Masarykova univerzita. Přírodovědecká fakulta Katedra biochemie. Nejnovější proteomické technologie

Masarykova univerzita Přírodovědecká fakulta Katedra biochemie Nejnovější proteomické technologie Bakalářská práce Jarmila Sobotková Brno 2006

Chtěla bych poděkovat RNDr. Zbyňkovi Zdráhalovi Dr., za poskytnutí výsledků experimentální části, která byla provedena v laboratoři hmotnostní spektrometrie. Prohlašuji že jsem práci vypracovala samostatně pod odborným vedením Mgr Pavla Bouchala Ph.D a za použití odborné literatury, jejíž seznam je uveden. 2

OBSAH 1 Úvod... 4 1.1 Cíl práce... 5 2 Teoretická část... 6 2.1 Dvourozměrná elektroforéza... 6 2.2 Úvod do hmotnostní spektrometrie... 9 2.3 Identifikace proteinů hmotnostní spektrometrií... 11 2.4 SELDI... 12 2.5 MudPIT... 14 2.6 COFRADIC... 15 2.7 ICAT... 17 2.8 SILAC... 19 2.9 itraq... 21 3 Experimentální část... 24 4 Závěr... 27 5 Literatura... 29 6 Seznam zkratek... 30 3

1. Úvod V posledních letech rychle se rozvíjející genomika poskytla množství informací o expresi jednotlivých genů v buňkách. Použití genomických přístupů je nicméně limitované, jelikož genomika není schopna poskytnout informace o vlastní aktivitě proteinů, jejich lokalizaci, postranslačních modifikacích a interakčních partnerech. Další limitace genomických metod plyne ze skutečnosti, že vztah mezi hladinou mrna ( transkriptomem ), procesem translace, mírou exprese proteinu v buňce ( proteomem ) a aktivním proteinem není zcela jednoznačný. Vzhledem k těmto limitacím je ke genomovým funkčním studiím nutná identifikace vlastních kódovaných proteinů současně s informací o jejich expresi. Studiu kompletního souboru proteinů v organismu (proteom) se věnuje proteomika. Studuje proteiny určité buňky či tkáně v daném stavu za definovaných podmínek, a jejich roli ve struktuře, funkci a statutu (zdravý či nemocný) v organismu, protože skladba proteomů se neustále mění (proteiny se rychle syntetizují a také rozkládají). Proteomika se také zabývá identifikací, charakterizací a kvantifikací proteinů či analýzou exprese proteinů v buňkách za různých podmínek, za účelem osvětlení biochemických a fyziologických mechanismů na molekulární úrovni. Proteomika má řadu dílčích podoborů, např. tzv. klinická proteomika se pomocí analýzy bílkovinného spektra vzorků (např. moč, sliny, krev) pokouší odhalit nové markery, které by v budoucnosti mohly pomoci ve včasné diagnóze a léčbě konkrétního onemocnění. Expresní proteomika se zabývá expresí proteinů v různých buňkách daného organismu, strukturní proteomika zahrnuje jejich subcelulární lokalizace v různých organelách, jejich postranslační modifikace a vzájemné interakce. Vztahem mezi strukturou a funkcí se zabývá funkční proteomika. Kvalitativní proteomické přístupy jsou převážně založeny na purifikaci proteinů, jejich separaci pomocí chromatografických či elektroforetických technik, proteolytickém štěpení proteinu a následné analýze získané peptidové směsi. Nejčastější je použití kombinace kapalinové chromatografie a hmotnostní spektrometrie nebo tandemové hmotnostní spektrometrie.jedním z přístupů kvantitativní proteomiky, jsou metody využívající izotopového značení.pro začlenění stabilního izotopu do proteinu jsou např. používány přístupy SILAC a ICAT. 4

1.1 Cíl práce Cílem práce je shrnout principy nejnovějších proteomických metod, které nevyužívají gelové separace. Pokusit se o jejich srovnání a vybrat z nich nejvhodnější pro separaci a kvantifikaci membránových bakteriálních vzorků. 5

