UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ. Katedra anorganické a organické chemie

UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ Katedra anorganické a organické chemie Diplomová práce ANALÝZA LIPIDŮ V EPIDERMIS SE SNÍŽENOU EXPRESÍ FILAGGRINU Vedoucí práce: Doc. PharmDr. Kateřina Vávrová, Ph.D. Hradec Králové 2014 Michaela Sochorová

Ráda bych poděkovala všem, kteří umožnili vznik této práce. V první řadě děkuji své školitelce Doc. PharmDr. Kateřině Vávrové, Ph.D. za odborné vedení, milé a vstřícné jednání a za cenné rady k vypracování diplomové práce. Dále děkuji všem pracovníkům Katedry anorganické a organické chemie za vytvoření příjemných pracovních podmínek. Poděkování dále patří Dr. Sarah Küchler (Institute for Pharmacy Pharmacology and Toxicology, Freie Universität Berlin) a všem pracovníkům, kteří se podíleli na přípravě kožních modelů a průběhu studie. Za finanční pomoc děkuji Grantové agentuře České republiky (13-23891S) a grantu Specifického vysokoškolského výzkumu (260 062). 2

Prohlašuji, že tato práce je mým původním autorským dílem, které jsem vypracovala samostatně. Veškerá literatura a další zdroje, z nichž jsem při zpracování čerpala, jsou uvedeny v seznamu použité literatury a v práci jsou řádně citovány. Práce nebyla využita k získání jiného nebo stejného titulu. Hradec Králové 2014 Michaela Sochorová 3

OBSAH ABSTRAKT... 6 ABSTRACT... 7 1 Úvod a cíl práce... 8 2 Teoretická část... 9 2.1 Stratum corneum... 9 2.1.1 Ceramidy (Cer)... 9 2.1.2 Vnitřní uspořádání SC... 11 2.2 Atopická dermatitida (AD)... 12 2.2.1 Porucha kožní bariéry u AD... 12 2.3 Filaggrin(FLG)... 13 2.3.1 Optimální ph SC... 14 2.3.2 Role FLG při rozvoji AD... 15 2.4 Metody analýzy lipidů SC... 16 2.4.1 Vysokoúčinná tenkovrstvá chromatografie (HPTLC)... 17 2.4.1.1 Metody detekce... 18 2.4.2 Extrakce lipidů z biologického materiálu... 18 2.5 Využití HPTLC v praxi... 19 2.5.1 Bleck, O.et al.; J. Invest. Dermatol. 1999... 19 2.5.2 Uchida, Y. et al.; J. Lipid Res. 2000... 20 2.5.3 Hamanaka, S. et al.; J. Invest. Dermatol. 2002... 21 2.5.4 Breiden, B. et al.; Eur. J. Cell Biol. 2007... 22 2.5.5 Pappinen, S. et al.;biochim. Biophys. Acta 2008... 22 3 Experimentální část... 25 3.1 Materiál... 25 3.2 Modely lidské kůže a izolace stratum corneum (SC)... 25 3.3 Izolace lipidů... 26 3.4 Příprava kalibrací... 26 4

3.5 Vysokoúčinná tenkovrstvá chromatografie (HPTLC) kožních lipidů... 26 3.6 Identifikace lipidů při HPTLC analýze... 27 3.6.1 Důkaz lipidů obsahujících esterovou vazdu (CerEOS, CerEOH a PL) bazickou hydrolýzou... 27 3.6.2 Důkaz lipidů specifickými činidly... 28 3.7 Kvantifikace kožních lipidů a zpracování dat... 30 4 Výsledky a diskuse... 32 4.1 HPTLC stanovení lipidů... 32 4.1.1 Kalibrace a kvantifikace... 34 4.2 Celkový obsah kožních lipidů... 35 4.3 Profily Cer... 36 4.4 Vliv kyseliny dokosahexaenové (DHA) na obsah kožních lipidů... 39 5 Závěr... 42 6 Seznam použitých zkratek... 43 7 Literatura... 44 5

ABSTRAKT Univerzita Karlova v Praze, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra anorganické a organické chemie Michaela Sochorová Školitel: Doc. PharmDr. Kateřina Vávrová, Ph.D. Název diplomové práce: Analýza lipidů v epidermis se sníženou expresí filaggrinu Filaggrin (FLG) je důležitým prvkem správného vývoje pokožky a její funkce jako kožní bariéry. Mutace genu pro FLG a ztráta jeho funkce jsou spojeny s onemocněními jako ichtyosis vulgaris nebo atopický ekzém. Cílem práce bylo zjistit dopad nepřítomnosti FLG na lipidovou matrix stratum corneum (SC). K analýze jsme používali in vitro připravované modely kůže se sníženou (FLG-) i normální expresí FLG (FLG+). Tyto modely nám umožnily sledovat izolovaně vliv FLG na složení a uspořádání lipidů ve SC. FLG je protein, který je ve SC degradován na metabolity, které způsobují acidifikaci SC. Určité ph je důležité pro správnou aktivitu enzymů, které katalyzují vznik ceramidů z jejich prekurzorů. Předpokládali jsme proto snížení obsahu ceramidů v kožní bariéře, kde je redukována hladina FLG. Náš předpoklad byl podložen nálezy u pacientů s atopickou dermatitidou. Nicméně HPTLC analýza ukázala, že množství lipidů je podobné v obou typech modelů. Jediným statisticky významným rozdílem mezi modely byl téměř dvojnásobný obsah mastných kyselin ve SC s FLG-. Na základě těchto výsledků byla dále sledována hodnota ph SC a aktivita sekreční fosfolipázy A 2 (PLA 2 ). Zjištěné ph bylo v normě a byla potvrzena zvýšená aktivita PLA 2. To znamená, že přeměna fosfolipidů na mastné kyseliny zprostředkovaná PLA 2 je dalším mechanismem acidifikace SC. Nicméně, zvýšení obsahu mastných kyselin ve SC vede ke zhoršenému uspořádání lipidových lamel. Porucha uspořádání a tím způsobená vyšší pohyblivost hydrofobních řetězců lipidů má negativní vliv na kožní bariéru. Ta se stává propustnější pro lipofilní látky. Potvrdili jsme tedy, že existuje zpětná vazba mezi FLG a produkcí mastných kyselin pomocí PLA 2, jakožto mechanismy acidifikace SC. Výsledky dále ukazují, že snížené množství ceramidů v atopické pokožce je pravděpodobně způsobeno mechanismy nezávislými na FLG. 6

ABSTRACT Charles University in Prague, Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Inorganic and Organic Chemistry Michaela Sochorová Supervisor: Doc. PharmDr. Kateřina Vávrová, Ph.D. Title of Diploma thesis: Analysis of lipids in epidermis with filaggrin knock-down Filaggrin (FLG) is crucial for correct development of epidermis and for its function as a skin barrier. Mutation in the FLG gene and loss of its function is associated with diseases such as ichthyosis vulgaris and atopic dermatitis. The aim of the study was to evaluate the impact of FLG knock-down on the composition of intercellular lipids in the stratum corneum (SC). We used in vitro skin constructs with reduced (FLG-) and normal gene expression (FLG+) for the analysis. It enabled us to study separately the influence of FLG on the composition and organization of SC lipids. FLG is a protein which is degraded to metabolites which cause an acidification of SC. ph is important for optimal activity of enzymes which are pivotal for formation of ceramides from their precursors. Therefore we assumed lower ceramide content in skin barrier when FLG is reduced. Our assumption was supported with findings in patients with atopic dermatitis. However our HPTLC analysis showed that the amount of lipids is similar in both FLG- and FLG+ skin construct. The only statistically significant difference was the nearly twofold higher content of free fatty acids in FLG- construct. Based on this finding, ph of SC and an activity of secretory phospholipase (PLA 2 ) were evaluated. SC ph was optimal and increased PLA 2 activity was confirmed. This means, that conversion of phospholipids into fatty acids by PLA 2 is another mechanism how to acidify SC. Nevertheless, the increased level of free fatty acid causes decreased skin lipid order. Disorder and higher mobility of hydrophobic chains has a negative effect on skin barrier since it becomes more permeable for lipophilic substances. In conclusion, we found a feedback mechanism between FLG and fatty acid-based acidification pathways in the skin. The lower ceramide levels previously described in atopic dermatitis are probably caused by mechanisms independent of FLG. 7

