Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav agrochemie, půdoznalství, mikrobiologie a výživy rostlin NÁVRH UČEBNÍHO TEXTU POTRAVINÁŘSKÁ MYKOTOXIKOLOGIE PRO STŘEDNÍ ODBORNÉ ŠKOLY Bakalářská práce Brno 2006 Vedoucí bakalářské práce: Prof. RNDr. Marta Tesařová, CSc. Vypracoval: Mgr. Stanislav Hamerský
2
3 Prohlášení Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci na téma Návrh učebního textu Potravinářská mykotoxikologie pro střední odborné školy vypracoval samostatně a použil jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém soupisu literatury. Souhlasím, aby práce byla uložena v knihovně Mendelovy zemědělské a lesnické univerzity v Brně a zpřístupněna ke studijním účelům. V Brně dne.. Podpis
4 Poděkování Rád bych na tomto místě poděkoval paní prof. RNDr. Martě Tesařové, CSc. za vedení této bakalářské práce, věcné připomínky a cenné rady. Dále chci poděkovat paní MVDr. Janě Vyhnálkové, vyučující SPŠCH Brno za průběžné konzultace při psaní učebního textu.
5 ANOTACE A draft for the Teaching Text Food mycotoxicology for the Secondary Technical Schools This work provides a survey of the up-to-date knowledge of moulds producing mycotoxins and specifies the importance of knowledge of mycotoxins for the secondary technical school students specialized in food industry. The work includes a draft for the teaching text for the optional subject Food Mycotoxicology for the secondary technical schools. It responds to the fact that there are no teaching texts reflecting the up-to-date knowledge of food industry available for the specialized branch of studies at the secondary technical schools. The draft teaching text can be used for teaching as well as some passages of the text for teaching the compulsory subject Microbiology.
6 OBSAH 1. Úvod výuka potravinářské mikrobiologie na SOŠ v minulosti a dnes, vývoj učebních textů...8 2. Cíle a metodika čím jsem se zabýval, jak a proč...10 3. Výuka mykotoxikologie potravin na SOŠ s chemickým a potravinářským zaměřením...11 4. Učební text Potravinářská mykotoxikologie...12 4.1 Všeobecná část...14 4.1.1 Úvod...14 4.1.2 Z historie mykotoxikologie...14 4.1.3 Charakteristika plísní...17 4.1.4 Nezbytné minimum z toxikologie...21 4.1.5 Cizorodé látky v potravinách...22 4.1.6 Mykotoxiny a jejich dělení...24 4.1.7 Toxinogenita...29 4.1.8 Ekologická funkce mykotoxinů...31 4.2 Speciální část...32 4.2.1 Přehled nejdůležitějších mykotoxinů...32 4.2.1.1 Aflatoxiny...32 4.2.1.2 Ochratoxin A...34 4.2.1.3 Sterigmatocystin...36 4.2.1.4 Patulin...37 4.2.1.5 Cyklopiazonová kyselina...38 4.2.1.6 Citrinin...40 4.2.1.7 Trichotheceny...41 4.2.1.8 Zearalenon...43 4.2.1.9 Fumonisiny...44 4.2.1.10 Některé další mykotoxiny...45 4.2.2 Limity pro obsah mykotoxinů v potravinách...48 4.2.3 Detoxikace mykotoxinů...51
7 4.2.4 Onemocnění člověka způsobená mykotoxiny mykotoxikózy...53 4.2.4.1 Ergotismus...53 4.2.4.2 Akutní kardiální beri-beri...55 4.2.4.3 Alimentární toxická aleukie (ATA)...55 4.2.4.4 Toxická hepatitida...56 4.2.4.5 Primární hepatom...56 4.2.4.6 Aflatoxiny vyvolaný Reyův syndrom...57 4.2.4.7 Kwashiorkor...57 4.2.4.8 Útlum imunity...58 4.2.4.9 Hyperestrogenismus...59 4.2.5 Praktické rady k ochraně zdraví...60 4.2.5.1 Nákup potravin...60 4.2.5.2 Uchování a skladování potravin v domácnosti...60 4.2.5.3 Očista a desinfekce v domácnosti...60 4.2.5.4 Příznaky růstu a rozmnožování plísní v potravinách...61 4.2.5.5 Zbytkové potraviny...61 4.2.5.6 Epidemiologicky rizikové potraviny...62 4.2.5.6.1 Chléb a pečivo...62 4.2.5.6.2 Masné výrobky...63 4.2.5.6.3 Sýry...64 4.2.5.6.4 Ovoce a zelenina...64 4.2.5.6.5 Výrobky z ovoce a zeleniny...65 4.2.5.6.6 Sušené plody...66 4.2.5.6.7 Rýže...67 4.2.5.6.8 Kojenecká a dětská výživa...67 4.2.6 Slovníček pojmů...69 5. Závěr...72 6. Literatura...74
8 1. ÚVOD VÝUKA POTRAVINÁŘSKÉ MIKROBIOLOGIE NA SOŠ V MINULOSTI A DNES, VÝVOJ UČEBNÍCH TEXTŮ Výuka odborných předmětů na středních odborných školách má oproti výuce všeobecně vzdělávacích předmětů svá specifika a vyžaduje tedy také speciální učební texty, které akcentují požadavky na profil absolventa střední odborné školy podle konkrétního studijního programu a oboru. Před rokem 1989 zajišťovalo tehdejší Státní nakladatelství technické literatury vydávání celostátních středoškolských odborných učebnic pro všechny střední školy zařazené do sítě SOŠ s technickým zaměřením, přičemž tyto učebnice byly koncipovány podle tehdejších platných osnov pro výuku daných odborných předmětů. Dnes je však u nás situace zcela odlišná a v důsledku politických a společenských změn, které po roce 1989 nastaly, nemají již SOŠ zajištěny přísun aktualizovaných učebnic pro odborné předměty. Dlužno dodat, že osnovy pro tyto odborné předměty také nedoznaly změn, které by díky rozvoji zejména technických a biologických disciplin zasloužily. V dnešní době je na trhu nabízena celá řada učebnic všeobecně vzdělávacích předmětů jako například biologie, chemie, zeměpisu atd., většinou s přívlastkem pro gymnázia a střední školy gymnazijního typu. Méně se však již setkáme s nabídkou učebnic pro odborné střední školy a pro úzce profilované odborné střední školy neexistují povětšinou žádné aktuální učební texty, odrážející nejnovější poznatky v oboru. Od školního roku 2005/2006 působím jako učitel na Střední průmyslové škole chemické v Brně, na které studují studenti mimo jiné také ve studijním oboru analýza potravin. Situaci ohledně učebnic či jiných učebních textů pro předmět mikrobiologie jsem konzultoval s vyučující tohoto předmětu MVDr. Janou Vyhnálkovou, která mi potvrdila, že v podstatě nemá k dispozici žádný vhodný učební text k tomuto předmětu. Jistěže takové učební texty vycházejí, avšak prakticky pouze v podobě vysokoškolských skript a učebnic, které jsou pro výuku na střední škole nevhodné. Je tedy na vyučujícím, aby si sám obsahovou náplň předmětu nachystal ve formě příprav na vyučování a následně je předával svým studentům. Pro studenty samotné by však učební text, ze kterého by mohli čerpat znalosti, byl jistě vhodnou pomůckou.
9 Rozhodl jsem se tedy, že v rámci zpracování mé bakalářské práce na Agronomické fakultě MZLU v Brně, se pokusím navrhnout podobu konkrétního učebního textu pro potravinářský směr studia na SPŠCH a to konkrétně pro volitelný předmět potravinářská mykotoxikologie. Některé pasáže tohoto učebního textu mohou být také využity pro výuku povinného předmětu mikrobiologie.