2. Teoretická část 2.1 Dvourozměrná elektroforéza Dvourozměrná elektroforéza je formou gelové elektroforézy, obvykle požívaná k analýze proteinů 1. Dva rozměry, ve kterých jsou proteiny separovány, odpovídají isoelektrickému bodu a velikosti proteinu (viz. Obr.1). Celý proces začíná přípravou vzorku, následuje isoelektrická fokusace, polyakrylamidová elektroforéza a nakonec vizualizace obrazu separovaných bílkovin. Příprava vzorku je jednou z nejdůležitějších a také nejproblematičtějších částí proteomiky kvůli svému vlivu na obraz proteinové mapy. Solubilizovaný vzorek je separován isoelektrickou fokusací, během níž se bílkoviny rozdělí v elektrickém poli na základě svých isoelektrických bodů (pi) což je hodnota ph při které je součet nábojů proteinu nulový. Toho docílíme tak, že na gel, ve kterém je vytvořen ph gradient, naneseme protein a aplikujeme elektrické napětí. Proteiny pak migrují ke katodě či k anodě dle svého celkového náboje až do chvíle, kdy ph místa v gelu odpovídá pi proteinu. Pro tento účel je možno použít trubičkové gely nebo také komerční proužky gelu s imobilizovanými ph gradienty (IPG-IEF). Po separaci v prvním rozměru se trubičkový gel, nebo komerční proužek obsahující proteiny rozdělené isoelektrickou fokusací umístí na vrch deskového gelu. Deskový gel obsahuje dodecylsulfát sodný, který udělí proteinům uniformní specifický náboj - proteiny jsou pak separovány pouze podle svých velikostí. Elektrické napětí aplikujeme kolmo vzhledem k původní orientaci elektrod. Po proběhnutí SDS-PAGE je třeba proteiny vizualizovat. Pro obarvení se používá barvivo Coomassie Brilliant Blue. Toto barvení je navíc kvantitativní a gel je možné použít pro analýzu hmotnostní spektrometrií. Dalším způsobem je barvení stříbrem. Toto barvení je sice 10-100x citlivější, ale jelikož se stříbrné ionty vážou jen na některé aminokyselinové zbytky (Asp, Glu, His, Cys, Met, Lys) nelze tuto metodu považovat za plně kvantitativní. Nejnovější metodou je fluorescenční barvení které je kvantitativní a také slučitelné 6

s hmotnostní spektroskopií jako Coomassie, a svou citlivostí je srovnatelné s barvením stříbrem, ale nevýhodou je jeho vysoká cena. Nezachycené barvivo se vymyje a výsledkem je tzv. proteinová mapa (viz. Obr. 2). Vyhodnocovací software umožňuje přiřadit ke každé skvrně na 2-DE gelu určitý isoelektrický bod a relativní molekulovou hmotnost. Hodnoty jsou však pouze přibližné a pro identifikaci separovaných proteinů se proto používá např. Edmanovo odbourávání nebo hmotnostní spektrometrie. Nevýhodou dvourozměrné elektroforézy je časová a manuální náročnost. Dalším problémem je nedostatečné rozlišení v případě že jsou si dva proteiny tak podobné, že se zobrazí pouze jako jedna skvrna v gelu. Tento problém však může vyřešit použití úzkého rozsahu ph při isoelektrické fokusaci, které zvýší rozlišení. Daleko větší jsou problémy spojené s extrakcí a rozpustností během dvourozměrné elektroforézy. To se týká hlavně proteinů které se špatně rozpouští ve vodě, jako jsou membránové a jaderné proteiny. Poslední problém je spojen s dynamickým rozsahem 2 dvourozměrné elektroforézy, který činní max. 10 4. Skvrny proteinů, v proteinové mapě, které jsou ve vzorku hojně zastoupeny tak můžou překrývat další proteiny s menší koncentrací ve vzorku, což snižuje citlivost metody, nehledě na proteiny jejichž koncentrace ve vzorku je tak nízká, že i po obarvení gelu nejsou vidět. Proteiny, jejichž koncentrace ve vzorku je příliš vysoká, můžeme sice ze vzorku odstranit např. afinitní chromatografií, ale tím můžeme odstranit i menší proteiny které na ně můžou být vázány. 7

Obr.1 Schematicky znázorněná dvourozměrná elektroforéza. 1. rozměr: isoelektrická fokusace: rozdělení proteinů na základě svých isoelektrických bodů. 2. rozměr: gelová elektroforéza: rozdělení proteinů na základě svých velikostí. Obr.2. Výsledná proteinová mapa z dvourozměrné elektroforézy 8