1 Úvod a cíl práce Filaggrin (FLG) je důležitým strukturním i funkčním prvkem kůže. Mimo jiné se podílí na tvorbě a správné funkci kožní bariéry. Nedostatek FLG je spojován s onemocněními jako ichtyosis vulgaris (IV) a atopická dermatitida (AD). Od prokázání spojitosti mezi mutacemi genu pro FLG, jeho následným nedostatkem a manifestací kožních onemocnění proběhla řada výzkumů zabývajících se tímto proteinem jako jednou z hlavních příčin rozvoje IV a AD. Ačkoli přinesly mnoho nových poznatků do patofyziologie těchto kožních onemocnění, jejich kompletní mechanismus rozvoje a soubor všech rizikových faktorů není doposud uspokojivě vysvětlen. Je známo, že k rozvoji AD dochází v důsledku porušené ochranné funkce kožní bariéry v kombinaci s imunitní reakcí organismu. Porucha fyziologické funkce kožní bariéry u AD je způsobena sníženým obsahem ceramidů (Cer) ve stratum corneum (SC). Cer jsou syntetizovány z prekurzorů za účasti enzymů glukocerebrosidáza a sfingomyelináza. Tyto enzymy potřebují pro svoji aktivitu kyselé ph v určitém rozmezí. Správná hodnota ph je zajištěna několika mechanismy. Jedním z nich je hydrolytické štěpení FLG za vzniku kyselých produktů. Předpokládali jsme proto, že epidermis s nedostatkem FLG nebude mít dostatečně nízké ph pro aktivitu enzymů, které syntetizují Cer z jejich prekurzorů, a tím bude i nižší obsah Cer ve SC. Nižší obsah Cer u AD byl prokázán mnohými studiemi, žádná se ale doposud nezabývala FLG jako jeho možnou příčinou. Cílem práce bylo prokázat nebo vyvrátit spojitost mezi sníženou expresí genu pro FLG a sníženým obsahem Cer u pacientů s AD pomocí in vitro kožních modelů se sníženou expresí FLG. 8

2 Teoretická část 2.1 Stratum corneum Stratum corneum (SC) je vnější vrstva pokožky a splňuje funkci kožní bariéry. Správně fungující kožní bariéra mimo jiné brání ztrátám esenciálních látek a vody z kůže a zamezuje průniku škodlivin a infekčních částic do nižších vrstev pokožky a do organismu. 1, 2 SC se skládá ze dvou hlavních komponent: korneocytů a intercelulární lipidové matrix. Korneocyty jsou keratinocyty v posledním stádiu diferenciace, zodpovídají za mechanickou odolnost SC a jsou vysoce odolné vůči chemikáliím, zatímco lipidy představují základní prvek omezené propustnosti SC pro vodu a jiné látky. 2, 3 Tato hydrofobní lipidová matrix je specifická svým složením a organizací. Skládá se z ceramidů (Cer), cholesterolu (Chol) a volných mastných kyselin (MK), v poměrném zastoupení 50, 25 a 10 20 %. Zbytek představují organické estery cholesterolu a cholesterol-sulfát. Na rozdíl od běžných membrán, SC neobsahuje žádné fosfolipidy. 3, 4 2.1.1 Ceramidy (Cer) Charakteristickou a velice důležitou složkou pro bariérovou funkci SC jsou Cer. Strukturně se jedná o aminoalkoholy acylované na dusíku mastnými kyselinami (MK). Aminoalkoholy v Cer SC jsou sfingosin (S), fytosfingosin (P), 6-hydroxysfinosin (H) a dihydrosfingosin (ds). Primární aminoskupina těchto sfingoidních bazí je acylována MK, která je buď nesubstiuovaná (N) nebo α-hydroxylovaná (A). Délka MK se pohybuje v rozmezí od 16 do 26 uhlíků, nejčastěji jsou zastoupeny kyseliny s řetězcem dlouhým 24 uhlíků. 5 Unikátní pro Cer SC jsou MK obsahující hydroxylovou skupinu v poloze ω, jejichž řetězce jsou tvořeny 28 až 36 uhlíky. Na ω-hydroxyl je dále esterově vázaná kyselina linolová (EO). 6 V současné době rozlišujeme 12 strukturních typů Cer, které jsou různou kombinací základní baze a MK. Cer jsou označovány pomocí kombinace písmen (viz výše), která koresponduje se strukturou Cer. Například sfingosin acylovaný nesubstituovanou MK je označován jako CerNS. Všechny strukturní typy zobrazuje Obr. 1. 9

Obr. 1 Strukturní typy ceramidů. Označení Cer arabskými číslicemi je dnes už méně používané, jelikož nezahrhuje všechny známé Cer. Zde uvedeno pro úplnost. Přednost se dává nomenklatuře dle Motty 7, označení kombinací písmen. 10

Cer vznikají z prekurzorů, glukosylceramidů (GCer) a sfingomyelinů (SM), které jsou společně s hydrolytickými enzymy a steroly skladovány v lamelárních tělíscích v keratinocytech ve stratum granulosum (SG). Na rozhraní SG a SC splývá membrána tělísek s plazmatickou membránou buněk a obsah granul je uvolněn do mezibuněčného prostoru. 8 Zde jsou polární prekurzory za účasti lyzozomálních enzymů glukocerebrosidázy a sfingomyelinázy, štěpeny na hydrofobnější Cer. Takto vzniklé Cer společně s MK a Chol vytvářejí lamelární strukturu charakteristickou pro kožní bariéru. 2.1.2 Vnitřní uspořádání SC Molekula Cer se skládá z polární hlavy a dvou hydrofobních řetězců, podobně jako molekula fosfolipidu. Na rozdíl od těchto je ale polární hlava Cer výrazně menší a lipofilní řetězce tvořené nasycenými MK jsou dlouhé a nerozvětvené. MK obsažené v SC jsou nasycené, nejčastěji se vyskytující kyseliny mají řetězce dlouhé 24, 26 a 28 uhlíků. Tyto charakteristické fyzikální vlastnosti Cer a MK umožňují jejich těsnější uspořádání do několikavrstevných lamel. Propustnost lipidových lamel je díky tomu řádově tisíckrát menší než propustnost fosfolipidových dvojvrstev. 5 Chol v lipidových membránách funguje jako jejich stabilizátor a zajišťuje určitý stupeň fluidity nezbytný pro pružnost kůže. Bez Chol by kůže byla rigidní a křehká. 3, 9 Korneocyty SC postrádají veškeré organely a lze je zjednodušeně popsat jako vysoce nerozpustnou proteinovou matrix, která se skládá z organizovaných vláken keratinu a která je obklopena proteinovou korneocytální obálkou. 10 Na tuto proteinovou vrstvu se z její vnější strany kovalentně připojuje monovrstva specializovaných lipidů, která představuje rozhraní mezi hydrofilním povrchem korneocytu a vysoce lipofilní lipidovou matrix. Monovrstva vzniká z části Cer typu EO, ze kterých se odštěpí kyselina linolová, vzniklý ω-hydroxycer se pak kovalentně naváže na zbytek kyseliny glutamové na povrchu korneocytu. Tyto kovalentně vázané lipidy představují templát pro tvorbu lipidových lamel. 5,9,11 Významnou roli uvnitř SC má voda. Ovlivňuje a udržuje její pružnost a celistvost. Dále podporuje enzymatické a katabolické děje, které řídí správnou tvorbu a následnou deskvamaci tkáně. Udržování malého a nezbytného obsahu vody (10 % ve zdravé kůži) je zajištěno převážně díky směsi hygroskopických nízkomolekulárních sloučenin označované jako přirozený hydratační faktor (NMF natural moisturizing factor). 10 11

Změny v celkovém množství především Cer a i v jejich poměrném zastoupení jsou spojovány s řadou kožních onemocnění. 2.2 Atopická dermatitida (AD) AD je chronické neinfekční zánětlivé onemocnění kůže. Charakteristickými projevy jsou zánět kůže, suchost a svědění. Etiologie je multifaktoriální, při rozvoji onemocnění se uplatňuje genetická dispozice, porucha kožní bariéry a imunologická dysbalance. Jednotlivé složky jsou u každého jedince různě vyjádřené, proto je AD charakteristická pestrým průběhem klinického obrazu. Kožní projevy se objevují obvykle v kojeneckém či dětském věku, někdy však až v dospělosti. 12 2.2.1 Porucha kožní bariéry u AD Atopická suchá kůže se projevuje narušenou bariérovou funkcí, která je indikovatelná buď jako zvýšená ztráta vody pokožkou nebo snížená schopnost poutat vodu v pokožce. 13 Poškození umožňuje prostup alergenů, dráždivých látek a mikrobů do kůže, kde dochází k aktivaci cytokinů a rozvoji zánětu, který prohlubuje poškození kožní bariéry. Dnes je známo několik odchylek, které mohou přispívat k narušení kožní bariéry. Patří mezi ně zvýšená aktivita serinové proteázy 14, poruchy FLG a snížený obsah lipidů SC, především Cer a změny v jejich složení a uspořádání. 15,16 Zvýšená aktivita serinové proteázy má negativní účinky na některé bariérové funkce SC, protože vede k destrukci některých proteinů, které jsou důležité pro celistvost SC. Ovlivňuje vznik Cer z prekurzorů, protože způsobuje zvýšenou degradaci enzymů glukocerebrosidázy a sfingomyelinázy. Dále podporuje zánět a další pochody zvýšením produkce cytokinu IL-1, stimulací TH 2 lymfocytů a následnou produkcí IL-4, který produkuje IgE. 14,17 U pacientů s AD je ve SC prokazatelně nižší obsah Cer. Z jednotlivých typů je pak nejvíce redukován CerEOS a výrazně ovlivněny jsou i CerNS a CerAP. Studie ukazují, že zvýšení ztráty vody pokožkou (TEWL transepidermal water loss) významně souvisí se snížením CerNP v atopickém SC. 18,19 Snížený obsah Cer je kromě výše zmíněných přisuzován i aktivitě enzymu glukosylceramid-sfingomyelin deacylázy, který byl nalezen u pacientů s AD. Deacyláza hydrolyzuje SM a GCer, které dále nemohou být využity jako prekurzory pro syntézu Cer. 20 12