10 2. CÍLE A METODIKA ČÍM JSEM SE ZABÝVAL, JAK A PROČ Souhrnně lze říci, že jsem si kladl za cíl vypracovat v rámci své bakalářské práce učební text primárně určený pro potravinářskou větev studia na Střední průmyslové škole chemické v Brně, který by mohl být případně použit i na jiných středních odborných školách s potravinářským zaměřením. Mám-li shrnout metody, které jsem použil k dosažení uvedeného cíle, budu zde jmenovat především práci s odbornou literaturou, která znamenala zjišťování základních i nejnovějších poznatků týkajících se toxinogenních plísní a mykotoxinů obsažených v potravinách, jejich utřídění systematizaci s důrazem na hledisko dodržení veškerých didaktických zásad pro zpracování učebního textu, dále pak konzultace s vyučujícími SPŠCH v Brně a v neposlední řadě také vlastní práci se studenty střední školy, kdy jsem zjišťoval z jaké poznatkové základny mohu u studentů střední školy vycházet a také jaký lze z jejich strany očekávat zájem o problematiku mykotoxinů obsažených v potravinách.
11 3. VÝUKA MYKOTOXIKOLOGIE POTRAVIN NA STŘEDNÍCH ODBORNÝCH ŠKOLÁCH S CHEMICKÝM A POTRAVINÁŘSKÝM ZAMĚŘENÍM Přestože v posledních letech je napadení potravin plísněmi a jeho následkům věnována zvýšená pozornost, v učebnicích mikrobiologie pro SPŠ potravinářské či v učebnicích biochemie pro SPŠ chemické najdeme o mykotoxinech pouze zmínku. Odpovídá to skutečnosti kterou jsem zmiňoval již v úvodu této práce, totiž že učebnice pro SOŠ byly koncipovány tak, aby odpovídaly platným vyučovacím osnovám pro daný předmět, a že problematika potravinářské mykotoxikologie nebyla do těchto osnov obšírněji zařazena. S narůstajícím množstvím nových poznatků z této oblasti a s narůstajícími nároky na kvalitu potravin je však třeba v tomto směru také aktualizovat výuku na střední odborné škole, která připravuje odborníky pro potravinářskou praxi. Právě z těchto důvodů jsem se rozhodl svůj učební text zaměřit na mykotoxikologii. Protože při psaní textu vycházím z praxe učitele na Střední průmyslové škole chemické, zaměřuji také tento text spíše na chemickou podstatu mykotoxinů obsažených v potravinách a jejich vlivem na kvalitu potravin, nežli na morfologii a ekologii plísní. Přínos učebního textu ale nespočívá pouze v tom, že přináší aktuální a pro studenty snad zajímavou učební pomůcku. Na středních školách se perspektivně počítá se zaváděním některých inovativních metod výuky, které se již nyní osvědčují v základním školství, jako například tzv. projektového vyučování [29, 34]. Rozsah ani zaměření této práce mi nedovolují se o projektové vyučovací metodě více rozepsat, avšak chtěl bych i přesto na tomto místě zdůraznit, že zmiňovaný učební text může být i vhodnou inspirací a pramenem pro některé středoškolské školní projekty.
12 4. UČEBNÍ TEXT POTRAVINÁŘSKÁ MYKOTOXIKOLOGIE Na tomto místě uvádím doslovné znění jednotlivých kapitol učebního textu Potravinářská mykotoxikologie. Kapitoly jsou číslovány desetinným systémem a číslování kapitol učebního textu odpovídá číslování kapitol této bakalářské práce bez první číslice 4. OBSAH 1. Všeobecná část 1.1 Úvod 1.2 Z historie mykotoxikologie 1.3 Charakteristika plísní 1.4 Nezbytné minimum z toxikologie 1.5 Cizorodé látky v potravinách 1.6 Mykotoxiny a jejich dělení 1.7 Toxinogenita 1.8 Ekologická funkce mykotoxinů 2. Speciální část 2.1 Přehled nejdůležitějších mykotoxinů 2.1.1 Aflatoxiny 2.1.2 Ochratoxin A 2.1.3 Sterigmatocystin 2.1.4 Patulin 2.1.5 Cyklopiazonová kyselina 2.1.6 Citrinin 2.1.7 Trichotheceny 2.1.8 Zearalenon 2.1.9 Fumonisiny 2.1.10 Některé další mykotoxiny 2.2 Limity pro obsah mykotoxinů v potravinách
13 2.3 Detoxikace mykotoxinů 2.4 Onemocnění člověka způsobená mykotoxiny 2.4.1 Ergotismus 2.4.2 Akutní kardiální beri-beri 2.4.3 Alimentární toxická aleukie (ATA) 2.4.4 Toxická hepatitida 2.4.5 Primární hepatom 2.4.6 Aflatoxiny vyvolaný Reyův syndrom 2.4.7 Kwashiorkor 2.4.8 Útlum imunity 2.4.9 Hyperestrogenismus 2.5 Praktické rady k ochraně zdraví 2.5.1 Nákup potravin 2.5.2 Uchování a skladování potravin v domácnosti 2.5.3 Očista a desinfekce v domácnosti 2.5.4 Příznaky růstu a rozmnožování plísní v potravinách 2.5.5 Zbytkové potraviny 2.5.6 Epidemiologicky rizikové potraviny 2.5.6.1 Chléb a pečivo 2.5.6.2 Masné výrobky 2.5.6.3 Sýry 2.5.6.4 Ovoce a zelenina 2.5.6.5 Výrobky z ovoce a zeleniny 2.5.6.6 Sušené plody 2.5.6.7 Rýže 2.5.6.8 Kojenecká a dětská výživa 2.6 Slovníček pojmů
14 4. 1 VŠEOBECNÁ ČÁST 4.1.1 ÚVOD Učební text, který se vám dostává do rukou, má být názorným a systematickým přehledem základních a nejdůležitějších toxinů produkovaných skupinou organismů, označovanou jako plísně. Tyto organismy mají v potravinářství nesmírný význam, a to jak svou žádoucí nebo nežádoucí účastí v technologických výrobních procesech, tak i jako velmi nebezpečný činitel, který může nejen působit velké ekonomické škody znehodnocováním potravin, ale také nepříznivě ovlivňovat zdraví lidí konzumujících kontaminované potraviny. Plísně se používají na výrobu krmiv, fermentovaných potravin, sýrů, enzymů, organických kyselin, antibiotik, steroidů a stimulátorů růstu rostlin. Na druhé straně mají plísně významný podíl na chorobách člověka a zvířat i rostlin a znehodnocování krmiv i potravin. Do této nežádoucí kategorie patří toxinogenní houby se svými sekundárními metabolity mykotoxiny. Do první poloviny 20. století se o mykotoxiny a mykotoxikózy (onemocnění způsobené plísněmi) projevoval velmi malý zájem (s výjimkou námelových alkaloidů). Až po obrovských ekonomických ztrátách, které v 60. letech zavinila záhadná choroba krůt X (Turkey X disease) v Anglii a po následujícím objevu aflatoxinů se začíná v této oblasti intenzivně bádat (viz následující kapitolu). 4.1.2 Z HISTORIE MYKOTOXIKOLOGIE První doložené zprávy o toxicitě plesnivých potravin pocházejí z konce minulého století z Japonska. Některé z nich navazují na lidové zkušenosti, tradované ve východní Asii po staletí. Zejména je popsána mnohaletá lidová zkušenost, že žlutou rýži je třeba vystavit na několik hodin v tenké vrstvě prudkému slunci, aby pozbyla svoji toxicitu (fotolýza mykotoxinu citreoviridinu). V první polovině dvacátého století bylo známo o toxickém účinku plesnivých potravin již více. Ve 30. a 40. letech byly na území tehdejšího SSSR zkoumány vzorky obilí, napadené plísněmi rodu Fusarium. Ty, i jejich extrakty vykazovaly toxicitu pro pokusná zvířata a v praxi byly spojeny s onemocněním, které je nyní nazýváno alimentární