2.2 Úvod do hmotnostní spektrometrie Hmotnostní spektroskopie je fyzikálně chemická metoda, která umožňuje určení molekulové hmotnosti. Hmotnostní spektrometr ze směsi iontů a molekul separuje nabité částice podle jejich hmotnosti a poskytuje údaje o relativním zastoupením iontů stejné hmotnosti ve směsi. Hmotnostní spektrometrie je metoda citlivá a umožňuje analyzovat látky v množství kolem 10 9 g. Hmotnostní spektrometr se skládá z ionizátoru, analyzátoru a detektoru. Přičemž ionizovat daný vzorek můžeme např. elektrosprejem nebo laserem za účasti matrice (MALDI). MALDI Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization - Laserová desorpce/ionizace za přítomnosti matrice usnadňující desorpci, je ionizační technika používaná v hmotnostní spektrometrii, která umožňuje ionizovat biomolekuly jež mají sklon se rozpadat při použití ostatních ionizačních metod. Hlavním rozdílem jimž se liší MALDI od ostatních hmotnostních spektrometrií je použití matrice, která chrání biomolekuly před destrukcí přímého laserového paprsku. Analyzované proteiny jsou krystalizovány spolu se sloučeninou tvořící matrici a poté jsou převedeny do plynné fáze laserovým paprskem. Ionizace elektrosprejem (ESI) Při ionizaci elektrosprejem prochází vzorek (v roztoku) kapilárou, na které je vloženo vysoké napětí (3-5 kv). Vzorek se na výstupu z kapiláry rozprašuje 3 do vakuové trubice, vznikají malé kapičky, které nesou vlivem vysokého gradientu elektrického pole kladný nebo záporný náboj podle polarity vloženého napětí na kapiláru. Někdy se používá neutrální plyn (N 2 ) který napomáhá lepšímu rozprašování roztoku a vypařování rozpouštědla. Odpařováním rozpouštědla dochází ke zmenšení velikosti kapiček a tím i ke zvýšení hustoty povrchového náboje, až dojde k rozpadu na menší kapičky. Ionty pokračují do analyzátoru. Způsoby analýzy se také liší, používá se např. TOF ( Time of flight doba letu) nebo kvadrupóly. 9

TOF Ionizované proteiny jsou urychleny elektrickým polem do hmotnostního analyzátoru, kde jsou ionty rozděleny na základě jejich hmotnosti a náboje. Molekulové hmotnosti iontů jsou zjištěny měřením doby jejich letu k danému detektoru a vztaženy k poměru hmotnosti analytu a jeho náboje (m/z). Kvadrupóly Kvadrupól se skládá ze 4 paralelních kovových tyčí 4 Vždy protilehlé tyče mají buď kladný nebo záporný náboj. Mezi tyčemi s opačným el. nábojem vzniká elektrostatické pole (elektrické napětí). Ionty vstupují do kvadrupólu (mezi tyče) podélně (viz. Obr.3.). Pouze ionty s určitým poměrem m/z dosáhnout detektoru, kvůli danému elektrickému napětí. Ostatní ionty nestabilně oscilují a jsou nakonec přitaženy el. polem některé z tyčí. Při změně el. napětí se změní taky poměr m/z iontů, které dosáhnou detektoru. Obr.3. Kvadrupólový hmotnostní filtr Získaná data lze zobrazit jako hmotnostní spektrum v podobě četnosti výskytu iontu (intenzita) s daným poměrem m/z v závislosti na m/z. 10

2.3 Identifikace proteinů hmotnostní spektrometrií Proteiny mohou být charakterizovány v zásadě dvěma přístupy - Peptide mass fingerpriting (PMF) a Peptide fragment sequencing (PFS). Peptide mass fingerpriting Protein (buď v roztoku nebo v gelu) se štěpí proteázou, jež specificky štěpí polypeptidický řetězec, na jednotlivé peptidy. Nejčastěji se používá trypsin štěpící polypeptidový řetězec na C-straně argininu a lysinu. Směs peptidů je analyzována pomocí MALDI-TOF MS. Výsledkem je hmotnostní spektrum směsi peptidů. Počet a velikost peptidů je následně porovnána s databází proteinů. Výhody tohoto přístupu spočívají ve vysoké citlivosti hmotnostní spektroskopie pro malé molekuly, ve snadnosti se kterou jsou peptidy získány štěpením a elucí z gelu ve srovnání s obtížnou elucí neštěpeného proteinu z gelu. Nevýhodou je, že se dá zjistit pouze relativní molekulová hmotnost proteinu a jednotlivých peptidů, a taky že musí jít o známé, již sekvenované, proteiny. Peptide fragment sequencing Tato metoda umožňuje získat informaci o částečné sekvenci proteinů. Proteiny jsou štěpeny proteázou (stejně jako v předchozí metodě) na peptidy. Ty jsou podrobeny obvykle reverzně fázové kapalinové chromatografii, při které dojde k rozdělení peptidů na základě jejich mobility. Jednotlivé frakce se postupně dostávají do hmotnostního spektrometru, kde je v reálném čase vybrán jeden či více peptidů, který je dále fragmentován. Fragmenty jsou pak postupně vháněny na detektor podle poměru m/z.. Výsledkem je soubor MS spekter peptidů a MS/MS spekter směsí fragmentů. Velikosti jednotlivých fragmentů jsou porovnávány a jejich rozdílem jsou zjištěny jednotlivé aminokyseliny. 11