2.3 Filaggrin (FLG) FLG je důležitý protein, který se mnoha způsoby podílí na udržování homeostázy epidermis. Prekurzorem FLG je profilaggrin (ProFLG). Je to vysoce fosforylovaný inaktivní protein, který se skládá z 10 až 12 jednotek peptidu FLG. ProFLG je skladován v keratohyalinních granulech stratum granulosum (SG). Během terminální diferenciace keratinocytů (na rozhraní SC a SG) je ProFLG defosforylován a proteolyticky štěpen na aktivní jednotky FLG. Takto vzniklý FLG se váže na keratinová vlákna (FLG filamentaggregating protein) a korneocytální obálku. Podílí se tím na vzniku charakteristicky zploštělých korneocytů a jejich vzájemné soudržnosti. V nejnižších vrstvách SC je tak 14, 21 FLG zodpovědný za mechanickou odolnost bariéry SC. Ve vyšších vrstvách SC je FLG postupně rozkládán enzymy na volné aminokyseliny (histidin, glutamin a arginin) a ty jsou následně štěpeny na kyselinu trans-urokanovou (UCA) a kyselinu pyroglutamovou (PCA, Obr. 2). Tyto aminokyseliny, jejich degradační produkty a některé ionty jsou společně označovány jako NMF a jsou podstatné pro zajištění určitého stupně hydratace pokožky, udržují optimální ph pokožky, regulují propustnost kožní bariéry a její schopnost odolávat mikroorganismům, dále se 21, 22 účastní řady biochemických pochodů a jsou důležité pro dozrávání a deskvamaci SC. Vliv ProFLG a FLG schematicky ukazuje Obr. 3. Obr. 2 Degradační produkty FLG. Kyselina trans-urokanová (UCA, vlevo) a kyselina pyroglutamová (PCA, vpravo) 13

Obr. 3 Vliv ProFLG, FLG a aminokyselin na vlastnosti kožní bariéry. 2.3.1 Optimální ph SC Správná hodnota ph má zásadní význam pro kožní bariéru, neporušenost a soudržnost SC. ph reguluje aktivaci imunitní odpovědi a snižuje náchylnost k infekcím. Proto jsou faktory, které ph udržují, klíčové pro zachování homeostázy. 10, 17 Známé jsou tři mechanismy ovlivňující hodnotu ph SC. a. FLG ovliňuje ph SC pomocí svých degradačních produktů, a to především pomocí UCA. b. Snižování hodnoty ph způsobují i MK, které vznikají z fosfolipidů působením sekreční fosfolipázy A 2 (PLA 2 ). c. ph je vyrovnáváno i prostřednictvím membránových přenašečů, které uvolňují vodíkové protony výměnou za sodné ionty (NHE 1 sodium-hydrogen antiporter). 23 Na ph závisí aktivita některých důležitých enzymů. Sfingomyelináza a glukocerebrosidáza vyžadují pro svoji funkci kyselé ph v hodnotě 5,5. Při celkových či lokálních změnách ph jsou tyto enzymy blokovány, což vede k nedostatku Cer ve SC a porušení její bariérové funkce. 10, 23 S rostoucí hodnotou ph SC roste i aktivita serinové 14

proteázy. Její hyperaktivita podporuje zánětlivé procesy kůže a prohlubuje defekt kožní bariéry u pacientů s AD (viz výše). 2.3.2 Role FLG při rozvoji AD Mutace genu pro FLG je nejčastější a nejsilnější genetická predispozice pro rozvoj AD. Porucha tohoto genu byla nejprve popsána jako příčina vzniku jiného kožního onemocnění ichtyosis vulgaris (IV). IV je nezánětlivé dědičné onemocnění kůže projevující se suchou kůží, tvorbou šupin a hyperkeratóz. Až u poloviny pacientů je IV doprovázena rozvojem AD. 21 Společně s dokázáním spojitosti mutace genu pro FLG a rozvojem AD se začalo spekulovat o FLG jako o možné primární příčině poruchy kožní bariéry u atopických pacientů. Je zřejmé, že samotné mutace FLG genu nemohou zapříčinit rozvoj do atopického stavu, když ta samá mutace u jiného jedince vede jen k rozvoji IV. Studie 1, 21 navíc ukazují, že až 50 % pacientů s manifestovanou AD nemá poruchy FLG genu. Nižší hladiny FLG však nemusí být zapříčiněny jen genetickou mutací. Akutní zánět pokožky prostřednictvím cytokinů způsobuje snižování exprese FLG genu. Cytokiny dále ovlivňují i aktivitu enzymů důležitých pro zpracování ProFLG. 24 Situaci v postižené pokožce u jedinců s genetickou mutací zobrazuje Obr. 4. Nedostatek aktivního FLG má významný dopad na SC. Ve spodních vrstvách SC klesá celistvost a pevnost, zvyšuje se propustnost bariéry pro vodu a jiné látky a roste riziko bakteriální infekce. Dochází ke snížení obsahu UCA a PCA a jejich nedostatek se projevuje zhoršením hydratace a pružnosti pokožky. Jelikož představují jeden z mechanismů okyselování SC, dají se předpokládat změny v hodnotách ph a následně pozměněná aktivita enzymů (viz výše). Tento předpoklad však nebyl doposud potvrzen. 15

Obr. 4 Porovnání zdravé pokožky a pokožky u IV a AD. Tmavá barva představuje FLG a jeho prekurzor ProFLG, který způsobuje charakteristický vzhled SG. Zřejmá je absence obou proteinů u defektní pokožky (vpravo). 25 2.4 Metody analýzy lipidů SC Pro analýzu lipidů je v dnešní době zavedeno a uznáváno několik instrumentálních metod. Patří mezi ně tenkovrstvá chromatografie (TLC), vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) a plynová chromatografie (GC) samostatně nebo ve spojení s hmotnostní spektrometrií (MS) či nukleární magnetickou rezonanční spektroskopií (NMR). Jejich základní výhody a nevýhody použití u separace lipidů zobrazuje Tab. 1. Metoda Přednosti Nevýhody TLC/ HPTLC HPLC GC levná, rychlá metoda, umožňuje rozdělení komplexních směsí, jednoduchá vizualizace i kvantifikace výchozí metoda pro podrobnější analýzy vyšší účinnost rozdělování, přesnější kvantifikace propojení s MS rozdělování těkavých látek, zavedená především pro analýzu MK ve formě těkavého nepolárního derivátu, propojení s MS nebezpečí oxidace nenasycených lipidů vzdušným O 2 časově náročná metoda, vysoká spotřeba rozpouštědel, obtížná detekce nasycených lipidů (chybí UV absorpce), reverzní fáze, derivatizace analytu pouze těkavé sloučeniny, nutnost převést na těkavé deriváty 16

