Kód K0674: Dodány jsou následující materiály, v množství dostatečném pro 1100 tkáňových řezů, za předpokladu použití 100 µl na řez:

Dako LSAB 2 System-AP Kód K0674 110 ml Kód K0676 15 ml Použití In vitro diagnostikum. Tyto pokyny se týkají systému Universal Dako LSAB 2 System, Alkaline Phosphatase (LSAB2 System, AP), který se používá s králičími a myšími protilátkami dodanými uživatelem. Tento systém je tvořen činidlem obsahujícím streptavidinem značený biotin (LSAB) a je určen pro kvalitativní průkaz antigenů ve tkáních zalitých do parafínu, kryostatových řezech a buněčných preparátech. Tento systém je užitečný u vzorků, které mají vysokou aktivitu endogenní peroxidázy. Použity mohou být tkáně zpracované celou řadou fixačních činidel včetně ethanolu, činidla B-5, Bouinovy tekutiny a neutrálně pufrovaného formalínu. Odkaz na Všeobecné instrukce pro imunohistochemické barvení a/nebo Instrukce detekčního systému IHC metod týkající se: (1) Principu metody, (2) Materiálů požadovaných, ale nedodaných, (3) Uchovávání, (4) Přípravy vzorku, (5) Postupu barvení, (6) Kontroly kvality, (7) Řešení problémů, (8) Interpretace barvení, (9) Všeobecných omezení. Souhrn a vysvětlení Účelem imunohistochemických (IHC) technik barvení je umožnit vizualizaci tkáńových (buněčných) antigenů. Systémy LSAB2 používají vylepšenou techniku avidinu-biotinu, při které biotinylovaná sekundární protilátka reaguje s několika molekulami streptavidinu konjugovanými s alkalickou fosfatázou. 1 Systém LSAB2, AP nabízí všestranný barvící postup, který umožňuje současné zpracování mnoha vzorků v čase kratším než jedna hodina. Primární protilátky králičího nebo myšího původu reagují s biotinylovanou protilátkou, kterou tyto systémy poskytují. Celková inkubační doba přibližně 40 minut umožňuje zpracování velkého množství vzorků. Fuchsinový chromogenní substrát je dodáván s 15mL činidla LSAB2 System, AP (kód K0676) a tvoří na místě antigenu částečně rozpustné precipitáty fuchsinové barvy. Chromogenní substrát Fuchsin Substrate-Chromogen System (kód K0624, 110 ml) je dostupný jako doplňkový produkt, který je doporučen pro použití se 110 ml činidla LSAB2 System, AP (kód K0674). Principy postupu Poskytnuté materiály Technika, kterou tento systém využívá, je založena na metodě LSAB. 2 Vzorek je nejprve inkubován po dobu 10 minut s vhodně zvolenou a zředěnou králičí nebo myší primární protilátkou (dodanou uživatelem). Následují postupné 10 minutové inkubace s poskytnutou biotinylovanou protilátkou a alkalickou fosfatázou značeným streptavidinem. Barvení je dokončeno po 10 minutové inkubaci s roztokem chromogenního substrátu. Kód K0674: Dodány jsou následující materiály, v množství dostatečném pro 1100 tkáňových řezů, za předpokladu použití 100 µl na řez: Množství 1x110 ml Popis Značená protilátka Biotinylované protilátky proti králičím a proti myším imunoglobulinům ve fosfátem pufrovaném fyziologickém roztoku (PBS) obsahujícím stabilizační protein a 0,015 mol/l azidu sodného. 1x110 ml Streptavidin alkalická fosfatáza Streptavidin konjugovaný s alkalickou fosfatázou ve fosfátem pufrovaném fyziologickém roztoku (PBS) obsahujícím stabilizační protein a 0,015 mol/l azidu sodného. Doporučené kompatibilní substrátové systémy: Jméno Kód Velikost dostupných testů Barva FUCHSIN K0624 300 testů & 1100 testů Fuchsiová FAST RED K0597 300 testů & 1100 testů Červená BCIP/NBT K0598 150 testů Modrá/purpurová BCIP/NBT/INT K0599 150 testů Hnědá (110183-002) 301569CZ_001 str. 1/6

