centrální pár mikrotubulů A periferní dvojice MT (dublet) Schéma, elektronogramy: Stevens, Lowe, Histology, 1993 Příčný (b), podélný řez (c) řasinky v elektronovém mikroskopu CM = cytoplasmatická membrána, BB = bazální tělíska, Cy = cytoplasma
Polarizace epithelu (apikální, laterální, bazální povrch), buněčné spoje zonula occludens mikroklky (žíhaného lemu resorpčního epithelu) zonula adhaerens Spojovací komplex (TEM) - terminální lišty (SM) (nexy) fokální kontakty hemidesmosomy desmosomy Ross, Pawlina, Histology, 2006
SPOJENÍ BUNĚK Spojení buněk uskutečňují transmembránové proteiny TĚSNÉ, BARIÉROVÉ SPOJENÍ: zonula occludens KOMUNIKAČNÍ SPOJENÍ: nexy (gap junctions) ADHESNÍ SPOJENÍ mechanická funkce Připojení buňky k sousední buňce: zonula adhaerens, macula adhaerens/desmosom Připojení buňky k extracelulární matrix: hemidesmosom, fokální adhese/kontakt Kotevní spoje - transmembránové proteiny jsou připojeny k cytoskeletu, na cytoplasmatické straně je plak (těsnící zóna), kde se upínají filamenta cytoskeletu
ZONULA OCCLUDENS Těsné - bariérové spojení po obvodu buňky, odděluje luminální a intercelulární prostor, zabraňuje paracelulární difusi. Transmembránové proteiny (TMP): klaudin (claudin) a occludin; opakovaná bodová spojení externích domén TMP tvoří lištové spoje, které mají síťovité uspořádání mikroklky cytoplasmatické membrány intercelulární prostor (2 nm) Elektronogram (TEM), šipky označují ZO Převzato: Roos, Pawlina, Histology, 2006 Schéma zonula occludens Metoda mrazového lomu (šipkou označeny lišty; Mi mikroklky.
Schéma molekulární struktury zonula occludens Těsné spojení ZO obsahuje tři transmembránové proteiny (TMP). Occludin a claudin majíčtyři transmembránové domény se dvěma extracelulárními kličkami. occludin claudin JAM Schéma: Ross, Pawlina, Histology, 2006 ZO3 ZO-2 ZO1 aktinová filamenta JAM (Junctional Adhesion Molecule patří do imunoglobulinové nadrodiny) má pouze jednu extracelulární doménu. Cytoplasmatickéčásti všech tří lištových proteinů (TMP) jsou připojeny na vazebné ZO proteiny, které Vážou aktinová filamenta. Permeabilita ZO závisí nejen na molekulárním složení lišt a hustotě lišt, ale také na přítomnosti funkčních vodních kanálů (některé claudiny mohou tvořit vodní póry uvnitř lišty) Velmi těsná spojení endothel kapilár mozku, epithel močového měchýře. V epithelu proximálních tubulů ledvin je ZO méně těsná a částečně propustná pro vodu a soluty.
NEXUS komunikační spojení umožňuje selektivní difusi iontů a malých molekul, urychluje přímou komunikaci mezi sousedními buňkami. Transmembránové proteiny connexiny (c) tvoří connexony (Cx) s hydrofilním pórem (2 nm). Connexon je složen ze šestice connexinů; spojené connexony sousedních buněk vytvářejí spojovací kanály. Nexy vytvářejí funkční spojení mezi epithelovými nexus buňkami, buňkami hladké a srdeční svaloviny; elektrické synapse. Mutace genů kódujících connexiny má za následek např. vrozenou hluchotu, vrozený šedý zákal, neplodnost. 1 Cx CM CM CM - cytoplasmatická membrána IP intercelulární prostor CM c A 1: Elektronogram (TEM): těsné přiložení cytoplasmatických membrán v oblasti nexu Převzato: Ross, Pawlina, Histology, 2006 2: technika mrazového lomu, denzní partikule odpovídají connexonům Převzato: Junquiera s Basic Histology, Mescher, 2010 3: Schéma stavby nexu Převzato: Ross, Pawlina, Histology, 2006 A uzavřený pór B otevřený pór 2 3 IP B Otevírání póru spojovacího kanálu connexonu je regulováno reversibilními změnami v konformaci conexinů.