2.4 SELDI Surface Enhanced Laser Desorption/Ionization - Laserová desorpce/ionizace s vylepšeným povrchem. Princip této metody je založen na interakci (adsorpce, elektrostatická interakce, afinitní chromatografie) proteinů s vlastním povrchem čipu 5. Na destičce čipu jsou terčíky s chemickými (hydrofobní, hydrofilní, kationický, anionický) nebo biochemickými (protilátka, ligand, receptor, DNA) povrchy (viz. Obr.4.). Čipy s povrchy IMAC nesou na svém povrchu imobilizovanou kyselinu nitrilotrioctovou, umožňující chelataci dvojmocných (Zn, Cu, Ca, Mg, Ni, Co,) a trojmocných (Al, Fe, Ga) iontů kovů. Obr.4. Možnosti dostupných chemických a biologicky aktivních povrchů Na terčíky s určitým typem povrchu se nanese analyzovaný vzorek proteinu. Následně se terčíky promyjí, aby zůstal navázán jen protein s určitými vlastnostmi. Následuje hmotnostní spektrometrie, kdy je terčík ionizován laserem (za učasti matrice). Ionizované proteiny se rozdělí podle hmotnosti a jejich náboje. Výsledkem je spektrum analyzovaných proteinů. 12

Metoda SELDI umožňuje využití čipů ke hledání nových biomarkerů různých onemocnění, přípravu čipů s biochemickým povrchem, umožňující studium biomolekulárních interakcí. Velkou výhodou rozdílných povrchů čipů je, že daný vzorek směsi proteinů může být analyzován současně na několika různých sorbentech, aby byly analyzovány všechny proteiny ve vzorku. Další výhodou je rychlost analýzy a minimální množství vstupního materiálu. Naopak nevýhodou této metody je, že není tak citlivá a přesná v určení analyzovaných proteinů. Problémem je také dosažení 100% shodnosti kvality chemického povrchu jednotlivých šarží čipů potřebná pro reprodukovatelnost výsledků, a dále biologická heterogenita u nemocných a kontrolních jedinců při hledání nových biomarkerů studovaného onemocnění. 13

2.5 MudPIT Multidimensional protein identification technology Několikarozměrná proteinová identifikační technologie. Metoda nejčastěji používá 6 2 nezávislé fyzikální vlastnosti náboj (ionex) a hydrofobicitu (reverzně-fázová chromatografie) k rozdělení komplexní směsi peptidů, před hmotnostní spektrometrií. Později bylo prezentováno mnoho možností jak metodu modifikovat použitím jiných variant dělení proteinů. Denaturované a redukované proteiny jsou nejprve štěpeny trypsinem na jednotlivé peptidy. Okyselená směs peptidů (udělení kladného náboje peptidům) se nanese na kolonu ionexové chromatografie katex (SCX). Z katexové kolony je první frakce peptidů přenesena na on-line spojenou, reverzně-fázovou kolonu (viz. Obr.5.). Následně jsou peptidy postupně vymývány z reverzně-fázové (RP) kolony gradientem zvyšující se koncentrace acetonitrilu. Poté následuje reekvilibrace RP kolony a z SCX kolony je přenesena další frakce peptidů použitím mobilní fáze obsahující sůl, ta je opět eluována z RP kolony novým gradientem acetonitrilu. Tento proces se mnohokrát opakuje se stále se zvyšující koncentrací solí pro vymývání peptidových frakcí z SCX kolony. Peptidy z kolony reverzní chromatografie on-line přechází do hmotnostního Obr.5. Schéma metody MudPIT spektrometru, kde jsou fragmentovány a odečtem hmotností jednotlivých fragmentů je určena sekvence, podle níž 14

je určen daný peptid respektive protein. Zapojení on-line znamená, že kolony na sebe přímo navazují. Ukazuje se však, že účinnější je zapojení off-line, kdy jsou sbírány jednotlivé frakce z první kolony a ty jsou pak naneseny na kolonu druhou. MudPIT je rychlá, vysoce automatická metoda pro opakovanou analýzu proteinů. Přímá identifikace proteinů ze směsí obejde možné limitace gelové elektroforézy, jako je nerozpustnost proteinů a limitovaný rozsah frakcionace. Výhodou je, že kapilára vedoucí z kolony může být umístěna přímo do iontového zdroje hmotnostního spektrometru. 2.6 COFRADIC Combined fractional diagonal chromatography Kombinovaná frakční diagonální chromatografie. Současné způsoby analýzy proteomu se opírají o hmotnostní spektroskopii enzymaticky štěpené směsi proteinů. Před vlastní analýzou se směs separuje chromatografickými metodami, aby se redukovala složitost analyzovaného vzorku. COFRADIC redukuje směs proteinů pouze na N terminální peptid každého proteinu ve vzorku (viz. Obr.6.). Během této metody 7 jsou nejprve jsou všechny cysteiny v proteinu alkylovány, aby nedošlo k vytvoření disulfidických můstků, a volné amino skupiny v proteinu jsou blokovány acetylací. Následně jsou proteiny štěpeny trypsinem. Takto se vytvoří dva typy peptidů: N terminální peptidy s blokovanou amino skupinou a vnitřní peptidy s volnou amino skupinou. Tyto peptidy jsou rozděleny reverzně fázovou chromatografií, na základě polárnosti řetězce, obvykle na 12 frakcí. Sníží se tak počet peptidů ve směsi a při identifikaci je vzorek méně složitý. K jednotlivým frakcím je přidána 2,4,6-trinitrobenzensulfonová kyselina (TNBS).Vnitřní peptidy reagují s TNBS za vzniku velice hydrofobních trinitrophenyl- peptidů (TNP-peptidy), zatímco blokované N terminální peptidy nereagují. Označené vnitřní peptidy mají nyní delší eluční čas a separují se od nezměněných N terminálních peptidů, které se pak snadněji sbírají pro další analýzu. Výhodou této metody je redukce velkého množství analyzovaných peptidů pouze na N terminální peptidy což zlepšuje přehlednost analýzy. Prolin a pyroglutamátové zbytky však reagují pomalu a nebo vůbec s TNBS. Vnitřní peptidy s těmito N terminálními 15