MS vysoká citlivost, použití měkkých ionizačních technologií (MALDI, ESI) propojení s LC, GC NMR strukturní analýza a kvantifikace především MK, rozlišení cis/trans izomerů, použití za in vivo podmínek (tzn. bez předchozí extrakce lipidů z biolog. vzorku) nečistoty významně ovlivňují kvalitu spektra vysoká cena zařízení, omezená citlivost, potřeba deuterovaných rozpouštědel Tab. 1 Analytické metody (separační a detekční) využívané při stanovování lipidů SC. 2.4.1 Vysokoúčinná tenkovrstvá chromatografie (HPTLC) TLC a HPTLC jsou nepostradatelným nástrojem moderní analytické chemie. Pro základní analýzu kožních lipidů jsou první volbou. Jedná se o separační metodu, kdy jednotlivé složky jsou rozdělovány na základě různé afinity k stacionární a mobilní fázi. Mezi hlavní přednosti TLC/HPTLC patří jeho jednoduchost a snadné zacházení. Vybavení pro TLC analýzu je finančně dostupné a může být využito v každé laboratoři. Při jedné TLC/HPTLC analýze může být rozdělováno několik vzorků najednou. Nanášení vzorků je dnes zpravidla automatizováno, čímž se zvyšuje přesnost metody. Spotřeba organických rozpouštědel je výrazně nižší než u HPLC, což z této techniky činí levnou a k životnímu prostředí šetrnější metodu. Po separaci lze rozdělené lipidy lehce vizualizovat a identifikovat pomocí reakcí s různými chemickými činidly. Kromě kvalitativní analýzy HPTLC umožňuje i analýzu kvantitativní. Neposlední výhodou je zajisté používání nových stacionárních fází pro každou analýzu, takže nehrozí znečištění či znehodnocení vzorku rezidui z předchozího měření. 26 Nejpodstatnější rozdíl mezi TLC a HPTLC je rozdílná velikost částic stacionární fáze. U TLC jsou používány fáze s velikostí částic v rozmezí 10 50 μm, zatímco u HPTLC jsou částice velké 5 μm s nízkou tolerancí odchylek. Tím je zajištěno přesnější rozdělování směsí a detekovatelné je menší množství vzorku než u TLC. To souvisí i s nutností přesnější manipulace při zacházení se vzorky, při HPTLC analýze je proto nanášení vzorků automatizované. Nejpoužívanější stacionární fází v analýze lipidů je silikagel. 26 Výběr mobilní fáze (MF) závisí zejména na polaritě rozdělovaných látek (ty musí být v MF rozpustné) a na zamýšlené kvalitě rozdělení (dostatečná vzdálenost mezi jednotlivými látkami po separaci). K dosažení optimálních vlastností MF se používají 17

směsi vzájemně mísitelných rozpouštědel v různém poměru. Nejčastěji jsou jako MF pro separaci lipidů (obecně nepolární sloučeniny) používány směsi těchto rozpouštědel: hexan, diethylether, chloroform, aceton, ethylacetát, methanol, kyselina octová (řazeno dle stoupající polarity). Konkrétní příklady MF budou uvedeny níže. 2.4.1.1 Metody detekce Po separaci následuje vizualizace a detekce jednotlivých frakcí. Metody detekce můžeme dělit na specifické a nespecifické nebo na destruktivní a nedestruktivní. a. nedestruktivní, nespecifické všechny skupiny lipidů jsou po reakci s 0,1% vodným roztokem 2,7 -dichlorfluoresceinu viditelné v UV záření jako žluté skvrny. 27 Lipidy lze po detekci vyextrahovat z desky a použít pro další analýzy. b. destruktivní, nespecifické patří sem velmi často používané metody. Deska je po vyvinutí MF rovnoměrně postříkána nebo namočena do reakčního činidla a následně zahřáta na vysokou teplotu. Tím je zajištěna oxidace a zuhelnatění přítomných lipidů, což se projeví ztmavnutím skvrn. Jako reakční činidlo se využívá například 50% H 2 SO 4 ve vodě nebo methanolu 28 nebo roztok 7,5% CuSO 4 v 8% H 3 PO 4 a methanolu. 29 c. destruktivní, specifické řada reakčních činidel reaguje jen s určitou skupinou lipidů za vzniku barevných produktů. Příkladem může být důkaz glykolipidů pomocí orcinolu v koncentrované H 2 SO 4 nebo důkaz fosfolipidů 5-hydroxy-1- tetralonovým činidlem. 30 Fosfolipidy obsahující cholin dávají barevnou reakci s Dragendorffovým činidlem, zatímco sloučeniny s volnou aminoskupinou (MK) reagují s ninhydrinem. 26 2.4.2 Extrakce lipidů z biologického materiálu Před TLC analýzou je potřeba lipidy z dané tkáně (v našem případě SC) vyizolovat. Je to velice podstatný krok analýzy, neboť aby byly výsledky reprodukovatelné, musí být extrakce lipidů kvantitativní. Existuje nespočet extrakčních metod, ať obecných nebo používaných pro konkrétní typy lipidů a biologického materiálu Jednoduchou a dodnes často používanou metodou extrakce lipidů je metoda, kterou popsal v roce 1957 Jordi Folch. Metoda spočívá v homogenizaci tkáně se směsí rozpouštědel chloroform: methanol 2:1 (v/v) za pokojové teploty, k 1 g vzorku se přidává 18

20 ml směsi rozpouštědel. Filtrací nebo centrifugací se poté oddělí kapalná fáze, ke které se přidají 4 ml vody nebo 0,9% roztoku NaCl. Výsledná směs je rozdělena do dvou fází, kdy spodní fáze (chloroform) obsahuje vyextrahované lipidy. 31 Nutno zmínit, že narušení tkáně při homogenizaci může ovlivnit koncentraci extrahovaných lipidů. Obměnou metody je použití dichlormethanu místo chloroformu. Dosaženo je stejných výsledků izolace lipidů a zároveň se snižují zdravotní a bezpečnosní rizika plynoucí z práce s chloroformem. 32 Jiná metoda, která jako rozpouštědla využívá chloroform a methanol, byla navržena v roce 1959. Metoda je označována Bligh-Dyer podle svých autorů. K 1 ml vzorku se přidává 3,75 ml směsi rozpouštědel chloroform: methanol 1:2 (v/v) a protřepává se 10 až 15 minut. Poté se přidá 1 ml chloroformu, protřepe se a na závěr se přidá 1,25 ml vody a opět se dobře protřepe. Centrifugací dojde k oddělení dvou vrstev spodní vrstva obsahující lipidy se odebere pomocí Pasteurovy pipety nebo pomocí jehly. 33 Pro izolaci lipidů ze vzorků tkáně, které byly získány charakterickým způsobem, je potřeba zvolit vhodné extrakční postupy. Příkladem je izolace lipidů SC, které bylo odebráno pacientům pomocí speciálních pásek nebo sklíček s kyanoakrylátovou pryskyřicí. Získané vzorky jsou extrahovány směsí rozpouštědel hexan: ethanol 95:5 (v/v) za využití ultrasonikace. Extrakční činidlo je v tomto případě zvoleno tak, aby nedocházelo k solubilizaci kyanoakrylátové pryskyřice. 18 2.5 Využití HPTLC v praxi V následující části uvedeme konkrétní příklady studií, při kterých bylo TLC/HPTLC využito jako hlavní separační metoda. Jednotlivé postupy se liší použitými MF, jejich kombinacemi a detekčními metodami. Jejich souhrn uvádí Tab. 2. 2.5.1 Bleck, O. et al.; J. Invest. Dermatol. 1999 Cílem studie byla identifikace změn v pokožce atopických pacientů, které by následně mohly být využity v diagnostice AD. Zaměřila se především na celkový obsah a typové složení Cer ve SC. Obměnou separační metody byly zjištěny specifické rozdíly v Cer u atopické pokožky v porovnání s pokožkou zdravou. HPTLC analýza lipidů: Vzorky vyextrahovaných lipidů byly rozpuštěny ve 200 μl směsi rozpouštědel chloroform: methanol 2:1 (v/v) a nanášeny na HPTLC desky se 19