15 toxická aleukie (ATA), a které bylo v té době známo pod mnoha synonymy (např. "septická angína") [32]. Ve 40. letech se objevil na trhu "zázrak z plísní", penicilín, zachraňující životy u dříve naprosto beznadějných pacientů s infekcemi. Jeho rozšíření přispěla i 2. světová válka. Nadšení nad penicilínem a záhy plejádou dalších antibiotik zcela přehlušilo starší poznatky o toxicitě plísní, navíc často publikované pouze v národních jazycích a v periodicích a sbornících lokálního významu. Představa bylinkářů, léčících "podivnou plesnivinou" úspěšně i velmi těžké choroby, nalezla své místo i v krásné literatuře a dodnes přežívá i v literatuře spekulativní či alternativní. Představa autorů o penicilínu působí v této souvislosti dost bizarně, a to ze dvou důvodů: přírodní penicilín se rozkládá v žaludku a nelze jej podávat ústy jako lék (V-penicilín v tabletách je produktem farmaceutického průmyslu), takto podaný penicilín může naopak vyvolávat závažné alergické potíže. Může také negativně ovlivňovat mikroflóru trávicího ústrojí. Objevitel penicilinu sir Alexander Flemming měl mimořádné štěstí v tom, že nalezl penicilin produkující kmen, který současně neprodukoval žádný mykotoxin. Kmeny s produkcí penicilínu a neprodukující zároveň žádnou toxickou látku jsou značně vzácné. Sir Alexander Flemming nalezl jeden, jeho pozdější američtí spolupracovníci druhý. Originální produkční kmen nalezli i českoslovenští vědci, vyvíjející na konci 2. světové války v poloilegálních podmínkách preparát Mykoin B, což byl originální československý penicilín. Většina výrobců však nakonec přešla na kmen US provenience, který měl nejvýhodnější produkční vlastnosti [32]. Obnovení zájmu o toxické látky z plísní přišlo později a nečekaně. V roce 1960 uhynulo na farmách Nové Anglie několik desítek tisíc krůťat na chorobu, tehdy pojmenovanou turkey-x disease. V té době již byla pokročilejší analytická chemie a již po krátké době objeveno několik toxických látek. Byl také podán průkaz jejich původu z arašídů, které tvořily součást krmné směsi pro krůťata, a rovněž byla zjištěna produkce těchto látek plísněmi, které se v arašídech masově vyskytovaly. Protože se produkující plíseň nazývá Aspergillus flavus, byly nalezené jedy nazvány aflatoxiny. K jejich bližší identifikaci byla použita písmena, zprvu B pro modře (blue) a G pro zeleně (green) světélkující pod dlouhovlnným ultrafialovým zářením (365 nm) a číselnými indexy, značící jejich pořadí na chromatogramu při tehdy užívané tenkovrstevné chromatografii. I později byla tato tradice alespoň částečně dodržena,
16 aflatoxiny M byly nalezeny v mléce, H v játrech (hepar), P byly v době svého objevu považovány za specifické pro primáty [32]. Poměrně rychle byla zavedena práce s mykotoxiny i do tehdejší ČSSR. K zahájení výzkumu mykotoxinů na lékařské fakultě v Brně došlo v souvislosti s následující událostí. V jednom ze závodů tehdejší Fruty došlo k zaplísnění rajčat. To vedlo k výraznému senzorickému znehodnocení výrobků silně hořkou chutí. Navíc, pracovníci hygienické služby, provádějící tehdy senzorické zkoušky, onemocněli s příznaky poškození jater. Řešením problému byl tehdy pověřen doc. RNDr. Miroslav Polster, CSc., který se spojil s řadou zahraničních pracovišť a postupně přešel z výzkumu bakteriálního metabolismu na problematiku mykotoxinů.. Posléze začal výzkum veterinárních toxikóz na tehdejší VŠV Brno (nyní VFU Brno), v Hradci Králové (Dvořáčková) a ve výzkumném ústavu ČSAV v Olešnici v Orlických horách. Referenční laboratoř pro analýzu mykotoxinů byla zřízena při KHS Plzeň. Na Slovensku byl výzkum mykotoxinů a plísní soustředěn na Výzkumném ústavu preventivného lekárstva v Bratislavě. V 70. letech se výzkum i rutinní testování nejdůležitějších mykotoxinů rozšířil na mnoho dalších pracovišť. V současné době představuje vrcholové pracoviště pro mykotoxiny v potravinách a potravinových surovinách Centrum hygieny potravinových řetězců (CHPŘ) na Státním zdravotním ústavu v Brně [32]. Dnes výzkum toxinogenních plísní a mykotoxinů dosahuje velkého rozsahu. Vedle již značně prozkoumaných aflatoxinů, ochratoxinu A, patulinu jsou studovány fuzáriové mykotoxiny (trichotheceny, fumonisiny, beauvericin, zearalenon, fusarin C) a alternáriové mykotoxiny (alternariol, altenuen, kyselina tenuazonová). Základní toxikologický výzkum mykotoxinů ovšem nebyl zatím ukončen a nadále probíhá. Každým rokem jsou objevovány a chemicky charakterizovány další a další nové toxické metabolity plísní (např. nové fusariové mykotoxiny - chlamydosporoly, visoltricin a acuminatopyrone). V posledních letech byly zjištěny neurotoxické vlastnosti metabolitu mikroskopické houby Diplodia maydis (Stenocarpella maydis) při pokusech na opicích. V Africe se stále více objevují případy poškození zdraví člověka neurologického charakteru. Toxikologové proto uvažují o významu tohoto zatím chemicky neidentifikovaného toxinu pro obyvatele Afriky, kteří stále více přecházejí na monocereální dietu na bázi kukuřice. Kukuřice může uvedený toxin, ale i další mykotoxiny (např. fumonisiny), obsahovat [17].