zbytky tak nevykazují hydrofobní posun a jsou izolovány spolu s blokovanými N terminálními peptidy. Další nevýhodou je právě identifikace pouze jednoho peptidu z celého proteinu. Snadněji tak může dojít k experimentální chybě, než při identifikaci více peptidů. Tento problém se dá minimalizovat použitím vysoce přesného hmotnostního spektrometru měřícího s chybou menší než 1 ppm 17. Obr. 6. Schéma COFRADIC 1. Alkylace cysteinu 2. Acetylace volných amino skupin proteinu 3. Štěpení proteinu trypsinem 4. Reakce amino skupin vnitřních peptidů s TNBS 5. Nezměněné N terminální peptidy, které jsou analyzovány 6. Vnitřní peptidy vykazující hydrofobní posun při kapalinové chromatografii. 16

2.7 ICAT Isotope-coded afinity tags - Izotopově kodované afinitní značky. Kvantitativní metoda ICAT je založena na nových chemických reagentech ICAT a tandemové hmotnostní spektroskopii. 8 Regenty jsou složeny ze 3 funkčních částí (viz.obr.7.): - afinitní značka (biotin) používá se k isolování označených peptidů - linker začleňuje stabilní isotopy - reaktivní skupina se specifikou k thiolovým skupinám Obr.7. Složení reagentů ICAT Reagenty existují ve dvou formách, těžké (obsahují 8 atomů deuteria ve své struktuře) a lehké (obsahují jen vodíky). Nejprve vzorek proteinu, reprezentující určitý stav buňky, reaguje s lehkou formou reagentu.těžká forma reaguje se vzorkem proteinu reprezentující jiný stav buňky. Reagent ICAT se kovalentně naváže na každý cysteinový zbytek ve všech proteinech. Oba vzorky jsou smíchány a enzymaticky štěpeny na peptidové fragmenty. Označené fragmenty (peptidy s reagentem na cysteinu) jsou izolovány avidinovou afinitní chromatografií. Takto izolované peptidy jsou následně separovány reverzně fázovou chromatografií a analyzovány tandemovou hmotnostní spektroskopií. Výsledkem je spektrum, kde se dvojice peptidů o stejné sekvenci navzájem liší poměrem m/z, tzn. liší se isotopickou těžkou či lehkou formou reagentu (viz. Obr.8.). Tato dvojice peptidů může mít, stejnou intenzitu signálu, pokud je protein obsahující daný peptid, syntetizován v obou stavech buňkách ve stejném množství. Jestliže je intenzita různá, protein je syntetizován v každém stavu v odlišném množství. Relativní množství 17

proteinu je určeno poměrem signálů nebo plochou píků těchto peptidových dvojic, přičemž poměr ploch píků je přesnější. Obr. 8. Schéma ICAT 1. Označení proteinů reagentem ve dvou odlišných stavech buňky 2. Štěpení trypsinem, isolace označených peptidů 3. Porovnání množství dvojice peptidů na základě poměru velikosti jejich signálů 4. Identifikace proteinu tandemovou hmotnostní spektrometrií ICAT zahrnuje několik důvodů proč se stát základem kvantifikačních metod v proteomice: - významně redukuje komplexnost proteinové směsi ve vzorku, protože k identifikaci a kvantifikaci používá jen peptidy s reagenty ICAT, které jsou navázány na cysteinové zbytky. Celá směs peptidů je tedy redukována pouze na peptidy obsahující cystein v řetězci. - chemické reakce s reagenty mohou probíhat v přítomnosti různých chemických látek např. moči, solí, které neobsahují reaktivní thiolovou skupinu. - citlivost LC-MS/MS závisí na kvalitě vzorku. Běžně používané činidla pro rozpouštění proteinů, jsou ale špatně slučitelné s MS. Tyto látky však eliminuje avidinová afinitní chromatografie. Naopak nevýhodou metody ICAT je množství kroků během kterých může být obtížné udržet vzorky v porovnatelném stavu. Chemické modifikace a afinitní purifikace je obtížné 18

