Zkušenosti s diagnostikou sepse pomocí testu SeptiFast Test M GRADE Zdeňka Doubková Klinická mikrobiologie a ATB centrum VFN Praha
Definice: Sepse je definována jako syndrom systémové zánětlivé odpovědi při infekci život ohrožující stav Bakteriémie- přítomnost živých baktérií v krvi, nemusí být projevem nemoci často asymptomatická
Kritéria sepse: Teplota > 38 nebo < 36 ⁰C Srdeční frekvence > 90/min Dechová frekvence > 20/min nebo P CO₂ (mmhg) < 32 Leukocyty > 12x10⁹ nebo < 4x10⁹/l nebo > 10 % tyčí
Incidence se zvyšuje imunosupresivní postupy invazivní léčba stárnutí populace Častá příčina úmrtí-jip
Možnosti diagnostiky sepse Hemokultury Zánětlivé ukazatele- CRP, prokalcitonin, KO RTG S+P, ORL vyšetření, SONO,CT Laboratorní známky DIC (diseminovaná intravaskulární koagulace) Lumbální punkce Epidemiologie
Původci sepse: Bakterie Mykotická agens Viry Paraziti
Nejčastější agens Komunitní: Staphylococcus aureus Streptococcus pneumoniae Escherichia coli Nosokomiální : gramnegativní tyčky koagulázanegativní stafylokoky enterokoky kvasinky
Etiologie sepse v dětském věku Komunitní : Streptococcus pneumoniae Neisseria meningitidis Staphylococcus aureus Escherichia coli Nemocniční: Staphylococcus epidermidis Escherichia coli Klebsiella sp. Pseudomonas aeruginosa Enterobacter cloacae Enterococcus faecalis Streptococcus agalactiae - novorozenci
Predispoziční faktory sepse: Porucha imunity Traumata Závažné základní choroby Alkoholismus, toxikomanie Extrémní věkové skupiny
Mikrobiologická diagnostika Hemokultivace asepticky odebíraná krev (8-10 ml dospělí, 1-5 ml děti) před nasazením ATB opakovaný odběr aerobní + anaerobní kultivace (+ mykotická kultivace) s inhibitory ATB
Správné načasování odběru! Před nasazením ATB Před aplikací další dávky ATB Na začátek vzestupu teploty nebo třesavky U pravidelného vzestupu 1hod před U endokarditid- několik odběrů Vícenásobný odběr
Pozitivní výsledky většinou do 48 hodin Zhotovení mikroskopie- Gramovo barvení Informováno oddělení Do 24 hodin- předběžná citlivost na ATB + dourčení kmene MALDI TOF 3. - 4. den - konečný výsledek
Nové metody v diagnostice sepse Metody založené na identifikaci nukleové kyseliny infekčního agens Diagnostické soupravy založené na principu PCR (polymerázová řetězová reakce) Výhoda metody- RYCHLOST- 4 až 5 hodin Zachytí i mrtvé mikroorganismy
Princip testů: Amplifikace nukleových kyselin pomocí real time PCR třemi souběžnými reakcemi (G+, G-, houby) Detekce specifickými hybridními sondami Automatická identifikace druhů a kontrol
Test LightCycler R SeptiFast M Grade Amplifikační test in vitro Detekce bakteriální a houbové DNA Lidská K-EDTA krev LightCycler R 2.1 Použití s dalšími testy
Test uveden na trh v roce 2006 Zahrnuje 90 % původců sepsí (dle výrobce) In vitro test Amplifikace nukleových kyselin Identifikace DNA bakterií a hub 3 PCR reakce Gram + Gram Fungi Kontrola přítomnosti inhibitorů PCR
Gramnegativní bakterie Escherichia coli Klebsiella pneumoniae/oxytoca Serratia marcescens Enterobacter cloacae/aerogenes Proteus mirabilis Pseudomonas aeruginosa Acinetobacter baumannii Stenotrophomonas maltophilia
Grampozitivní bakterie Staphylococcus aureus Koaguláza negativní stafylokoky Streptococcus pneumoniae Streptococcus species Enterococcus faecalis Enterococcus faecium
Fungi Candida albicans Candida tropicalis Candida krusei Candida glabrata Aspergillus fumigatus
Streptococcus species S.agalactiae S.bovis S.mitis S.mutans S.oralis S.pyogenes S.salivarius S.sanguinis S.anginosus S.vestibularis S.constellatus S.intermedius S.parasanguinis S.pneumoniae S.cristatus S.gordonii
Koaguláza negativní stafylokoky S.hominis S.pasteuri S.warneri S.lugdunensis S.cohnii S.caprae S.saprophyticus S.xylosus S.epidermidis S.haemolyticus S.capitis
3 pracovní fáze Extrakce DNA Amplifikace DNA pomocí real-time PCR za využití hybridizačních sond Softwarová identifikace mikroorganismů Ověření správnosti průběhu PCR pomocí kontrol
1,5 ml nesrážlivé krve (K-EDTA) Transport při chladničkové teplotě Mechanická lýza krve Cílová sekvence lokalizována mezi 16S a23s rdna u G+ a G- bakterií Mezi 18S a 5,8S rdna u hub Detekce produktů PCR pomocí fluorescenčních sond
Analýza teplot tání komplexů systémem SeptiFast Identification Software Vytvořen konečný report pro analyzované vzorky
Analytické a klinické parametry testu Analytická sensitivita 100 CFU/ml pro stafylokoky koagulázanegativní, Streptococcus species a Candida glabrata 30 CFU/ml pro ostatní
Dotestování MRSA Při zjištění Staphylococcus aureus lze dotestovat meca rezistenci pomocí doplňkového kitu SeptiFast meca Kit M GRADE
SeptiFast ve VFN Od ledna 2011 Dostupnost 7 dní v týdnu Za 3 roky vyšetřeno cca 600 vzorků krve Od května 2013 do května 2014 vyšetřeno 151 vzorků krve
Celkem 151 Pozitivní SeptiFast 41 vzorků 27,3 % Pozitivní hemokultivace 15 vzorků 10 % Negativní SF + pozitivní hemokultivace 0 vzorků Pozitivní SF + negativní hemokultivace 26 vzorků
Bakterie/Houba Počet Streptococcus species 15 Staphylococcus koagulázanegativní 8 Escherichia coli 6 Staphylococcus aureus 6 Enterococcus faecalis 2 Klebsiella pneumoniae 2 Enterobacter cloacae 2 Candida albicans 2 Serratia marcescens 1 Candida krusei 1 Aspergillus fumigatus 1
Pacienti s kardiologickou diagnózou (chlopenní vada, endocarditis, atd.) 45 vzorků Pozitivní SeptiFast 23x Pozitivní hemokultivace 8x
Pacienti s kardiologickou diagnózou Bakterie/Houba Počet Streptococcus species 10 Staphylococcus koagulázanegativní 5 Staphylococcus aureus 4 Candida krusei 1 Enterococcus faecalis 1 Escherichia coli 2
Výhody X Nevýhody Rychlá detekce (4 až 5 hodin) Dostupnost 7 dní v týdnu 22 patogenů + 1 rezistence 1,5 ml krve Pozititvita i po nasazení ATB (x HK) DNA mrtvých mikroorganismů Chybí Listeria sp., Salmonella a Neisseria meningitidis PCR inhibice (leukocyty, heparin, ATB, neznámé faktory) DNA mrtvých mikroorganismů CENA reagencií a vyšetření
Děkuji za pozornost