17 4.1.3 CHARAKTERISTIKA PLÍSNÍ Plísně jsou mnohobuněčné, eukaryotní, heterotrofní, saprofytické nebo parazitické mikroorganismy, jejichž stáří se odhaduje na 300 milionů let. Patří do skupiny mikroskopických hub, která je zařazena do říše hub (Fungi). Z celkového počtu 100 000 druhů hub reprezentují mikroskopické houby zhruba 64 000 druhů obsažených v 6000 rodech. Velká morfologická rozmanitost, adaptabilita a schopnost plísní přizpůsobit se nejrůznějším ekologickým podmínkám, umožňuje jejich výskyt prakticky všude tam, kde existuje organická hmota. V životním a pracovním prostředí člověka jsou přítomny v ovzduší, půdě, vodě, na povrchu živých i odumřelých organismů, předmětů, v krmivech, v potravinových surovinách rostlinného původu a v potravinách. Potraviny jsou velmi vhodným substrátem pro osídlení, růst a rozmnožování toxinogenních plísní a pro následnou produkci mykotoxinů [1]. Pro zopakování morfologie některých nejdůležitějších plísní z potravinářského hlediska si uveďme následující nákresy: Obr. č. 1: Nákres Aspergillus flavus
18 Obr. č. 2: Nákres Penicillium roqueforti Obr. č. 3: Nákres Alternaria alternata
19 Obr. č. 4: Nákres Stachybotrys charatum Obr. č. 5: Nákres Phoma eupyrena
20 Obr. č. 6: Nákres Fusarium culmorum Toxinogenní a patogenní plísně (zhruba 350 druhů) a jejich mykotoxiny patří k významným faktorům, které mohou zhoršovat zdraví člověka i chovaných zvířat. V součastné době je známo přes 300 mykotoxinů. Toxikologický výzkum v oblasti hodnocení zdravotního rizika mykotoxinů na základě současných poznatků prokázal, že lidská populace je exponována mykotoxinům zejména z potravin (z celkového počtu 114 druhů plísní v potravinách, produkuje 65 druhů mykotoxiny). Toxinogenní druhy se vyskytují ve všech hlavních taxonomických skupinách hub. Nejznámější mykotoxiny jsou však metabolickými produkty rodů Aspergillus, Penicillium, Claviceps, Alternaria, Stachybotrys, Myrothecium, Phoma a Diploidia [1]. Pro produkci mykotoxinů toxinogenními plísněmi platí následující pravidla: Určitý mykotoxin může být produkován zástupci několika rodů toxinogenních plísní. Určitý druh toxinogenních plísní může produkovat více mykotoxinů.
21 Záchyt toxinogenních plísní v potravinách ještě neznamená přítomnost mykotoxinů v potravinách (produkce mykotoxinů závisí zejména na typu potraviny, způsobu jejího uchování, teplotě a přítomnosti mikrobiálních překážek, např. konzervačních látek). Ne všechny kmeny potenciálně toxinogenních plísní jsou toxinogenní. Upraveno podle [1]. 4.1.4 NEZBYTNÉ MINIMUM Z TOXIKOLOGIE Toxikón - řecké slovo jed, do této kategorie látek patří všechny látky, které mají výrazný škodlivý účinek na organismus již při malých dávkách. Toxikologie - věda o jedech, zabývající se nežádoucími biologickými vlastnostmi látek. Za zakladatele toxikologie je považován Paracelsus, středověký lékař 16. století. Jedy mají tři základní vlastnosti: fyzikální vzhled, zápach, hustota, barva, apod. chemické do jakých reakcí vstupují, reaktivita, apod. biologické toxické účinky na organismus jako celek, a to: akutní - projeví se ihned po požití pozdní - projevují se následně po nějakém čase, látka se zpravidla do organismu dostává postupně, opakovaně, odtud možnost tzv. chronických účinků. Toxicita Toxické účinky se zjišťují dopředu, tzv. biologickým pokusem (ten se bohužel dodnes provádí na zvířatech, jako jsou myši, morčata a opice). Míra toxicity se měří a uvádí v tzv. letální dávce, tj. dávka smrtelná, označuje se LD 50, uvádí se v gramech, nebo miligramech na 1 kilogram živé hmotnosti. Číslo 50 značí, že při požití daného množství látky uhyne 50% živých organismů a 50% přežije.
22 Toxické účinky se zkoumají pomocí testů a můžeme je rozdělit na: subakutní toxicitu (účinky jedu se projeví do 28 dní) akutní toxicitu (účinky jedu se projeví do 90 dní) chronická toxicita (účinky jedu se projeví do 1-2 let) Důležité speciální účinky jedů: karcinogenní účinky - je problém je dokázat, sleduje se vznik konkrétního nádoru (na potkanech), většinou se jedná o dlouhodobé pokusy mutagenní účinky - látky s těmito účinky jsou schopny vyvolávat změny v molekulách DNA, v 95% případech mutagenním účinkům předchází účinky karcinogenní teratogenní účinky - zasahují do vývoje embrya, negativně ovlivňují embryonální vývoj strumigenní účinky - vliv na závažná onemocnění štítné žlázy, ovlivňují distribuci jódu do štítné žlázy (inhibice transportu I 2 do štítné žlázy) Upraveno podle [30]. 4.1.5 CIZORODÉ LÁTKY V POTRAVINÁCH Upraveno podle [36] Jednoznačně nejvýznamnější cestou expozice člověka mykotoxinům jsou kontaminované potraviny, i když za určitých okolností může být značné riziko spojeno i s vdechováním spor plísní či prachových částic obsahujících tyto toxiny (např. při manipulaci s kontaminovanou potravinou). Cizorodé látky v potravinách jsou rozděleny do tří základních skupin: kontaminanty potravinová aditiva sekundární cizorodé látky
23 Kontaminanty Jedná se o znečišťující látky, které se do potravin dostávají nahodile. Patří sem: přírodní toxiny - jsou obsaženy nejčastěji v rostlinách, méně pak v živočišných tkáních, tyto látky většinou fungují jako strumigeny, karcinogeny a mutageny. Např. kyanovodík, který je obsažen v jádrech meruněk, v některých luštěninách, dále solanin, který se vyskytuje v klíčících nebo nezralých bramborách, a saponiny, které se vyskytují ve špenátu a sóji, pokud by se izolovaly, tak by měly karcinogenní a mutagenní účinky pesticidy průmyslové jedy Potravinová aditiva Přidávají se do potravin, pro zlepšení jejich prodejních vlastností (komerční účel). Patří sem látky prodlužující trvanlivost výrobků, např. při výrobě vína, zpracování masa, výroba sirupů, hořčice, mléka. Dále to jsou různá barviva ovlivňující vzhled potravin, aromatické látky na změnu vůně, látky měnící fyzikální vlastnosti výrobků (barva, vzhled). Sekundární cizorodé látky Jsou látky vzniklé nežádoucími reakcemi v potravinách díky špatnému skladování, mohou vzniknou následujícími procesy: plesnivěním (prorůstání potravin různými druhy plísní) hnitím (anaerobní rozklad bakteriemi) tlením (aerobní rozklad) kvasnými procesy (kvašení, výroba ethanolu, vína, octa, kvasné procesy jsou někdy žádoucí, někdy nikoliv) V následujících kapitolách se budeme zabývat toxickými látkami, které se mohou v potravinách vyskytovat jakožto produkty plísní mykotoxiny.