provádět s malým množstvím vzorku, a peptidy neobsahující cystein jsou někdy vázány v avidinové koloně. 2.8 SILAC Stable isotope labeling by amino acids in cell culture Stabilními izotopy značené aminokyseliny v buněčné kultuře. Buňky savců nejsou schopné syntetizovat některé aminokyseliny. Proto musí být tyto esenciální aminokyseliny dodávané v médiu (pro podporu růstu). Isotopicky značená analoga těchto aminokyselin můžou být syntetizovány a jsou komerčně dostupné. Jestliže je označený analog určité aminokyseliny dodávaný místo přírodní formy, může být zainkorporován do každého nově syntetizovaného proteinového řetězce. Po určitém počtu buněčných dělení je každá aminokyselina nahrazena svým isotopicky značeným analogem. Toho využívá metoda SILAC 9. Buněčnou kulturu pěstujeme na dvou médiích, přičemž jedno z nich obsahuje izotopicky značenou aminokyselinu (ve své struktuře má zabudované deuterium), která se začleňuje do proteinových řetězců. Obě pěstované kultury se od sebe navzájem liší stavem buněk. Po určitém počtu buněčných dělení jsou proteinové populace z obou vzorků sklizeny. Extrakty mohou být přímo smíchány, protože izotopická značka je zakódována přímo v sekvenci aminokyselin každého proteinu. Proteiny jsou analyzovány jedním ze známých proteomických přístupů např. gelová elektroforéza spojená s Peptide mass fingerpriting nebo štěpení proteinu trypsinem na peptidy a následně LC-MS/MS. Stanovení množství jednotlivých peptidů se provádí hmotnostní spektrometrií porovnáním signálů peptidů z různých stavů buňky. Kde se relativní množství peptidu, respektive proteinu, zjistí poměrem ploch píků dvou peptidů o stejné sekvenci, lišících se pouze izotopicky značenou aminokyselinou v řetězci. Použití stabilních isotopů k označení proteinů v savčích buňkách má několik výhod: - v mnoha biologických metodách je limitující množství vstupního vzorku. Rozhodující počet manipulací po sklízení proteinu, a SILAC nevyžaduje žádné značení peptidů. 19

- vzhledem k tomu že začlenění izotopu do proteinu je prakticky 100% nejsou zde žádné rozdíly v účinnosti značení mezi jednotlivými vzorky. - použití isotopicky značené aminokyseliny k označení, se používá více než isotopová jádra, protože takovéto označení je specifické v sekvenci proteinů a rozdílná hmotnost mezi dvěma stavy buňky může být určena přesněji. Když porovnáme metody SILAC a ICAT (viz.obr.9.), na jednu stranu je SILAC výhodnější, protože (při použití leucinu) odlišně označí více jak polovinu tryptických štěpů proteinů, kdežto ICAT jen 20 %. Na stranu druhou ICAT zmenšuje složitost peptidové směsi vzorku, kdežto SILAC po štěpení trypsinem nezmění výsledné množství peptidů. Obr.9. Porovnání metod SILAC a ICAT 20

2.9 itraq Isobaric tags for relative and absolute quantitation Isobarické značky pro relativní a absolutní kvantifikaci. Technika je založena na chemickém značení peptidů (vytvořených proteinovým štěpením proteinů izolovaných z buněk) obsahujících volnou α amino skupinu tzn. N-terminální peptidy a lysin. Ke značení se využívá sady 4 isobarických itraq reagentů, které jsou specifické k amino skupině 10. Kompletní molekula reagentu (viz. Obr.10.) se skládá z: - reportérové skupiny založené na N-methylpiperazinu - balanční skupiny karbonylová skupina - skupina reagující s peptidy N-hydroxysukcinimid ester Celková hmotnost reportérové a balanční složky molekuly je udržována konstantní, pomocí rozlišujících isotopů, obohacených atomy 13 C, 15 N, 18 O. Tím se zabrání problémům při chromatografické separaci vyskytujících se u obohacení zahrnujících deuterium. Vzorek značený deuteriem má odlišnou hmotnost než vzorek bez deuteria a tak i jinou mobilitu v koloně. Značení pomocí deuteria využívá např. metoda ICAT. Hmotnost reportérové skupiny je v rozmezí 114-117 Da, podle toho kolik atomů uhlíku ve skupině je nahrazeno atomem 13 C a je-li dusík nahrazen atomem 15 N. Balanční skupina má hmotnost v rozmezí 28-31 Da tak, aby v kombinaci s reportérovou skupinou zůstala celková hmotnost reagentu konstantní (145 Da) pro každý ze čtyř reagentů. Toho je docíleno nahrazováním atomů uhlíku a kyslíku izotopy 13 C a 18 O. 21