silikagelem. Současně se vzorky byly nanášeny standardy a kontrolní vzorek (lipidy zdravé pokožky). Ve studii byly aplikovány dva postupy, lišící se použitými MF. Postup I deska s nanesenými lipidy byla vyvíjena dvakrát MF ve složení chloroform: methanol: kyselina octová 190:9:1,5 (v/v). Postup II poprvé byla deska vyvíjena MF ve složení chloroform: methanol: kyselina octová 190:9:1 (v/v) a podruhé MF ve složení diethylether: hexan: kyselina octová 80:20:1,5 (v/v). Detekce desky byly na 20 vteřin ponořeny do 10% CuSO 4 a 8% H 3 PO 4 vodného roztoku. Poté byly 20 minut zahřívány na 180 C. Množství lipidů bylo kvantifikováno fotodensitometricky. Výsledky: Složení a obsah Cer u atopické pokožky se výrazně liší v porovnání se zdravou pokožkou, což je v souladu s předchozími výsedky. Oba postupy separace kožních lipidů rozdělily Cer do 7 základních skupin podle jejich polarity (CerEOS je nejméně polární v čele desky, CerAH je nejpolárnější nejblíže startu). Při použití polárnější MF (postup I) bylo zaznamenáno rozdělení skupiny CerAS na dva proužky, a to pouze u vzorků s AD. U kontrolního vzorku v pozici CerAS k rozdělení nedošlo. Přítomnost dvou podskupin CerAS u AD by mohla být využita jako znak onemocnění pro včasnou diagnózu. 34 2.5.2 Uchida, Y. et al.; J. Lipid Res. 2000 Cílem bylo objasnit roli SM jako potenciálních prekurzorů části Cer a jejich důležitost při vzniku kožní bariéry. Porovnávány byly Cer získané hydrolýzou epidermálních SM za účasti enzymu sfingomyelinázy s Cer obsaženými ve SC a s Cer, které se vykytují u Gaucherovy choroby (Cer nemohou být tvořeny z GCer kvůli absenci glukocerebrosidázy). HPTLC analýza lipidů: SM byly od ostatních polárních lipidů rozděleny pomocí MF ve složení chloroform: methanol: kyselina octová: voda 50:30:8:4 (v/v) nebo chloroform: methanol: 28% NH 4 OH 65:35:1 (v/v). GCer a jednotlivé skupiny Cer byly rozdělovány postupně s využitím tří různých MF. Nejprve byly desky vyvíjeny MF ve složení chloroform: methanol: voda 40:10:1 (v/v) do vzdálenosti 2 cm od startu desky, podruhé tou samou MF ale do vzdálenosti 5 cm, dále MF obsahující chloroform: methanol: kyselinu octovou v poměru 94:4:1,5 (v/v) až do konce desky a nakonec MF ve složení hexan: diethylether: kyselina octová 65:35:1 (v/v) také až do konce desky. 20

Detekce lipidy byly vizualizovány nespecifickou destruktivní metodou, po odpaření MF byly rovnoměrně postříkány roztokem Cu(CH 3 COO) 2 a H 3 PO 4 ve vodě a zahřáty na 160 C po dobu 15 minut. Lipidy byly kvantifikovány densitometricky. Výsledky: Identifikovány byly frakce SM SM-1, SM-2, SM-3, lišící se obsaženými MK ve své stuktuře. Žádná frakce však neobsahovala MK s hydroxy skupinou v poloze ω. Cer vzniklé hydrolýzou SM odpovídaly dvěma skupinám Cer z lidského SC CerNS a CerAS. Výsledky naznačují, že pouze dva ze tří epidermálních SM (SM-1, SM-3) jsou prekurzory pro SC Cer. Vznik CerNS a CerAS ze SM potvrzuje i fakt, že tyto dvě skupiny Cer jsou přítomny v pokožce s Gaucherovou chorobou. U této poruchy je značně zvýšený obsah GCer a acylgcer ve SC a významně snížený obsah Cer, s výjimkou právě CerNS a CerAS, v důsledku nedostatku glukocerebrosidázy. 35 2.5.3 Hamanaka, S. et al.; J. Invest. Dermatol. 2002 Ve studii se zabývali strukturou GCer ve zdravé lidské pokožce s cílem objasnit jejich roli při vzniku jednotlivých skupin Cer. Během studie byly pomocí GC-MS stanovany druhy GCer přítomné v lidské pokožce. Tyto GCer a acylgcer (popsány dříve) byly následně štěpeny glukocerebrosidázou na Cer, které byly porovnány s Cer vyextrahovanými z lidského SC s využitím TLC. HPTLC analýza lipidů: GCer byly rozdělovány pomocí MF ve složení chloroform: methanol: voda 40:12:1 (v/v). Pro Cer byl zvolen systém několika MF. V prvním kroku byly HPTLC desky vyvíjeny chloroformem do vzdálenosti 1,5 cm od startu, druhou MF ve složení chloroform: methanol: aceton 76:16:8 (v/v/v) do 1 cm, dále MF ve složení chloroform: methanol: hexylacetát: aceton 86:4:1:10 (v/v/v) do 7 cm od startu, v dalším kroku MF skládající se z chloroformu: methanolu: acetonu 76:20:4 (v/v/v) do 2 cm, následně MF obsahující chloroform: methanol: diethylether: ethylacetát: hexylacetát: aceton 72:4:4:1:4:16 (v/v/v) do 7,5 cm a nakonec MF hexan: diethylether: kyselina octová 65:35:1 (v/v/v) do konce desky. Detekce po uschnutí se desky s GCer postříkaly detekčním činidlem orcinolu a následně se 15 minut zahřívaly na 110 C. Jedná se o specifickou reakci, GCer se na desce zviditelní jako fialové skvrny na bílém pozadí. Skupiny Cer byly vizualizovány postříkáním roztokem Cu(CH 3 COO) 2 a H 3 PO 4 ve vodě a zahřátím na 160 C po dobu 15 minut. Výsledky: Identifikováno bylo 6 skupin GCer vznikajících kombinací sfingoidní baze s amidově vázanou MK. GCer s MK obsahující hydroxylovou skupinu v poloze ω 21

nebyly detekovány. Porovnáním Cer vzniklých hydrolýzou GCer a acylgcer s Cer izolovanými z lidského SC bylo potvrzeno, že GCer jsou přímými prekurzory pro tvorbu Cer 1 7. 11 2.5.4 Breiden, B. et al.; Eur. J. Cell Biol. 2007 Pro účely této studie byly připraveny buněčné kultury, na kterých byly pozorovány metabolické procesy během diferenciace keratinocytů a vznik lipidů specifických pro kožní bariéru. Byl sledován vliv různých faktorů (Ca 2+, přídavek kyseliny linolové, ph, ) na metabolismus kožních lipidů a morfologii keratinocytů. TLC analýza lipidů: Pro separaci polárních lipidů (GCer, SM) byla použita MF ve složení chloroform: methanol: voda 70:30:5 (v/v). Pro rozdělení Cer byla TLC deska vyvíjena dvakrát MF ve složení chloroform: methanol: kyselina octová 190:90:1 (v/v/v). Detekce desky byly rovnoměrně postříkány vodným roztokem 8% H 3 PO 4 (w/v) a 10% CuSO 4 (w/v) a poté zahřívány 10 minut na 180 C. Lipidy byly kvantifikovány densitometricky při vlnové délce 595 nm. Výsledky: Kyselina linolová se jako aktivátor transkripčního faktoru PPAR α podílí na regulaci syntézy lipidů a je podstatná pro vznik funkční kožní bariéry. Dále stimuluje keratinocyty k jejich diferenciaci. Je stavební složkou pro vznik CerEOS, CerEOH a CerEOP, prodlužuje hydrofobní řetězec těchto Cer a její odštěpení pak umožňuje esterovou vazbu koncového hydroxylu těchto Cer s glutamovou kyselinou korneocytální obálky. Dále byla potvrzena důležitost kyselého ph pro správnou funkci enzymů. 36 2.5.5 Pappinen, S. et al.;biochim. Biophys. Acta 2008 Cílem bylo studium vlastností epidermálního modelu z kultivovaných potkaních keratinocytů (ROC), které by mohly být využívány namísto lidské kůže při in vitro experimentech. Podmínkou použití takových modelů je morfologická a fyziolgická ekvivalence s lidskou kůží. ROC mají dobře vyvinutou kožní bariéru, obsahují lamelární tělíska a také obsahují korneocytální obálku, jak bylo prokázáno dříve. Nicméně ROC je o něco propustnější než lidská pokožka, proto bylo porovnáváno složení kožních lipidů ROC a lidského SC. TLC analýza lipidů: Lipidy byly rozdělovány postupně pomocí následujících MF. První MF ve složení chloroform: methanol: voda 40:10:1 (v/v) byly desky vyvíjeny do 22

10 cm, druhou MF ve složení chloroform: methanol: kyselina octová 190:9:1 (v/v) byly vyvíjeny do 16 cm, nakonec byly vyvíjeny třetí MF, kterou tvořily hexan: diethylether: kyselina octová 70:30:1 (v/v/v), a to po celé délce desky. Detekce desky s rozdělenými lipidy byly namočeny v detekčním činidle 7,5% CuSO 4 (w/v), 8% H 3 PO 4 (v/v) vodném roztoku. Poté byly zahřívány na 180 C po dobu 8 minut. Vychladlé desky byly naskenovány a jejich množství bylo stanoveno densitometricky na základě známého množství standardů. Výsledky: V ROC modelech byly nalezeny všechny hlavní skupiny lipidů charakteristické pro lidské SC. Jejich celkové množství je srovnatelné s obsahem lipidů v lidském SC, nicméně poměr jednotlivých skupin Cer v modelech se značně lišil v porovnání s lidským SC. CerEOP, NP a AP nebyly v modelech detekovány vůbec a CerNS byl naopak v nadbytku. Obsah Cer, které se váží na proteinovou vrstvu korneocytů, byl výrazně nižší v ROC. 37 23