24 4.1.6 MYKOTOXINY A JEJICH DĚLENÍ Mykotoxiny jsou účinné látky mikroskopických hub (plísní), nebílkovinné povahy, toxické pro člověka a hospodářská zvířata. Rozlišení na toxiny bílkovinné a nebílkovinné povahy má praktický význam. Plísně jsou s to produkovat značné množství bílkovinných toxinů, které mají mnoho shodných rysů s bakteriálními toxiny. Jejich význam z hlediska kontaminace potravin je však zanedbatelný. Uvedená definice se vypořádává zejména s historickými okolnostmi, za jakých pojem "mykotoxiny" vznikl a s tím, že tatáž látka může být v jednom případě mykotoxinem a v jiném antibiotikem. Na této definici se shodli českoslovenští odborníci na problematiku plísní a mykotoxinů během konference "Mykotoxiny", pořádané Československou vědeckou společností pro mykologii při ČSAV v Praze roku 1983 [32]. Poznámka: Mykotoxiny tedy představují toxické látky nebílkovinné povahy. Nepočítáme mezi ně však toxiny vyšších hub, přestože některé z nich jsou mykotoxinům podobné. Uvedené uspořádání odpovídá situaci, jaká se po objevení mykotoxinů vytvořila. Zatímco toxiny vyšších hub jsou tradičně sledovány toxikology (popř. soudními toxikology), toxiny bílkovinné povahy bakteriology (jsou na jejich studium metodicky i technicky vybavení), byly od počátku 60. let sledovány nově objevené mykotoxiny především na pracovištích, zaměřených na hygienu či toxikologii výživy a krmiv. Z tohoto historického důvodu je oddělení mykotoxinů od ostatních podobných látek poněkud nelogické. Mykotoxiny rovněž rozlišujeme od fytotoxinů (vyvolávají onemocnění rostlin), antibiotik a toxinů, působících vůči bezobratlým živočichům. Látky, které působí na uvedené skupiny organismů a vedle toho ještě na člověka a hospodářská zvířata, označujeme však jednoznačně jako mykotoxiny [32]. Mezi mykotoxiny s významným zdravotním dopadem se řadí především námelové látky, aflatoxiny, trichotheceny, zearalenony, ochratoxiny, sterigmatocystin, cyklopiazonová kyselina, penicilová kyselina, patulin, citrinin, rubratoxiny, skupina tremorgenních látek a fumonisiny Některé významné mykotoxiny a jejich producenty uvádí tabulka:
25 Tab. č. 1: Některé významné mykotoxiny a jejich producenti [32] Mykotoxin Producenti Aflatoxiny Aspergillus flavus, A. parasiticus Deoxynivalenol Fusarium graminearum, F. culmorum, F. roseum Ochratoxin A Aspergillus ochraceus, P. verruculosum Patulin Penicillium expansum, P. patulum, Byssochlamys nivea Sterigmatocystin Aspergillus flavus, A. versicolor, Citrinin Penicillium citrinum, P. roqueforti, Aspergillus Candidus Kyselina α-cyklopiazonová Penicillium cyclopium, P. cammemberti, Aspergillus flavus Zearalenon Fusarium graminearum, F. roseum, F. culmorum Podle toxických účinků mykotoxinů na cílové orgány je můžeme rozdělit na několik skupin: Tab. č. 2: Toxické účinky mykotoxinů na cílové orgány [26] Dermatotoxiny trichotheceny, verrucariny, sporidesminy, psolareny Genotoxiny Hematotoxiny Hepatotoxiny Imunotoxiny Nefrotoxiny Neurotoxiny Genitotoxiny Toxiny působící na orgány dýchacího traktu Toxiny působící na orgány trávicího traktu aflatoxiny, citrinin, fumonisiny, ochratoxin A, patulin, griseofulvin, sterigmatocystin, trichotheceny, zearalenony aflatoxiny, ochratoxin A, trichotheceny, zearalenony aflatoxiny, sterigmatocystin, luteoskyrin aflatoxiny, ochratoxin A, patulin, trichotheceny, gliotoxin, sporidesmin citrinin, ochratoxin A fumonisiny, fumitremorgeny, verruculogeny, penitrem A zearalenony patulin trichotheceny
26 Rozdělení mykotoxinů podle chemické struktury je nejjednodušší. Jeho výhodou je poměrně snadné a jednoznačné zařazení jakékoli látky o známé chemické struktuře. Toto dělení mykotoxinů ilustruje tabulka: Tab. č. 3: Rozdělení mykotoxinů podle chemické struktury [26] Furanofurany aflatoxiny, sterigmatocystin, versicolorin, aj. Substituované pyreny a kyselina koji, sekalonové kyseliny aj. hydroxypyreny Substituované chinony luteoskyrin, rubratoxin, xanthomegnin, viridicatumtoxin aj. Nenasycené laktony patulin, kyselina penicillová, kyselina mykofenolová, alternariol, citreoviridin, ochratoxiny, rubratoxin B, 4,5,8-trimetylpsoralen aj. Griseofulviny griseofulvin Epoxytrichotheceny T-2 toxin, diacetoxyscirpenol, vomitoxin (=deoxynivalenol), nivalenol, fusarenony, verrucariny, roridiny, satratoxiny aj. Polycyklické kyselina cyklopiazonová, paspaliny, penitremy aj. substituované indolové deriváty Cyklické dipeptidy gliotoxin, sporidesminy, roquefortin, fumitremorgen, verruculogeny, brevianamidy aj. Mykotoxiny jiné struktury zearalenon, curvularin, citrinin, PR-toxin, canthecellin, moniliformin, kyselina betanitropropionová aj. Mykotoxiny nejsou přímo genové produkty. Jsou to sekundární metabolity, jejichž tvorba závisí na souhře enzymatických aktivit v buňce. Na druhé straně ovšem neexistence genů pro klíčové enzymy této tvorby je spojena s naprostou neschopností kultury tvořit daný mykotoxin (skupinu mykotoxinů). Z hlediska druhových či genetických podmínek toxinogenity jde o schopnost plísně produkovat ty enzymy, které se podílejí na přeměně prekursoru, zpravidla přes meziprodukty, na mykotoxin. Některé prekursory mohou být samy o sobě rovněž mykotoxiny. Nalézáme je u některých druhů, neschopných jejich další přeměny. U druhů, kde biochemická přeměna pokračuje k dalším látkám, je nacházíme často pouze ve
27 stopových koncentracích. Např. versicoloriny jsou poměrně častým toxickým metabolitem některých druhů rodů Aspergillus a Penicillium. V některých kmenech A. flavus nebo A. parasiticus dochází k jejich další přeměně, jejímž výsledkem jsou mj. aflatoxiny. V některých případech je popsána schopnost produkovat více konečných sloučenin v závislosti na tom, jaké enzymy jsou v kultuře aktivní. Podle způsobu biosyntézy (podle biochemických prekurzorů) můžeme mykotoxiny rozdělit následovně: Tab. č. 4: Rozdělení mykotoxinů podle způsobu biosyntézy [33] Biosyntéza moniliforminu moniliformin (z kyseliny octové) Biosyntéza z polyketidů patulin, ochratoxin, emodin, kyselina sekalonová, aflatoxiny aj. Biosyntéza z isoprenoidů trichotheceny, roquefortiny aj. Biosyntéza z aminokyselin kyselina cyklopiazonová, cyklické dipeptidy aj. Co se týče biochemického působení mykotoxinů na buňku, vystihuje jej následující tabulka, ze které je dobře patrné nejpravděpodobnější primární biochemické poškození buňky vybranými mykotoxiny (následuje kaskáda vedoucí k buněčné smrti neboli apoptóze). Tab. č. 5: Rozdělení mykotoxinů podle účinků na buňku [32] Inhibitory tvorby energie citreoviridin, luteoskyrin, xanthomegnin, kyselina sekalonová D, moniliformin Inhibitory proteosyntézy trichotheceny, ochratoxin A Tremorgeny penitremy (A B C), fumitremorginy (A a B), verruculogeny Modifikátory cytoskeletu griseofulvin, cytochalasiny, cyclochlorotin Estrogenní mykotoxiny zearalenon (hormonální rozvrat) Karcinogenní aflatoxin B 1 mykotoxiny