Kód K0676: Dodány jsou následující materiály, v množství dostatečném pro 150 tkáňových řezů, za předpokladu použití 100 µl na řez: Množství 1x15 ml Popis Značená protilátka Biotinylované protilátky proti králičím a proti myším imunoglobulinům ve fosfátem pufrovaném fyziologickém roztoku (PBS) obsahujícím stabilizační protein. 1x15 ml Streptavidin alkalická fosfatáza Streptavidin konjugovaný s alkalickou fosfatázou ve fosfátem pufrovaném fyziologickém roztoku (PBS) obsahujícím stabilizační protein a 0,015 mol/l azidu sodného. 1x2 ml Fuchsin chromogen V HCl. 1x2 ml Činidlo aktivující fuchsin Ve vodném roztoku. 1x15 ml Substrátový pufr fuchsinu Naftol fosfát v Tris pufru. Příslušenství 1 Kalibrovaná zkumavka Materiály vyžadovány, ale neposkytnuty Primární protilátka a činidlo negativní kontroly (nedodávané se systémy K0674 nebo K0676) Kontrolní tkáň (pozitivní a negativní) Xylén, toluen nebo xylénové náhražky Etanol, absolutní a 95% Destilovaná voda Promývací lahve Roztok promývacího pufru Absorpční ubrousky Barvící nádoby nebo lázně Kontrastní barvivo: na vodní bázi, jako je Lillie s Modified Mayer s Hematoxylin (kód S3309) 0,037 mol/l hydroxidu amonného Montovací média jako je Glycergel Mounting Medium (kód C0563), Faramount, vodné montovací médium k přímému užití (kód S3025) nebo vodné permanentní montovací médium Ultramount (kód S1964) Krycí sklíčka Světelný mikroskop (20x 800x) Sklíčka: potažená poly-l-lyzinem nebo Silanized Slides (kód S3003) Volitelné materiály vyžadovány, ale neposkytnuty Pero PAP Pen (kód S2002) Upozornění 1. Pro profesionální uživatele. 2. Tento výrobek obsahuje azid sodný (NaN 3), chemikálii, která je v čistém stavu vysoce toxická. V koncentracích, v nichž se azid sodný nachází v produktu, není klasifikován jako nebezpečný, při jeho nahromadění však může reagovat s olověnými a měděnými armaturami a vytvářet vysoce výbušné koncentrace kovových azidů. Při likvidaci spláchněte velkým množstvím vody, abyste zabránili nahromadění kovových azidů v armaturách. 3,11 3. Minimalizujte mikrobiální kontaminaci činidel, abyste zabránili zesílení nespecifického barvení. 4. Používejte vhodné osobní ochranné pomůcky, abyste zabránili kontaktu s očima a kůží. 5. Nepoužitá činidla likvidujte v souladu s místními předpisy. 6. Bezpečnostní list je profesionálním uživatelům k dispozici na požádání. Prohlášení o rizicích a bezpečnosti K0676 Činidlo aktivující fuchsin R22 Zdraví škodlivý při požití. (110183-002) 301569CZ_001 str. 2/6

Uchovávání Uchovávejte činidla systému LSAB2 System, AP při teplotě 2 8 C. Nezmrazujte. Nepoužívejte po uplynutí data expirace, které je vytištěno na lahvičkách s činidly a na štítcích kitu. Nestabilita výrobku není signalizována žádnými zřetelnými známkami. Testujte proto současně se vzorky pacientů i pozitivní a negativní kontroly. Pokud dojde k nečekanému zbarvení, které nelze vysvětlit odchylkami v laboratorních postupech, a máte-li podezření na problém s výrobkem, kontaktujte Technickou službu společnosti Dako. Příprava činidel Před barvením je vhodné připravit následující činidla. Promývací roztok Činidlo TBST, 0,05 mol/l Tris Buffered Saline with Tween (kód S3006) je doporučeným promývacím pufrem pro automatickou a manuální detekci IHC. TBS, 0,05 mol/l Tris Buffered Saline (kód S1968) a PBS, 0,02 mol/l Phosphate Buffered Saline (kód S3024) jsou také vhodné roztoky promývacích pufrů pro manuální barvení. Pro oplach roztoku chromogenního substrátu a kontrastního barvení může být použita destilovaná voda. Nepoužitý promývací roztok může být uchováván při teplotě 2 8 C. Pokud se zakalí, roztok vyhoďte. Primární protilátka Pro použití se systémy LSAB2 je k dispozici široká paleta primárních protilátek a negativních kontrol (řada produktů série N). Alternativně jsou koncentrované protilátky k dispozici od společnosti Dako; avšak optimální ředění musí být experimentálně určeno uživatelem. Ředění by mělo být prováděno za použití 0,05 mol/l Tris- HCl pufru, ph 7,2-7,6, obsahujícího 1% bovinní sérový albumin (Antibody Diluent, kód S0809). 