MF - rozpouštědla Poměr rozpouštědel Postup 1 CHCl 3 : CH 3 OH: CH 3 COOH 190:9:1,5 Postup 2 1. CHCl 3 : CH 3 OH: CH 3 COOH 190:9:1 2. (CH 3 CH 2 ) 2 O: CH 3 (CH 2 ) 4 CH 3 : CH 3 COOH 80:20:1,5 Postup 3 SM: CHCl 3 : CH 3 OH: CH 3 COOH: H 2 O nebo 50:30:8:4 CHCl 3 : CH 3 OH: NH 4 OH 65:35:1 Cer: 1. CHCl 3 : CH 3 OH: H 2 O (2x) 40:10:1 2. CHCl 3 : CH 3 OH: CH 3 COOH 94:4:1,5 3. CH 3 (CH 2 ) 4 CH 3 : (CH 3 CH 2 ) 2 O: CH 3 COOH 65:35:1 Postup 4 GCer: CHCl 3 : CH 3 OH: H 2 O 40:12:1 Detekce 10% CuSO 4 a 8% H 3 PO 4 180 C, 20 min Cu(CH 3 COO) 2 a H 3 PO 4 160 C, 15 min Cer: 1. CHCl 3 2. CHCl 3 : CH 3 OH: CH 3 COCH 3 3. CHCl 3 : CH 3 OH: CH 3 COO(CH 2 ) 5 CH 3 : CH 3 COCH 3 4. CHCl 3 : CH 3 OH: CH 3 COCH 3 5. CHCl 3 : CH 3 OH: (CH 3 CH 2 ) 2 O: CH 3 COOCH 2 CH 3 : CH 3 COO(CH 2 ) 5 CH 3 : 76:16:8 86:4:1:10 76:20:4 GCer: orcinol 110 C, 15min Cer: Cu(CH 3 COO) 2 a H 3 PO 4 160 C, 15 min CH 3 COCH 3 72:4:4:1:4:16 6. CH 3 (CH 2 ) 4 CH 3 : (CH 3 CH 2 ) 2 O: CH 3 COOH 65:35:1 Postup 5 GCer/SM: CHCl 3 : CH 3 OH: H 2 O 70:30:5 8% H 3 PO 4 a 10% CuSO 4 Cer: CHCl 3 : CH 3 OH: CH 3 COOH (2x) 190:90:1 180 C, 10 min Postup 6 1. CHCl 3 : CH 3 OH: H 2 O 2. CHCl 3 : CH 3 OH: CH 3 COOH 3. CH 3 (CH 2 ) 4 CH 3 : (CH 3 CH 2 ) 2 O: CH 3 COOH 40:10:1 190:90:1 70:30:1 7,5% CuSO 4 a 8% H 3 PO 4 180 C, 8 min Tab. 2 Přehled používaných MF a metod detekce. Modře jsou vyznačeny MF pro separaci všech základních skupin lipidů SC, červeně MF pro prekurzory, zeleně MF pro Cer. 24

3 Experimentální část 3.1 Materiál Látky použité jako standardy: CerNS (N-lignoceroylsfingosin), CerAS (N-2-hydroxylignoceroylsfingosin), GCer (cerebrosid izolovaný z prasečího mozku), SM (z prasečího mozku, převážně oktadekanoyl derivát) a sfingosinfosforylcholin (SPC) byly zakoupeny od Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL, USA). CerNP (N-tetracosanoylfytosfingosin) byl připraven acylací fytosfingosinu lignocerovou kyselinou. 38,39 Chol, kyselina palmitová, L-α-fosfatidylcholin (PL, ze sójových bobů), rozpouštědla (CH 3 OH, CHCl 3 ) HPLC kvality a další chemikálie byly zakoupeny od Sigma-Aldrich (Schnelldorf, Německo). Ultračistá voda byla připravena pomocí filtračního systému Milli-Q (Millipore, Bedford, MA, USA). 3.2 Modely lidské kůže a izolace stratum corneum (SC) Modely lidské kůže byly připraveny v Německu na Svobodné univerzitě Berlín (Institute for Pharmacy Pharmacology and Toxicology, Freie Universität Berlin). Metoda přípravy modelů byla popsána v literatuře. 40,41 K analýze jsme používali modely s normální (FLG+) a se sníženou (FLG-) expresí FLG. U obou typů modelů byla jejich kultivace ukončena buď po 7 nebo 14 dnech. SC bylo izolováno z těchto modelů trypsinem, viz níže. Kontrolou bylo lidské SC izolované z kůže, kterou jsme získali od pacientek, které podstoupily abdominoplastiku na Klinice plastické chirurgie Fakultní nemocnice Hradec Králové. Použití lidské kůže bylo schváleno souhlasem Etické komise Fakultní nemocnice Hradec Králové (No. 200609 S09P). Kůže byla zbavena podkožního tuku a skladována při -20 C. Výřez lidské kůže jsme ponořili na 45 sekund do vody o teplotě 60 C a poté pinzetou oddělili její vrchní vrstvu epidermis. Epidermis jsme položili na hladinu fosfátového pufru s trypsinem a nechali 24 hod. při 32 C. Trypsinem degradované buňky nižších vrstev kůže jsme šetrně odstranili, až nám zůstala jen průhledná vrstva SC. Tu jsme opláchli hexanem k odstranění povrchových lipidů a rozprostřenou na Petriho misce vysušili ve vakuovém exsikátoru. 25

3.3 Izolace lipidů Vzorky SC (modely i lidské SC) jsme extrahovali směsí rozpouštědel CHCl 3 : CH 3 OH v poměru 2:1 (v/v). K 1 mg SC jsme přidávali 1 ml směsi rozpouštědel a třepali jsme 1,5 hodiny za pokojové teploty. Roztoky lipidů jsme poté odebrali a přefiltrovali do čistých vialek přes minifiltry Miller-FH s póry o velikosti 0,45 μm, Fluoropore TM (PTFE), o průměru 13 mm. Zbytek SC jsme ještě třikrát promyli menším množstvím směsi rozpouštědel a stejným způsobem převedli do vialek. Tak jsme zajistili kvantitativní přenos rozpuštěných lipidů. Rozpouštědla jsme poté odstranili proudem dusíku a lipidy vysušili ve vakuovém exsikátoru nad parafinem a P 2 O 5. Vzorky extrahovaných lipidů jsme uchovávali při -20 C. 3.4 Příprava kalibrací Standardy jsme připravili rozpuštěním CerNS, AS, NP, Chol a palmitové kyseliny ve směsi CHCl 3 : CH 3 OH 2:1 (v/v), CholS, GCer, SM a PL v CHCl 3 : CH 3 OH 1:1 (v/v) a SPC v CH 3 OH, a to tak, že jsme získali koncentraci 1mg/ml. Z těchto roztoků jsme poté připravili směs tím, že jsme vzali 50 μl od každého roztoku standardu a doplnili směsí CHCl 3 : CH 3 OH 2:1 na celkové množství 1 ml. Koncentrace jednotlivých látek byla tudíž 50 μg/ml. Směs standardů jsme nanášeli na desky v množství 150, 100, 60, 40, 20, 10 a 5 μl a tím jsme vytvořili ke každé analýze kalibrační křivku v rozmezí 50 ng až 7,5 μg. 3.5 Vysokoúčinná tenkovrstvá chromatografie (HPTLC) kožních lipidů Analýzy probíhaly na skleněných HPTLC deskách se silikagelem 60 o rozměrech 20 x 10 cm (Merck, Darmstadt, Německo). Abychom odstranili případnou kontaminaci desky lipofilními složkami, které by mohly zkreslit výsledky pokusu, nechali jsme nejprve každou používanou desku vyvinout až po okraj směsí rozpouštědel CHCl 3 : CH 3 OH 2:1 (v/v). Zahřátím na 110 120 C po dobu 30 min. došlo k odpaření rozpouštědel z desky a k její aktivaci. Před analýzou jsme vyextrahované lipidy rozpustili ve 100 μl směsi rozpouštědel CHCl 3 : CH 3 OH 2:1. Takto vzniklé roztoky lipidů byly v přesně známém množství rovnoměrně nanášeny na desky pomocí Linomatu IV (Camag, Muttenz, Švýcarsko). Parametry, jako počet vzorků, šířka pásu, vzdálenost od startu, jsou nastavitelné a díky 26