28 Zkoumáme-li mykotoxiny z hlediska jejich toxicity, zjistíme, že nejtoxičtější mykotoxiny mají LD 50 pro běžná laboratorní zvířata podobnou jako KCN (tj. cca 1 mg.kg -1 tělesné hmotnosti). Této hodnotě se blíží např. penitrem A. Většina důležitých mykotoxinů má LD 50 asi desetinásobnou (jsou tedy toxické méně). Existuje ovšem možnost vysoké toxicity vůči organismům v určité fázi vývoje (např. toxicita aflatoxinu B 1 vůči savčím a ptačím mláďatům bývá i více než desetinásobná proti toxicitě vůči dospělcům), jiné jsou s to vyvolat v dávkách netoxických pro dospělé úhyn plodu. Toxicita pro člověka je vždy pouhým odhadem podle toxicity vůči různým živočichům a dalším biologickým objektům. Karcinogenní účinky se zpravidla projevují již při dávkách, které nemají jiné pozorovatelné účinky. U některých látek je nutné zohledňovat i chronické nekarcinogenní účinky. Na základě extrapolací je poté stanovována tolerovatelná denní dávka, tj. taková, která by ani při dlouhodobém příjmu neměla vyvolávat negativní účinky. Podle akutní toxicity můžeme mykotoxiny rozdělit následovně: Tab. č. 6: Rozdělení mykotoxinů podle akutní toxicity (podle [26]) Silně toxické aflatoxiny, patulin, luteoskyrin, sporidesminy, ochratoxin A, cyklochlorotin (= islandotoxin), zearalenon (F-2 toxin), T-2 toxin, DAS (diacetoxyscirpenol), citreoviridin, rubratoxiny, penitrem A (nejnižší LD50 ze známých mykotoxinů) Středně toxické citrinin, kyselina penicillová, sterigmatocystin, kyselina cyklopiazonová Slabě toxické griseofulvin, kyselina koji, trihothecin, kyselina mykofenolová, chaetomin
29 Konkrétní hodnoty LD 50 pro některé mykotoxiny uvádí tabulka: Tab. č. 7: Rozdělení mykotoxinů podle akutní toxicity (podle [3]): Mykotoxin Toxicita, LD 50 Citreoviridin myš 7,5 mg/kg i.p. myš 20 mg/kg i.p. Citrinin myš 35 mg/kg i. p. myš 110 mg/kg i. p. Cyklopiazonová kyselina potkan 2,3 mg/kg i. p. Ochratoxin A potkaní mládě 22 mg/kg orálně Patulin myš 5 mg/kg i. p. myš 35 mg/kg orálně Roquefortin C myš 340 mg/kg i.p. i. p. znamená intraperitoneální injekci (do pobřišnicové dutiny). 4.1.7 TOXINOGENITA Toxinogenitou se nazývá schopnost organismů tvořit toxiny. Aplikováno na plísně - jde o schopnost tvorby mykotoxinů. Všechny kmeny druhů plísní, u nichž byla zjištěna produkce určitého mykotoxinu, považujeme za potenciálně toxinogenní pro daný mykotoxin. Pokud u konkrétních kmenů stanovíme toxinogenitu, hovoříme potom o toxinogenitě (pozitivní) nebo netoxinogenitě (negativní). Pozitivní toxinogenita pak znamená, že daný kmen je za určitých podmínek schopen produkovat daný mykotoxin. Vyšetření konkrétního kmene má tedy vždy vyšší výpovědní hodnotu než pouhé konstatování jeho příslušnosti ke druhu, který je schopen v některých případech produkovat mykotoxiny. Tvorba mykotoxinů je závislá vedle druhu mikroskopické houby na chemických, fyzikálních a biologických podmínkách růstu [32]. Již jsme si objasnili, že mykotoxiny nejsou přímo genové produkty. Jsou to sekundární metabolity, jejichž tvorba závisí na aktivitě určitých enzymů v buňkách plísní. U mnohých mikroskopických vláknitých hub je popsána schopnost produkovat více konečných
30 chemických sloučenin v závislosti na tom, jaké enzymy jsou v kultuře aktivní. Převahy určité konkrétní sloučeniny v kultuře lze potom dosáhnout např. změnou teploty nebo specifickými inhibitory některých enzymů [32]. Mezi nejdůležitější fyzikální vlastnosti ovlivňující tvorbu mykotoxinů patří teplota. Zpravidla existuje určité teplotní rozmezí, ve kterém mohou být mykotoxiny produkovány, přičemž od optima směrem k limitům klesá jednak množství produkovaného toxinu, jednak často i procento kmenů, schopných produkovat detekovatelné množství mykotoxinu [32]. Důležité jsou osmotické vlastnosti substrátu, charakterizované nejlépe tzv. vodní aktivitou (a w ). I zde existuje zpravidla rozmezí hodnot, ve kterém lze zaznamenat produkci mykotoxinů. Je nutno zdůraznit, že posun a w mimo optimální hodnoty neznamená usmrcení kultury. Dochází k přežívání spor a za určitých okolností i myceliálních buněk. Po návratu vodní aktivity do rozmezí slučitelného s dalším růstem plísně dojde k jejímu dalšímu nárůstu [32]. Pro představu o vlivu vodní aktivity na růst plísně a produkci mykotoxinů si uveďme následující údaje: Optimální aktivita vody pro většinu plísní je a w > 0,95. Aspergillus flavus má spodní hranici růstu při a w = 0,78 a tvorby aflatoxinů při a w = 0,28 až 0,84 [3]. Čas musíme chápat jako rovněž fyzikální veličinu. I na něm závisí obsah mykotoxinů v substrátu, protože mycelium začne produkovat měřitelná množství mykotoxinů až po určité době (Aspergillus flavus např. od období, kdy začne sporulovat) a po vyčerpání zdrojů v substrátu se produkce zastaví. Obsah mykotoxinů poté klesá přirozeným rozkladem [32]. Z chemických faktorů je důležitý přísun energie a nezbytných chemických látek, které buňky plísní potřebují jako vstup do svého metabolismu. V některých případech ovšem množství živin naopak omezuje produkci mykotoxinu, protože kultura není nucena aktivovat některé enzymatické systémy a jejich nízká aktivita v kultuře vede i k nízké až nedetekovatelné produkci sekundárních metabolitů. Důležitý je také přísun kyslíku. Při jeho nedostatku dochází k poklesu produkce mykotoxinů a posléze k zástavě růstu kultury. Naopak je znám vliv látek aktivujících enzymatické systémy, jako jsou např. barbituráty, PCB, některá rozpouštědla a pod., které mohou produkci mykotoxinů až zmnohonásobit [11].
31 Toxinogenita je stanovována zpravidla kultivací izolovaného kmene za standardních podmínek, které se podle autora metody blíží optimálním podmínkám produkce mykotoxinu. V některých případech je možné volit takové složení substrátu, které umožňuje zjednodušený postup při jeho analýze [32]. Poznámka: Toto si můžeme demonstrovat na následujícím příkladě: Pro aflatoxiny byla vypracována metoda stanovení jejich produkce kmeny Aspergillus flavus a A. parasiticus na karlovarských sucharech. Na uvedeném substrátu dochází poměrně rychle k silné produkci aflatoxinů, dané patrně kombinovaným vlivem struktury substrátu, obsahu živin a obsahu mikroelementů v tomto materiálu. Suchary rovněž prakticky neobsahují látky rušící při tenkovrstevné chromatografii, takže lze analyzovat již hrubý acetonový nebo chloroformový extrakt z kultury bez jakékoli další úpravy kromě zahuštění [33]. Přítomnost spor toxinogenního kmene neznamená zdaleka ještě výskyt mykotoxinů. V naprosté většině případů jsou samy o sobě prosty mykotoxinů, jen několik málo druhů plísní obsahuje významné množství svých mykotoxinů ve sporách (Stachybotrys atra, Pithomyces chartarum). Znamená však, že jakmile nastanou vhodné podmínky pro růst mycelia a produkci mykotoxinů, pak k této produkci s vysokou mírou pravděpodobnosti také dojde [2]. 4.1.8 EKOLOGICKÁ FUNKCE MYKOTOXINŮ Úloha mykotoxinů v ekologii mikroskopických hub není dosud zcela jasná. Předpokládá se všeobecně, že za určitých okolností je jejich produkce pro daný kmen plísně výhodná dává se do souvislosti s antibiotickou a antifungální aktivitou některých mykotoxinů [32]. Uvedené zvýhodnění toxinogenních kmenů platí patrně pouze za zvláštních podmínek. V kulturách se běžně stává, že plísně svou mykotoxinogenitu postupně nebo i náhlým skokem ztrácejí. Rovněž je známo, že při současném pěstování toxinogenního a netoxinogenního kmene stačí relativně nízká příměs spor netoxinogenního kmene v kultuře, aby produkce mykotoxinů dramaticky poklesla [32]. Sami lidé vytvářejí, zejména při velkovýrobě potravin a krmiv, ekologické systémy, v nichž se mohou mikroskopické houby dobře množit, a na něž se postupně adaptují [32].