1 Činidlo negativní kontroly Pokud používáte protilátky k přímému užití série N od společnosti Dako, je jako činidlo negativní kontroly doporučena univerzální negativní kontrola(y). Tyto kontroly jsou optimalizovány pro použití jak s myšími (kód N1698), tak s králičími (kód N1699) protilátkami k přímému užití série N. Pokud jsou použity koncentrované protilátky, mělo by být do postupu testu zahrnuto činidlo negativní kontroly, které nejeví žádnou specifickou reaktivitu s lidskými tkáněmi nebo normálním/neimunním sérem ve stejné matrix/roztoku jako naředěná primární protilátka. Ideální činidlo negativní kontroly by mělo být stejného živočišného druhu a třídy jako je primární protilátka, naředěné na stejnou koncentraci imunoglobulinu nebo proteinu jako primární protilátka, pomocí stejného ředidla. Doba inkubace činidla negativní kontroly by měla být stejná jako ta u primární protilátky. Roztok chromogenního substrátu (obsažený v K0676) Pro systém LSAB2, AP je doporučen Fuchsin (kód K0624). Roztok chromogenního substrátu by měl být použit během 30 minut od přípravy. Pro dosažení lepších výsledků jej připravte bezprostředně před použitím. Následující protokol je určen pro přípravu 2 ml roztoku, který je dostatečný pro 20 tkáňových řezů nebo buněčných vzorků. Roztok chromogenního substrátu KROK 1 Nakapejte tři kapky (120 µl) chromogenu Fuchsin Chromogen do kalibrované zkumavky. Nejlepší je držet kapací láhev ve vertikální poloze a jemně zmáčknout. KROK 2 Přidejte tři kapky (120 µl) aktivačního činidla Activating Agent a jemně zamíchejte. Nejlepší je držet kapací láhev ve vertikální poloze a jemně zmáčknout. KROK 3 Inkubujte po dobu jedné minuty při pokojové teplotě. KROK 4 Přidejte pufrovaný substrát do výšky 2 ml (1,76 ml). Zamíchejte a ihned aplikujte na sklíčka.* Poznámka: Nedotýkejte se špičky kapátka prsty, abyste zabránili mikrobiální kontaminaci. Pokud je nezbytné nasazení nebo sundání špičky kapátka, je doporučeno použít rukavice. Po každém použití zkumavku důkladně opláchněte. *Aktivita endogenní alkalické fosfatázy v některých tkáních může vést k falešně pozitivním výsledkům. Tato vnitřní aktivita může být inhibována přidáním 0,0002 mol/l Levamisole (kód X3021) k chromogennímu substrátu. Levamizol neinhibuje intestinální a placentární formy alkalické fosfatázy a nemusí tedy být užitečný při barvení vzorků obsahujících tyto izoenzymy. Dostupné jsou doplňkové chromogeny kompatibilní s alkalickou fosfatázou. Fast Red Substrate System (kód K0597) tvoří na místě cílového antigenu rozpustné červené zbarvení. BCIP/NBT Substrate System (kód K0598) je výrobek k přímému užití, který tvoří na místě cílového antigenu nerozpustný modro-purpurový reakční produkt. BCIP/NBT/INT Substrate System (kód K0599) je také k přímému užití a tvoří hnědý rozpustný reakční produkt. Příprava vzorků Odkaz na Všeobecné instrukce pro imunohistochemické barvení a/nebo Seznam specifikací protilátky. (110183-002) 301569CZ_001 str. 3/6

Postup barvení Poznámky k postupu Před prvním použitím tohoto systému by si měl uživatel důkladně prostudovat instrukce a seznámit se s obsahem, zejména se zabarveními činidel, která jsou popsána ve stručných instrukcích dodaných v přiložené laminované příloze. Činidla a pokyny dodané v tomto systému byly navrženy pro optimální výkon. Další ředění činidel nebo změna inkubačních časů nebo teplot může zapříčinit chybné výsledky. Všechna činidla systému by měla před provedením postupu dosáhnout pokojové teploty (20 25 C) a stejně tak by měly být prováděny všechny inkubace při pokojové teplotě. V průběhu procesu barvení nenechejte tkáňové řezy vyschnout. Sklíčka vystavená průvanu přikryjte. Při dlouhodobých inkubacích, kdy nastává možnost vyschnutí tkáně, sklíčka umístěte do vlhkého prostředí. Pokud musí být barvící protokol přerušen, mohou být sklíčka umístěna do lázně s pufrem, která následuje po inkubaci činidla Link po dobu až jedné hodiny bez ovlivnění výkonnosti barvení. Protokol barvení KROK 1 PRIMÁRNÍ PROTILÁTKA A ČINIDLO NEGATIVNÍ KONTROLY Vyklepejte