Obr.10. Molekula reagentu itraq. Proteiny izolované nanejvýš ze čtyř různých vzorků buněk jsou nejprve redukovány, alkylovány a štěpeny trypsinem odděleně, ale souběžně (viz. Obr.11.) Výsledné peptidy jsou označeny reagenty itraq. Reagenty tvoří vazbu s jakoukoliv aminovou skupinou peptidu, tzn. N-terminální peptidy a amino skupiny lysinu. Označené vzorky jsou smíchány a rozděleny na frakce nejdříve ionexovou chromatografií (katex) a následně reverzně-fázovou chromatografií. Následuje hmotnostní spektrometrie, kde se zobrazí jen jeden pík pro určitý peptid ze všech čtyř značených vzorků buněk. To způsobuje právě konstantní hmotnost reagentů. V tandemové spektroskopii dochází k rozštěpení značky peptidu tak, že reportérová skupina nese náboj, kdežto balanční skupina ne, a proto nedojde k jejímu zaznamenání. Jak už bylo zmíněno reportérová skupina nese náboj a protože došlo k jejímu odštěpení od balanční skupiny, projeví se rozdílná hmotnost 4 typů reagentů. Výsledkem je spektrum, kde se čtveřice peptidů stejné sekvence, liší v hmotnosti podle typu použité značky. Čím víc je tedy peptidu ve vzorku, tím větší pak bude pík ve spektru u příslušné značky. Množství daného peptidu ve čtyř různých stavech buňky se zjistí poměrem ploch píků. Peptid se identifikuje na základě své sekvence, zjištěné fragmentací peptidu a odečtem hmotností fragmentů. 22

Obr.11. Schéma itraq Výhodou této metody je možnost detekce i postranslačních modifikací a také že můžeme pracovat s více vzorky najednou. Naopak nevýhodou je potřeba delšího času při analýze ve hmotnostním spektrometru z důvodu velkého množství peptidů, a taky přesná příprava vzorků. Metoda itraq je vhodná pro: - analýzu postranslačních modifikací, - analýzu proteinové exprese nebo kvantitativní experimenty vyžadující přesnost a statistickou platnost - objevení či potvrzení analýz pro biomarkerové vysvětlení nebo pro prověření norem léčiv. 23

3. Experimentální část Materiál a metody Membránová frakce anaerobně rostlých buněk Paracoccus denitrificans byla připravena podle standardního protokolu v laboratoři prof. Kučery. Membránová frakce byla naštěpena trypsinem, poté byl vzorek centrifugován, vzniklý supernatant byl analyzován na LC-MS/MS v laboratoři hmotnostní spektrometrie na hmotnostním spektrometru Esquire 2000 (Bruker) s ionizací elektrosprejem a iontovou pastí jako analyzátorem podle standardního protokolu. Identifikace proteinů byla provedena na základě databáze přeloženého genomu P. denitrificans. Výsledky LC-MS chromatogram membránové frakce anaerobně rostlých buněk P. denitrificans, je na obrázku 12. Pro ilustraci uvádím MS spektrum peptidů v čase 18,8 min. (viz Obr. 13). Software si automaticky vybírá peptid s největší intenzitou (752,8), který je dále fragmentován. Výsledkem je MS/MS spektrum (viz. Obr. 14.). Takto byla provedena analýza celého vzorku. Na základě získaných dat byla provedena identifikace přítomných proteinů. Bylo nalezeno 12 proteinů s uspokojivou mírou shody, která je dána skórem vypočteným na základě vlastností databáze. Proteiny č. 4 a 9 reprezentují ATP syntasy, které byly identifikovány jako jedny z nejintenzivnějších proteinů membránové frakce P. denitrificans pomocí 2-DE analýz 11 Protein č. 6 reprezentuje 60 kda chaperonin, který byl nalezen jako nejhojnější protein v celobuněčném lyzátu P. denitrificans na základě 2-DE analýzy 11. Použití metod popsaných v kapitolách 2.4 2.9 by umožnilo rozšíření spektra identifikovaných proteinů, kvantifikovat proteiny a srovnat jejich expresi za různých růstových podmínek. 24

Intens. x10 6 6 4 2 10 20 30 40 50 Time [min] Obr. 13. LC-MS/MS chromatogram Intens. x10 4 +MS, 18.8min (#559) 752.8 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 286.1 343.1 567.4 385.6 504.8 639.6 874.4 995.1 1133.8 0.0 200 400 600 800 1000 1200 m/z Obr. 14. MS spektrum v čase 18.8 min 25