automatizaci a přesnému ohraničení lze na jedné desce analyzovat velké množství vzorků. Na desky jsme nanesli buď 10 μl nebo 20 μl roztoku. Jeden naředěný vzorek jsme v průměru využili na 6 analýz. Společně s roztoky vzorků byly na desky nanášeny roztoky kalibračních standardů. HPTLC desky s nanesenými vzorky a standardy jsme nechali vyvíjet v horizontální vyvíjecí komoře (Camag). Abychom dosáhli viditelného a snadno detekovatelného rozdělení všech složek, tak jsme si při každé analýze jedné skupiny vzorků připravili dvě desky, pro které jsme použili rozdílné mobilní fáze (MF). Pro rozdělení hlavních bariérových lipidů (Cer, Chol, MK) jsme používali MF ve složení CHCl 3 : CH 3 OH: CH 3 COOH 190:9:1,5. Desku jsme nechali vyvinout dvakrát, vždy po celé její délce. Před druhým vývojem bylo potřeba z desky zcela odpařit MF. 34 K separaci prekurzorů Cer (GCer, SM), jejich degradačních produktů (SPC), PL a cholesterol sulfátu (CholS) jsme používali polárnější mobilní fázi ve složení CHCl 3 : CH 3 OH: CH 3 COOH: H 2 O, 66:25:6:3. 3.6 Identifikace lipidů při HPTLC analýze Pořadí kožních lipidů při chromatografii je z literatury dobře známo 42 a dá se odvodit i z jejich struktury (např. CerAS s hydroxylem navíc v poloze 2 acylu má vyšší retenci než CerNS). Retence každého lipidu byla ověřena pomocí standardů, případně dalšími důkazy, viz níže. 3.6.1 Důkaz lipidů obsahujících esterovou vazdu (CerEOS, CerEOH a PL) bazickou hydrolýzou Pro důkaz Cer typu EO s esterově vázanou kyselinou linolovou CerEOS a CerEOH (CerEOP a CerEOdS jsme nedetekovali) a PL na desce jsme vzorek lipidů podrobili alkalické hydrolýze. Ke vzorku jsme přidali 10M NaOH v CH 3 OH (1:9), na 1 mg vyextrahovaných lipidů jsme přidávali přibližně 3 ml roztoku. Směs jsme zahřívali na 60 C po dobu 1 hodiny. Po vychladnutí jsme směs neutralizovali 2M HCl na ph 4. Z vodného roztoku jsme lipidy získali vytřepáním s 0,5 ml CHCl 3. Lipofilní vrstvu jsme jehlou odebrali a převedli do čisté vialky. Extrakci CHCl 3 jsme zopakovali ještě dvakrát. Pokud se vrstvy rozdělovaly příliš pomalu, přidali jsme cca 0,5 ml nasyceného roztoku NaCl, čímž se rozdělování urychlilo. Rozpouštědlo ze spojených CHCl 3 vrstev jsme 27

odstranili proudem dusíku a vzorek lipidů dosušili ve vakuovém exsikátoru. Před HPTLC analýzou jsme vzorek rozpustili v přesně známém množství rozpouštědel a nanesli na HPTLC desku spolu s lipidy, které nebyly hydrolyzovány (viz výše). Lipidy obsahující esterovou vazbu (CerEOS, CerEOH a PL) zmizely po hydrolýze z chromatogramu. 3.6.2 Důkaz lipidů specifickými činidly Pro důkaz a vizualizaci lipidů literatura uvádí řadu specifických reakcí. Pro naše účely jsme vyzkoušeli některé z nich. Důkaz PL a GC Desku s vyvinutými lipidy jsme po vysušení rovnoměrně postříkali 5-hydroxy-1- tetralonovým (HT) detekčním činidlem, což je 0,1% HT v 80% H 2 SO 4. Postříkanou desku jsme zahřívali na 120 C po dobu 10 minut. Pod UV zářením při 365 nm pak fosfolipidy obecně fluoreskují světle modře. Žlutě se pod UV zářením jeví glykosfingolipidy. 30 Fluorescenci se nám podařilo zaznamenat pouze částečně u glykosfingolipidů. Množství fosfolipidů ve vzorcích bylo patrně menší, než je detekční limit zkoušeného činidla identitu PL jsme poté potvrdili jejich bazickou hydrolýzou (viz výše). Důkaz sfingolipidů (GCer, SM) K této detekci je využívána kombinace dvou činidel. První z nich se připravuje těsně před detekcí (až po TLC separaci) a skládá se z 50 ml benzenu, 5 ml přibližně 6% NaClO a 5 ml CH 3 COOH. Po smíchání je vzniklým činidlem okamžitě postříkána TLC deska. Ta se nechá 30 minut při pokojové teplotě a poté je vysušena při 80 C (cca 10 minut). Druhým činidlem je roztok benzidinu. 200 mg dihydrátu benzidinu a 80 mg KI je rozpuštěno ve 20 ml 50% CH 3 CH 2 OH. Po postříkání tímto činidlem jsou okamžité viditelné modré skvrny sfingolipidů. 43 Pro naše účely jsme benzen nahradili toluenem a jako roztok NaClO jsme použili desinfekční prostředek Savo. Savo jsme nejprve naředili podle postupu výše, skvrny jsme však nezaznamenali. V druhém pokusu jsme zvýšili koncentraci Sava, ale po postříkání desky druhým činidlem došlo ke znehodnocení celé desky, modré skvrny sfingolipidů proto nebylo možné jasně identifikovat. 28

Důkaz glykolipidů Zkoušeným detekčním činidlem byl orcinol. Detekční činidlo jsme připravili rozpuštěním 200 mg orcinolu ve 100 ml 70% H 2 SO 4. Desku jsme rovnoměrně postříkali a 15 minut zahřívali na 100 C. Glykolipidy by se měly objevit jako fialové skvrny na bílém pozadí. Pokus jsme opakovali s upraveným detekčním činidlem, které se skládalo z 0,55 g orcinolu, 0,9 g FeCl 3, 80 ml CH 3 CH 2 OH a 20 ml HCl. Postříkanou desku jsme poté zahřívali na 80 C po dobu 90 minut. 43 Ani v jednom případě jsme fialové skvrny glykolipidů nezaznamenali. Množství lipidů ve vzorcích bylo patrně menší, než je detekční limit zkoušeného činidla. Až když jsme zvýšili množství naneseného vzorku, identita GCer se podařila potvrdit. Nespecifické detekce lipidů Detekce 2,7 -dichlorfluoresceinem Výhodou této detekce je její nedestruktivní charakter, proto jsme ji plánovali použít pro detailnější analýzu. Pokud bychom našli statistické změny v obsahu některých Cer, plánovali jsme tyto skvrny po vizualizaci 2,7 -dichlorfluoresceinem vyextrahovat z HPTLC desky a analyzovat pomocí hmotnostní spektrometrie. Po odpaření MF jsme desku postříkali detečním činidlem 0,1% vodným roztokem 2,7 -dichlorfluoresceinu. Všechny skupiny lipidů jsou pod UV zářením viditelné jako žluté skvrny. 27 Detekce pomocí CuSO 4 /H 3 PO 4. Detekci a vizualizaci jsme prováděli pomocí detekčního činidla roztok 7,5% CuSO 4, 8% H 3 PO 4, 10% CH 3 OH ve vodě. Suché desky jsme ponořili rovnoměrně do detekční směsi na 10 sekund a poté zahřáli na 160 C po dobu 20 až 30 minut. Reakcí s činidlem a následným zahřátím došlo k oxidaci a ztmavnutí skvrn lipidů. Jedná se o destruktivní formu vizualizace, lipidy již nelze využít pro další pokusy. Tuto metodu jsme vzhledem k její vysoké citlivosti využili pro kvantifikaci lipidů. 29