32 4.2 SPECIÁLNÍ ČÁST 4.2.1 PŘEHLED NEJDŮLEŽITĚJŠÍCH MYKOTOXINŮ 4.2.1.1 AFLATOXINY Historie objevu Jak již bylo zmíněno v kapitole 1.2 (Z historie mykotoxikologie), k objevení aflatoxinů došlo při hledání příčin hromadného výskytu onemocnění drůbeže (Turkey X disease) v Anglii roku 1960. Brzy se zjistilo, že choroba není infekční, ale že má dietetický charakter: základní a složkou krmiva pro drůbež byla moučka z brazilské podzemnice olejné. V chloroformovém extraktu z krmiva se zjistila toxická složka, která způsobovala onemocnění a na papírových chromatogramech tvořila modře fosforeskující skvrnu. Současně se prokázalo, že v toxických oříšcích podzemnice se nachází Aspergillus flavus jako producent toxinu, který pojmenovali aflatoxin. Tenkovrstevnou chromatografií se tento aflatoxin rozdělil na čtyři složky: dvě jevily modrou fluorescenci a dostaly označení aflatoxin B 1 a B 2, další dvě fosforeskovaly tyrkysově a dostaly označení aflatoxin G 1 a G 2. Jejich chemické struktury byly objasněny již v roce 1963. Z extraktů z mléka od krav, které byly krmeny podzemnicovou moučkou byly později izolovány další dva aflatoxiny aflatoxin M 1 a M 2 [1]. Chemická struktura, účinky na organismus a mechanismus působení Za základní považujeme aflatoxiny B 1, B 2, G 1, a G 2. Aflatoxiny dalších řad (M, P, H, Q aj.) byly nejprve zjištěny jako metabolity předchozích jmenovaných aflatoxinů v organismu lidí a zvířat (např. aflatoxiny M 1 a M 2 vznikají v organismu dojnic při podání krmiva kontaminovaného aflatoxiny B 1 a B 2 jejich hydroxylací), později byli ovšem nalezeni a vyselektováni jejich producenti [36]. Aflatoxin B 1 je nejsilnější dosud známý přírodní karcinogen. Častý výskyt jaterních karcinomů u populace v některých oblastech východní Asie a Afriky se dává do souvislostí s vysokým dietárním příjmem aflatoxinů. Aflatoxin B 1 působí také akutně hepatotoxicky [36]. Poznámka: Jeden z nejtragičtějších případů akutní otravy člověka aflatoxiny byl zaznamenán i Indii v roce 1974, kdy v důsledku konzumace plesnivé kukuřice onemocnělo zhruba 1000 lidí, z nichž 100 zemřelo. Hodnota LD 50
33 pro psy se pro aflatoxin B 1 pohybuje v rozmezí 0,35 0,50 mg.kg -1 tělesné hmotnosti, odhad hodnoty LD 50 pro člověka je poněkud vyšší [36]. Mechanismus působení aflatoxinů v lidském organismu souvisí s interakcí jejich reaktivních metabolitů s DNA a následnou inhibicí její replikace a transkripce. Aktivovaný derivát aflatoxinu tedy inhibuje také syntézu RNA, proteinů a další následné děje. Proto vedle výše popsaných syndromů existuje řada dalších negativních biologických odezev vyvolaných těmito mykotoxiny. Jako příklady lze uvést Reyův syndrom, respirační onemocnění, chronickou gastritidu, duševní retardaci dětí a stavy snížení imunity [36]. Obr. č. 7: Chemická struktura aflatoxinu B 1 Producenti, výskyt Nejvýznamnějšími producenty aflatoxinů jsou kmeny Aspergillus flavus a A. parasiticus. Produkce aflatoxinů silně závisí na teplotě, vlhkosti, přístupu vzduchu, struktuře a chemickém složení substrátu. Např. byly prokázány inhibiční účinky tvorby aflatoxinů u kofeinu [36]. Důležité jsou i vlivy doprovodné mikroflóry (např. inhibice tvorby aflatoxinů vlivem Aspergillus niger) [32].
34 Nejvyšší nálezy aflatoxinů byly zaznamenány u podzemnice olejné, pistácií, paraořechů a kukuřice. Nižší hladiny aflatoxinů lze obvykle nalézt i v mandlích, vlašských ořechách, hrozinkách, fících a různých druzích koření. Aflatoxiny jsou poměrně hydrofilní sloučeniny a proto není jejich afinita k tukové složce potravinářských surovin vysoká, např. při výrobě rostlinných olejů se koncentrují ve šrotech. Při zpracování mléka, při kterém dochází k oddělení mléčného tuku, je potom nutné počítat s relativním nárůstem aflatoxinu M 1 např. v odtučněném tvarohu, syrovátce, podmáslí apod. Závěrem je nutno zdůraznit, že většina problémů s aflatoxiny u nás souvisí především s dovezenými potravinami, krmivy a surovinami. Riziko napadení příslušnými toxinogenními plísněmi je totiž vysoké především v subtropických a tropických klimatických podmínkách [36]. 4.2.1.2 OCHRATOXIN A Historie objevu K objevu ochratoxinů došlo v Jihoafrické republice při laboratorním vyšetřování toxinogenních hub izolovaných ze zemědělských plodin. Producenty těchto toxinů byly plísně Aspergillus ochraceus a kukuřice infikovaná touto plísní způsobila smrt pokusných zvířat [36]. Chemická struktura, účinky na organismus a mechanismus působení Ochratoxin A obsahuje ve své molekule fenylalanin a substituovaný 3,4- dimethylisokumarin. Mechanismus toxicity ochratoxinu A spočívá v tom, že fenylalaninová část jeho molekuly je t-rna zaměněna za fenylalanin. Ten je však v ochratoxinu A navázán na kumarinovou část, která brání jeho navázání do proteinového řetězce. Tím dojde k zastavení proteosyntézy [32]. Někteří autoři [1] popisují i negativní zásah ochratoxinu A do procesů glukoneogeneze a dýchacího řetězce. Nejzávažnějším biologickým účinky na úrovni organismu je nefrotoxicita, dále byla prokázána jeho hepatotoxicita, imunotoxicita a karcinogenita [36].