přebytek pufru a opatrně otřete okolí vzorku. Naneste dostatek optimálně naředěné protilátky nebo činidla negativní kontroly na vzorek. Inkubujte po dobu 10 minut pokud není uvedeno jinak. Jemně opláchněte promývacím roztokem z promývací láhve (nezaměřujte proud přímo na tkáň) a umístěte do čerstvé promývací lázně. KROK 2 Činidlo LINK Vyklepejte přebytek pufru a otřete sklíčka jak je popsáno výše. Naneste dostatek ŽLUTÝCH kapek (LINK) na vzorek. Inkubujte 10 minut. Opláchněte sklíčka jako v kroku 1. KROK 3 STREPTAVIDIN ALKALICKÁ FOSFATÁZA Otřete sklíčka jak je popsáno výše. Naneste dostatek ČERVENÝCH kapek (Streptavidin-AP) na vzorek. Inkubujte 10 minut. Opláchněte sklíčka jak je popsáno výše. KROK 4 ROZTOK CHROMOGENNÍHO SUBSTRÁTU Připravte roztok chromogenního substrátu (viz Příprava činidel) Otřete sklíčka jak je popsáno výše. Naneste dostatek připraveného roztoku chromogenního substrátu na vzorek. Inkubujte 10 minut. Jemně opláchněte destilovanou vodou z promývací láhve (nezaměřujte proud přímo na tkáň) a umístěte do lázně s destilovanou vodou. KROK 5 KONTRASTNÍ BARVENÍ A MONTOVÁNÍ Fuchsin (kód K0624) tvoří konečný produkt, který je částečně rozpustný v organických sloučeninách. Proto je doporučeno použití kontrastního barvení na vodné bázi jako je Mayerův nebo Gillův hematoxylin nebo Lillie s Modified Mayer s Hematoxylin (kód S3309) a montovací médium na vodné bázi jako je Glycergel (kód C0563), Faramount (kód S3025) nebo Ultramount (kód S1964). Svou vlastní dobu inkubace hematoxylinu si určí každá jednotlivá laboratoř. Po kontrastním barvení hematoxylinem následuje důkladný oplach destilovanou vodou, poté ponoření sklíček do lázně 0,037 mol/l amonné vody. Pro optimálně provedené montování umístěte nabarvená sklíčka od 15 sekund do 2 minut ve dvou obměnách do: 1. 95% alkoholu 2. 100% alkoholu 3. Jsou doporučeny náhražky xylénu. Xylén může být použit na čištění, ale může způsobit dodatečnou ztrátu barvení. Montujte pomocí permanentního montovacího média na bázi organického rozpouštědla. Snížené vystavování organickým rozpouštědlům může zachovat intenzitu barvení. K vytvoření dodatečného signálu může být doba inkubace činidla Fuchsin Chromogen zvýšena až na 30 minut. Intenzita konečného produktu může po dlouhodobém skladování vyblednout, zejména při vystavování světlu. (110183-002) 301569CZ_001 str. 4/6

Kontrola jakosti Rozdíly ve zpracování tkání a technických postupech v jednotlivých laboratořích mohou způsobit variabilitu ve výsledcích, která vyžaduje pravidelná hodnocení v rámci jedné laboratoře. Pro další informace o pozitivních a negativních kontrolách viz odkaz na Všeobecné instrukce pro imunohistochemické barvení. Interpretace barvení Všeobecná omezení Omezení vztahující se k produktu Pro návody k interpretaci viz odkaz na Všeobecné instrukce pro imunohistochemické barvení. Pro všeobecná omezení viz odkaz na Všeobecné instrukce pro imunohistochemické barvení. Ve zmrazených řezech jater (celý jaterní lalůček) a ledviny (tubulární epitel), ani ve zmrazené a formalínem fixované lymfatické tkáni (parakortikální histiocyty) nebyla zaznamenána endogenní avidin-vázající aktivita (EABA). 5,8 EABA může být potlačena 10 minutovými inkubacemi před barvícím protokolem, nejprve s 0,1% avidinem a poté s 0,01% biotinem v 0,05 mol/l Tris-HCI pufru, ph 7,2-7,6, Biotin Blocking System (kód X0590). Většina typů endogenní aktivity alkalické fosfatázy, se zásadní výjimkou střevní a placentární alkalické fosfatázy, může být inhibována použitím Levamizolu. 7 Pokud je u vzorku pozorována aktivita alkalické fosfatázy, může být Levamizol přidán do roztoku substrátu do konečné koncentrace 0,2 mmol/l Levamisole (kód X3021). Řešení problémů Problém Možná příčina Navrhované řešení 1. Žádné barvení na jakémkoli sklíčku 1a. Činidla použitá v nesprávném pořadí. 1b. Činidlo chromogenního substrátu nesprávně promícháno. 