Obr. 5 Ukázky výřezů HPTLC desek. Bariérové lipidy (a) a polární lipidy (b) s jejich charakteristickým umístěním na desce. V první dráze standardy, v druhé lipidy SC s FLG, v poslední lipidy SC bez FLG. Vizualizace pomocí detekčního činidla CuSO 4 /H 3 PO 4. 3.7 Kvantifikace kožních lipidů a zpracování dat Vyhodnocení a kvantifikaci jsme provedli densitometricky pomocí TLC scanneru 3 a počítačového programu WinCats (Camag). Skenování desky, na které byly lipidy vizualizovány posledním zmíněným činidlem, probíhalo při vlnové délce 350 nm po celé její délce ve směru vývoje MF. Výstupem je chromatogram zobrazující absorpci vzorků rozdělených na desce v závislosti na retenčním faktoru (Rf). Rf je vzdálenost látky od startu TLC dělená délkou chromatogramu. Píky v grafech odpovídají jednotlivým proužkům rozdělovaných látek a velikost plochy pod píkem je úměrná koncentraci. Program nám umožnil odečíst přesnou hodnotu plochy pod píkem, se kterou jsme dále počítali. Pro každou analýzu jsme sestrojovali kalibrační křivky, díky nimž jsme zjistili, jaká závislost je mezi plochami pod křivkou a koncentracemi analyzovaných standardů. Z kalibrací jsme pak odečetli hodnotu koncentrace, která odpovídá zjištěné velikosti plochy pod píkem. Při výpočtu je důležité zahrnout ředění, které vychází z množství lipidů nanášeného na desku (např. bylo-li analyzováno 10 µl z celkového 30

množství 100 µl roztoku, bylo nutné získané množství lipidů vynásobit 10). Zjištěné množství lipidů jsme nakonec přepočítali na přesně známou hmotnost SC. Výsledky jsme pro jednotlivé třídy lipidů uváděli v μg na 1 mg SC, zastoupení jednotlivých Cer uvádíme dále v % z celkového množství Cer. Celkem bylo analyzováno a vyhodnocováno 40 vzorků z 5 šarží, z toho bylo 16 FLG- a 16 FLG+ kultivovaných po dobu 14 dní a 4 FLG- a 4 FLG+ kultivovaných 7 dní. Každý vzorek jsme využili ke 2 až 3 analýzám, a to vždy zvlášť pro bariérové lipidy a zvlášť pro prekursory Cer. Data ze všech měření jsme zpracovali do grafů, kde jsou zobrazena jako průměr všech zjištěných hodnot se standardní chybou (SEM). K hodnocení statistické významnosti rozdílů mezi skupinami FLG+, FLG- a kontrolním vzorkem byla použita metoda analýzy rozptylu (ANOVA). 31

4 Výsledky a diskuse Předmětem naší práce bylo zjistit rozdíly v celkovém obsahu kožních lipidů v modelech kůže s normální a sníženou expresí FLG. Jako kontrola sloužila zdravá lidská kůže. Dále jsme se zaměřili na zastoupení jednotlivých typů Cer v jejich celkové frakci. 4.1 HPTLC stanovení lipidů Nejprve bylo nutné vyvinout metodiku pro stanovení kožních lipidů. Vzhledem k vysoké lipofilitě látek vyžadující separaci na silikagelu pomocí organických mobilních fází, absenci chromoforu v analyzovaných látkách a s přihlédnutím k našim instrumentálním možnostem jsme zvolili HPTLC analýzu. Tato metodika je v literatuře hojně využívána a většina současných poznatků o bariérových lipidech v kůži pochází právě z HPTLC analýz. Díky tomu je také dobře popsána retence jednotlivých typů lipidů na silikagelu. Pro naše potřeby jsme využili analýzu ve dvou systémech, protože nebylo možné rozdělit všechny typy lipidů na jedné HPTLC desce. První část vzorku byla analyzována pomocí mobilní fáze CHCl 3 : CH 3 OH: CH 3 COOH 190:9:1,5, což nám umožnilo separaci Cer, MK a Chol (zbytek lipidů zůstal na startu) Obr. 7, a druhá část pak v polárnější mobilní fázi CHCl 3 : CH 3 OH: CH 3 COOH: H 2 O 66:25:6:3, kdy jsme dosáhli dobré separace GCer, CholS, PL, SM a SPC (a zbylé lipidy byly v čele chromatogramu, Obr. 6) Obr. 8. Lipidy jsme identifikovali pomocí standardů, specifických důkazů, lipidů z lidského SC a údajů v literatuře. 42 Obr. 6 Ukázka chromatogramu. Odezva detektoru při 350 nm v závislosti na retenčním faktoru (Rf). 32

Obr. 7 Ukázka HPTLC desky s rozdělenými Cer, MK, Chol. K značí kalibrace (směs standardních látek). Použitá MF - CHCl 3 : CH 3 OH: CH 3 COOH 190:9:1,5, detekce pomocí CuSO 4 /H 3 PO 4. Obr. 8 Ukázka HPTLC desky s rozdělenými GCer, CholS, PL, SM a SPC. K značí kalibrace. Použitá MF - CHCl 3 : CH 3 OH: CH 3 COOH: H 2 O 66:25:6:3, detekce pomocí CuSO 4 /H 3 PO 4. 33

4.1.1 Kalibrace a kvantifikace Důležitým krokem pro kvantifikaci jednotlivých lipidů bylo sestrojení kalibračních křivek. Jelikož kalibrační křivky pro HPTLC nejsou lineární, nýbrž polynomické, bylo při jejich sestrojování podstatné správně vybrat rozsah kalibrace. HPTLC analýzou jsme pro každý standard získali vždy 7 hodnot. Vynesením do grafu a použitím polynomické spojnice trendu jsme sestrojili kalibrační křivku v rozmezí 50 ng až 7,5 μg, které bylo pro kvantifikaci optimální. Látky použité jako standardy a ukázky jejich kalibračních křivek zobrazuje Obr. 9. Pro všechny typy ceramidů nebyly dostupné standardy. Pro naše účely jsme v takovém případě použili standard strukturně podobný. Proto je stanovení některých typů Cer semikvantitativní. Například CerAS a NH mají stejný sumární vzorec a liší se pouze polohou hydroxylové skupiny. Jelikož jsme nenalezli žádné významné rozdíly mezi obsahem Cer ve FLG+ a FLG- kožních modelech, nebyl důvod pro podrobnější analýzu. Obdobně pro CerAP a NH jsme využívali kalibrace pro CerNP a NS. Pro CerNS2, který je přítomen pouze v umělých modelech, byl jako standard pro kvantifikaci použit CerNS. CerEOS byl kvantifikován také podle CerNS. 34

Obr. 9 Ukázka kalibračních křivek pro jednotlivé lipidy. Křivky jsou polynomické, R hodnota spolehlivosti (nejpřesnější pokud rovna nebo se blíží hodnotě 1), AUC plocha pod křivkou. 4.2 Celkový obsah kožních lipidů Pro analýzu jsme používali modely SC kultivované po dobu 7 a 14 dní. V sedmidenních modelech jsme nezjistili žádné rozdíly mezi FLG+ a FLG- modely. Pokusy s nimi jsme ukončili po druhé šarži modelů. Výsledky čtrnáctidenních modelů zobrazuje Tab. 3 a Obr. 10. Obsah bariérových lipidů (Cer, Chol, MK) v obou typech modelů (FLG+, FLG-) je podstatně nižší než v lidském SC. V modelech jsme naopak zaznamenali významné množství prekurzorů Cer (GCer, SM) a PL v porovnání s kontrolním vzorkem, kde je obsah polárních lipidů nulový nebo minimální. Je to způsobeno tím, že ve zdravé lidské kůži dochází ke kompletní metabolizaci prekurzorů na Cer. V modelech tato transformace není nikdy úplná, proto zde nacházíme prekurzory. 35

Celkové množství Cer je podobné v obou typech modelů, modely se neliší ani v obsahu Chol. Jediným statisticky významným rozdílem mezi FLG+ a FLG- modely je téměř dvojnásobné množství MK v modelech se sníženou expresí FLG. Obsah lipidů [μg/mg] Lipid FLG+ FLG- lidské SC MK 11,3 ± 2,1 21,9 ± 3,6 28,0 ± 2,9 Chol 12,5 ± 1,5 12,2 ± 0,8 29,6 ± 3,5 Cer 21,1 ± 3,7 14,2 ± 1,6 40,9 ± 2,6 CholS 1,3 ± 0,5 0,9 ± 0,5 2,9 ± 0,5 SM 10,7 ± 1,8 8,7 ± 1,2 0,1 ± 0,1 Gcer 13,0 ± 2,6 15,8 ± 3,2 0,1 ± 0,0 PL 28,1 ± 6,3 22,3 ± 5,8 0,3 ± 0,2 Tab. 3 Množství lipidů ve FLG+ a FLG- modelech SC a v lidském SC. Uváděné hodnoty představují průměr zjištěných hodnot ze všech analýz se standardní chybou. Obr. 10 Celkový obsah lipidů v modelech SC v porovnání s obsahem lipidů v lidském SC. * značí statisticky významné rozdíly mezi modely SC a kontrolním vzorkem s pravděpodobností 0,05. + značí statisticky významný rozdíl mezi FLG+ a FLGmodely s pravděpodobností 0,05. Úsečky nad jednotlivými sloupci udávají standardní chybu. 4.3 Profily Cer Jelikož jsme nezaznamenali podstatné rozdíly v celkovém množství Cer mezi in vitro modely, zaměřili jsme se na jednotlivé typy Cer. Hlavními typy Cer v modelech jsou CerNS a NP, což jsou výsledky shodné s lidským SC. Analýzou jsme zjistili přítomnost kratšího analogu CerNS, označovaného jako CerNS2. Na deskách je viditelný pod CerNS, 36