35 Poznámka: U člověka je expozice ochratoxinu A spojována s tzv. balkánskou endemickou nefropatií onemocněním ledvin (BEN z angl. Balcan Endemic Nephropathy) [36]. Obr. č. 8: Chemická struktura ochratoxinu A Producenti, výskyt Kromě již zmíněného Aspergillus ochraceus jsou producenty ochratoxinu A také další druhy rodů Aspergillus a také Penicillium, především Penicillium viridicatum [36]. Ochratoxin se nejčastěji vyskytuje v cereáliích (naše obilí zpravidla obsahuje detekovatelné, ale podlimitní koncentrace). Dalším zdrojem jsou masné výrobky, což je dáno faktem, že ochratoxin A vytváří rezidua ve tkáních. Např. význačným zdrojem ochratoxinu je vepřová krev, v níž je ochratoxin vázán na albumin (to je příčinou možného výskytu ochratoxinu A v krevních specialitách), v játrech koncentrace dosahují až stovek µg.kg -1. Byla rovněž popsána produkce ochratoxinu A kulturními plísněmi, používanými k finalizaci některých uzenářských výrobku (uherský salám apod.) [36]. Významným zdrojem ochratoxinu též může být káva. Toto zjištění souvisí s nálezy toxikologicky významných koncentrací ochratoxinu A v lidské krvi v krevních konzervách (Německo, Rakousko, Švýcarsko). Při cíleném pátrání po zdroji byl prokázán právě původ z kávy [33].
36 4.2.1.3 STERIGMATOCYSTIN Chemická struktura, účinky na organismus Sterigmatocystin je sekundární metabolit plísní chemicky podobný aflatoxinům. Zdá se, že část biochemických pochodů, vedoucích ke tvorbě mykotoxinů, mají sterigmatocystin a aflatoxiny společnou [36]. Tento mykotoxin je pro člověka akutně silně toxický (hepatotoxicita) a obdobně jako aflatoxiny vykazuje prokazatelnou hepatokarcinogenitu [36]. Obr. č. 9: Chemická struktura sterigmatocystinu Producenti, výskyt Jedním z nejvýznačnějších producentů je Aspergillus versicolor, mezi typické producenty patří i Aspergillus flavus a Aspergillus parasiticus [36]. Dále je produkován širším spektrem druhů Chaetomium a Emericella, dále druhy Bipolaris nodulosa, Farrovia malayensis a Monocillium nordinii [32]. Přítomnost sterigmatocystinu (obvykle spolu s aflatoxiny) byla prokázána v cereáliích, kávových zrnech, z živočišných produktů pak v šunce, salámech i sýrech [36].
37 4.2.1.4 PATULIN Historie objevu Patulin byl původně ve 40. letech popsán jako antibiotikum a dokonce po krátký čas léčebně využíván. Byl charakterizován jako antibiotikum účinné proti gramnegativním i grampozitivním bakteriím, popsány byly i jeho antivirové účinky (inhibice replikace retrovirů). Po objevení karcinogenity vůči zvířatům byl stažen a dnes je považován za nebezpečný mykotoxin [32, 36]. Chemická struktura, účinky na organismus a mechanismus působení Chemicky se patulin řadí mezi mykotoxiny laktonového typu. Je velmi dobře rozpustný ve vodě. Karcinogenita a mutagenita patulinu souvisí s inhibicí transkripce RNA a selektivním poškozováním DNA. Prokázány byly také negativní účinky na gastrointestinální trakt, neurotoxické a imunotoxické efekty [36]. Obr. č. 10: Chemická struktura patulinu
38 Producenti, výskyt Je produkován řadou druhů mikroskopických hub rodů Aspergillus, Byssochlamys a Penicillium (název je odvozen od P. patulum) [1]. V přírodě je poměrně rozšířen, důležitá je zejména jeho produkce na kazícím se ovoci, velice často v jablkách, ale prokázán byl i v hroznech, pomerančích apod. Jde o relativně běžný kontaminant ovocných koncentrátů a džusů vyrobených z těchto surovin, zejména bylo-li k jejich výrobě použito ovoce ve vysokém stupni zralosti či poškozené. Závažnou je zejména kontaminace ovocných dření, určených pro dětskou a kojeneckou výživu [33]. Detoxikace Patulin je jeden z mála dobře detoxikovatelných mykotoxinů. Odstranění mycelia, případně i s částí přilehlé biomasy nemá pro dekontaminaci význam, protože ve vodě dobře rozpustný lakton snadno difunduje do celého objemu materiálu. Lze ovšem uvést následující doporučení: Zahuštění ovocné šťávy vakuovou destilací snižuje obsah patulinu v průměru o 25 %. Pasterace (90 C po dobu 10s) HTST z angl. High Temperature Short Time sníží obsah patulinu v jablečném džusu o 20 %. Při dlouhodobém záhřevu při 125 C (4,5 hod.) by se snížil obsah patulinu až o 90 %. Ke snížení obsahu patulinu v potravinách dochází zřejmě také při mikrovlnném ohřevu (o 40 až 95 % původní koncentrace). Byl prokázán rozklad patulinu během alkoholického kvašení (ve vínech se patulin prakticky nevyskytuje). Upraveno podle [36]. 4.2.1.5 CYKLOPIAZONOVÁ KYSELINA Chemická struktura, účinky na organismus Kyselina α-cyklopiazonová je metabolicky odvozena od aminokyseliny tryptofanu [1]. Co se týče biologického působení, při podání této látky pokusným zvířatům per os dochází především k postižení trávicí trubice (druhová specifita místa postižení je dána místem jejího
39 největšího vstřebávání) a jater. Při podání obcházejícím jaterní bariéru byly pozorovány u běžných hospodářských a laboratorních zvířat (savců) křeče a úhyn. Byly popsány zejména změny v transportu iontů vápníku, vedoucí k osmotické smrti buněk (tedy i nekrotické změny kosterní svaloviny i myokardu). Kyselina cyklopiazonová je považována za potenciální karcinogen, zjistila se její mutagenita pro Salmonella typhimurium [1]. Obr. č. 11: Chemická struktura kyseliny cyklopiazonové Producenti, výskyt Kyselina cyklopiazonová je produkována větším množstvím druhů rodů Aspergillus a Penicillium. Byla objevena v roce 1968, kdy byla izolována z Penicillium cyclopium. V menším množství se mykotoxin pravidelně vyskytuje v plísňových sýrech pod pokryvem Penicillium camemberti, vyskytuje se i v tavených sýrech (sem se dostává s plesnivými odkrojky), plísňových salámech apod. Nedodržení klasické technologie camembertských sýrů může vést k mohutnému (až o tři řády) vzestupu její koncentrace v plísňovém pokryvu. Obsah kyseliny cyklopiazonové se také zvyšuje v sýrech s bílou plísní na povrchu při jejich nevhodném skladování, především při vyšších teplotách [31]. Dalším uvažovaným zdrojem je drůbeží maso (rezidua vzniklá příjmem kyseliny cyklopiazonové krmivem) [32].
40 4.2.1.6 CITRININ Chemická struktura, účinky na organismus Původně byl objeven a používán (ve 40. letech 20. století) jako antibiotikum, ale pro značnou toxicitu byl vyřazen jako silný mykotoxin. Citrinin je silně nefrotoxický a interferuje s metabolickými procesy v játrech (inhibuje některé enzymy, zejména zasahuje do metabolismu lipidů), což vede k jejich poškození. V experimentech se zvířaty byla prokázána jeho karcinogenita i mutagenita [36]. Může se vyskytovat společně s ochratoxinem a snad jde i o jeho prekursor [32]. Inhibuje také růst rostlin a hub tím, že poškozuje funkci jejich buněčných membrán [1]. Obr. č. 12: Chemická struktura citrininu Producenti, výskyt Je produkován některými druhy rodu Penicillium a také Aspergillus. V mírném klimatickém pásmu a tedy i v našich podmínkách je zejména kontaminantou obilí [32].