2. Slabé barvení všech sklíček. 2a. Řezy zadržely po promývací lázni příliš mnoho roztoku. 3. Nadměrné zbarvení pozadí u všech sklíček. 2b. Směs substrátu a chromogenu starší než 30 minut. 2c. Sklíčka neinkubovaná dostatečně dlouho s protilátkami nebo směsí substrátu. 3a. Vzorky obsahují vysokou endogenní aktivitu alkalické fofatázy. 3b. Parafín nekompletně odstraněn. 3c. Nesprávně opláchnutá sklíčka. 3d. Rychlejší substrátová reakce než je norma, kvůli např. vysoké pokojové teplotě. 3e. Řezy vyschlé během postupu barvení. 3f. Nespecifická vazba činidel na tkáňové řezy. 1a. Zkontrolujte aplikaci činidel. 1b. Udělejte čerstvý roztok chromogenního substrátu podle pokynů obsažených v produktu. 2a. Jemně vyklepejte přebytek roztoku před otřením okolí řezu. 2b. Připravte čerstvý roztok chromogenního substrátu. 2c. Zkontrolujte doporučené doby inkubace. 3a. Přidejte roztok Levamizolu do roztoku chromogenního substrátu (viz Omezení vztahující se k produktu). 3b. Použijte čerstvé xylénové nebo toluenové lázně. Pokud je několik sklíček barveno najednou, druhá xylénová lázeň by měla obsahovat čerstvý xylén. 3c. Používejte čerstvé roztoky v pufrovacích lázních a promývacích lahvích. Překontrolujte vhodnost promývacího pufru. 3d. Použijte kratší dobu inkubace s roztokem chromogenního substrátu. 3e. Použijte vlhkou komůrku. Otřete pouze dvě až tři sklíčka najednou před nanesením činidla. 3f. Naneste blokovací roztok obsahující protein (viz Omezení vztahující se k produktu). POZNÁMKA: Pokud problém nemůže být přiřazen žádné z výše popsaných příčin nebo pokud navrhované korektivní řešení selže, pro další pomoc kontaktujte naši technickou službu Dako. Dodatečné informace o barvících technikách a přípravách vzorků naleznete v publikacích Příručka postupů imuochemického barvení 8 (dodávaná společností Dako), Atlas imunohistologie 9 nebo Imunoperoxidázové postupy, praktický přístup k diagnostice nádorů. 10 (110183-002) 301569CZ_001 str. 5/6

Literatura 1. Guesdon JL, Ternynck T, Avrameas S. The use of avidin-biotin interaction in immunoenzymatic techniques. J Histochem Cytochem 1979; 27(8):1131 2. NCCLS. Quality assessment for immunocytochemistry; Proposed guideline. 1997; 17(10):MM4-P 3. Department of Health, Education and Welfare, National Institute for Occupational Safety and Health, Rockville, MD. Procedures for the decontamination of plumbing systems containing copper and/or lead azides. DHHS (NIOSH) Publ. No. 78-127, Current 13. August 16, 1976 4. Protection of laboratory workers from instrumentation biohazards and infectious disease transmitted by blood, body fluids, and tissue; approved guideline. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Villanova, PA 1997; Order code M29-A 5. Wood GS, Warnke R. Suppression of endogenous avidin-binding activity in tissues and its relevance to biotin-avidin detection systems. J Histochem Cytochem 1981; 29:1196 6. Banerjee D and Pettit S. Endogenous avidin-binding activity in human lymphoid tissue. J Clin Pathol 1984; 37:223 7. Ponder BA and Wilkinson MM. Inhibition of endogenous tissue alkaline phosphatase with the use of alkaline phosphatase conjugates in immunohistochemistry. J Histochem Cytochem 1981; 29(8):981 8. Naish SJ (ed). Handbook Immunochemical staining methods. Carpinteria: Dako 1989 9. Tubbs RR, Gephardt GM, Petras RE. Specimen processing and quality assurance. In: Atlas of immunohistology. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press 1986 10. Nadji M and Morales AR. Immunoperoxidase techniques, a practical approach to tumor diagnosis. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press 1986 11. Center for Disease Control Manual Guide Safety Management, No. CDC-22, Atlanta, GA. Decontamination of laboratory sink drains to remove azide salts. April 30, 1976 Edition 05/07 (110183-002) 301569CZ_001 str. 6/6