ADHESNÍ SPOJENÍ Kotevní spojení mechanická stabilita je podmíněná připojením transmembránových proteinů (TMP) k cytoskeletu Plak/těsnící zóna je vytvořena na cytoplasmatické straně. Plakové/adaptorové proteiny stabilizace spojení intracytoplasmatické domény TMP s filamenty cytoskeletu TMP laterální cytoplasmatické membrány: cadheriny TMP bazální cytoplasmatické membrány: integriny Aktinová filamenta: Zonula adhaerens - spojení sousedních buněk Fokální adhese/kontakt - připojení buňky k lamina basalis Intermediární filamenta: Desmosom/macula adhaerens spojení sousedních buněk Hemidesmosom připojení buňky k lamina basalis
ZONULA ADHAERENS Pásové adhesní spojení laterálních povrchů sousedních buněk uložené pod zonula occludens cytoplasmatické membrány sousedních buněk (CM) Ca 2+ E-cadherin AF α-aktinin catenin vinculin Schéma: Ross, Pawlina, Histolody, 2006 aktinová filamenta (AF) Elektronogram: Juqueira s Basic Histology, Mescher, 2010 CM jsou odděleny souvislou intercelulární štěrbinou (15-20 nm). Jemně elektrondenzní materiál při cytoplasmatickém povrchu membrány (těsnící zóna) obsahuje AF. E-cadherin - Ca 2+ dependentní TMP, cytoplasmatická doména cadherinu se váže na catenin. Komplex cadherin-catenin je připojen na vinculin a α-aktinin, protein vázající aktinová filamenta AF). Odstranění Ca 2+ vede k disociaci molekul E-cadherinu a přerušení spojení. Fascia adhaerens je součástí interkalárních disků, stabilizuje spojení buněk srdečního svalu.
DESMOSOM, MACULA ADHAERENS Bodové adhesní - kotevní spojení (průměr 0,3 µm, X = intercelulární prostor: 20-30 nm) Nápadná těsnící zóna, plak (P), do níž jsou připojena intermediární filamenta: cytokeratinová, (CF) v epithelu, interkalární disk desminová. CM (cytopasmatická membrána) CF PLAK Plakové, adaptorové proteiny: desmoplakiny desmoglobin Desmogleiny, desmocolliny transmembránové proteiny cadherinové rodiny Schéma, elektronogram: Histology, Ross, Pawlina, 2006
FOKÁLNÍ ADHESE/KONTAKT Cytoplasmatická doména TMP integrinu je připojená na adaptorové proteiny (talin, paxillin) spojené s vinculinem a α-aktininem, který váže aktinová filamenta (AF) AF α-aktinin vinculin paxillin talin integrin fibronektin LR LD Průkaz AF (zeleně) ve fluorescenčním mikroskopu pomocí imunofluorescenční metody. Extracelulární doména integrinu se připojuje k proteinům extracelulární matrix (např. k fibronektinu) Lamina basalis: LR = lamina rara, LD = lamina densa Schéma i mikrofotografie: Ross, Pawlina, Histology, 2006
HEMIDESMOSOM Schéma i elektronogram: Ross, Pawlina, Histology, 2006 BL = lamina basalis H = hemidesmosomy jádro intermediární filamenta plectin H BP230 H erbin plak integrin H BL kolagen XVII laminin 5 kolagen VII (kotevní smyčka) H kolagen IV kolagen IV (retikulární vlákno) Hemidesmosomy zajišťují silnou stabilní adhesi epithelu k vazivu (pokožka). TMP: integriny a kolagen XVII Extracelulární doména je připojena k proteinům extracelulární matrix (lamina basalis) lamininy, kolagen IV Cytoplasmatická doména TMP je navázána na plakové proteiny (plectin, BP230 a erbin), k nímž jsou připojena cytokeratinová intermediární filamenta
MOLEKULÁRNÍ KONCEPCE BIOLOGICKÉHO MOTORU Molekulové motory spojené s MT jsou kinesiny a dyneiny. Pohybují se v opačném směru podél MT Tyto motorové proteiny se skládají ze 2 těžkých a několika menších lehčích řetězců. Těžké řetězce vytvářejí globulární hlavičky, které interagují s MT Cytoplasmatické dyneiny transport organel z periferie směrem k MTOC. Axonemální dyneiny při pohybu řasinky nebo bičíku dochází k posunu mikrotubulů. Schéma: Alberts et al., Základy buněčné biologie (český překlad), 2005 Kinesiny se pohybují směrem k plus (+) konci, tzn. transportují organely z centra do periferie
Molekulární motorové proteiny asociované s mikrotubuly (energie pro pohyb ATP): KINESINY a DYNEINY receptor pro náklad receptor Mikrotubuly se podílejí na řadě esenciálních buněčných funkcí: Intracelulární vesikulární transport Pohyb řasinek a bičíku (představují jejich strukturní složku) Připojení chromosomů k dělícímu vřeténku a jejich pohyb při mitose a meiose Migrace buněk Udržování buněčného tvaru Schéma: Alberts et al., Základy buněčné biologie (český překlad), 2005
1 2 3 AKTINOVÉ MOTOROVÉ PROTEINY jsou MYOSINY Myosiny hydrolysují ATP, energie se využívá k pohybu podél aktinového filamenta (AF) směrem k (+) konci. Nesvalové buňky obsahují myosin I. Krátký konec molekuly obsahuje vazebná místa (šipky) pro různé buněčné složky včetně membrán. To umožňuje pohybovat aktinové filamentum Schéma: Alberts et al., Základy buněčné biologie (český překlad), 2005 membránovými váčky podél AF (1), nebo pohybovat AF vzhledem k cytoplasmatické membráně (3). Malá vlákna složená z molekul myosinu II jsou schopna posunovat AF proti sobě, čímž se dosahuje místního zkracování svazků AF (B). V každém případě se havičky myosinů pohybujípo AF směrem k jejich plus (+) koncům.