Intens. 1000 +MS2(753.2), 18.8min (#558) 872.5 800 600 345.2 400 686.3 801.1 971.4 1115.5 487.4 597.2 725.2 1184.5 200 258.3 429.7 1330.3 0 200 400 600 800 1000 1200 m/z Obr. 15. MSMS spektrum iontu o m/z 753.2 1. Ct59_gene2064 Mass: 22549 Score: 85 Peptides matched: 2 Q9A2Q3 SCO1/2 family protein. Caulobacter crescentus. 2. Ct64_gene3497 Mass: 10300 Score: 66 Peptides matched: 3 Q5LM20 DNA-binding protein HU. Silicibacter pomeroyi. 3. Ct62_gene2787 Mass: 17920 Score: 64 Peptides matched: 1 P95680 SPB. Rhodobacter sphaeroides (Rhodopseudomonas sphaeroides). 4. Ct57_gene1596 Mass: 50308 Score: 64 Peptides matched: 3 Q5LNP1 ATP synthase F1, beta subunit (EC 3.6.3.14). Silicibacter pomeroyi. 5. Ct61_gene2542 Mass: 11698 Score: 58 Peptides matched: 1 Q8FVS0 Iron compound ABC transporter, permease protein. Brucella suis. 6. Ct57_gene1741 Mass: 57685 Score: 53 Peptides matched: 1 Q9Z462 60 kda chaperonin (Protein Cpn60) (groel protein). Paracoccus denitrificans. 7. Ct62_gene2835 Mass: 48653 Score: 52 Peptides matched: 2 P52156 Transcription termination factor rho. Rhodobacter sphaeroides (Rhodopseudomonas sphaeroides). 8. Ct36_gene52 Mass: 155365 Score: 52 Peptides matched: 1 Q5LMQ6 DNA-directed RNA polymerase, beta' subunit (EC 2.7.7.6). Silicibacter pomeroyi. 9. Ct57_gene1598 Mass: 55005 Score: 51 Peptides matched: 1 P05439 ATP synthase alpha chain (EC 3.6.3.14). Rhodopseudomonas blastica. 10. Ct45_gene367 Mass: 22055 Score: 48 Peptides matched: 1 Q5LMI7 OmpA domain protein. Silicibacter pomeroyi. 11. Ct67_gene4785 Mass: 22830 Score: 47 Peptides matched: 2 Q5LSB3 Hypothetical protein. Silicibacter pomeroyi. 12. Ct61_gene2437 Mass: 33619 Score: 44 Peptides matched: 1 Q9RAD5 Salt-stress induced outer membrane protein SspA. Rhodobacter sphaeroides f. sp. denitrificans. Tab. 1. Výsledek identifikace proteinů 26

4. Závěr Proteomika je vědní obor, který navazuje na genomiku. Zabývá studiem funkce, struktury a exprese proteinů. Studium proteinů v různých stavech buňky nám může pomoci v odhalení a při léčbě nemocí. Z proteomických metod, které umožňují vysoce účinné separace proteinů a jejichž identifikace a kvantifikace se běžně používá, dominuje dvourozměrná elektroforéza v kombinaci s hmotnostní spektrometrií. Vzhledem k časové i manuální náročnosti, problémy s rozpustností membránových proteinů a problémy s citlivostí - proteiny s vysokou koncentrací ve vzorku mohou v gelu překrýt proteiny s nižší koncentrací, se hledají další technologie. Žádná z nich však dosudnení považována za jednoznačnou náhradu dvourozměrné elektroforézy. Vícerozměrná chromatografie, označovaná jako MudPIT, se používá nejvíce. Neumožňuje však kvantitativní srovnání více vzorků v jednom běhu. Metoda SELDI založená na specifické interakci povrchu čipu s proteinem se zdá být velmi perspektivní v klinické praxi pro své rychlé provedení. Neumožňuje však identifikaci proteinů a otázkou je také citlivost použité MS detekce. Značné snížení komplexity vzorků výběrem pouze N-terminálních peptidů, použitím TNBS, umožňuje metoda COFRADIC. Avšak prolin a pyroglutamátové zbytky reagují pomalu nebo vůbec s TNBS a také při identifikaci pouze jednoho peptidu může snadněji dojít k experimentální chybě. Kvantifikace dvou vzorků v jednom běhu umožňuje metoda ICAT. Komplexita vzorku je redukována pouze na peptidy obsahující určitou aminokyselinu ve svém řetězci, na nějž se vážou reagenty. Problém však nastává při práci s bakteriálními vzorky. Jelikož bakteriální proteiny obsahují málo cysteinu, nemusí být metodou vůbec zachyceny a identifikovány. Velice užitečný prvek vnáší metoda SILAC označení vzorku (izotopicky značenou aminokyselinou) přímo během růstu. Tak jako metoda ICAT dovoluje i tato metoda kvantifikovat dva vzorky v jednom běhu. Ovšem vlastní separační problém není řešen, proteiny se separují některým z výše uvedených standardních principů. Identifikační principy metod ICAT a SILAC jsou založeny na LC separaci týchž peptidů, které však obsahují různé izotopy. Mají tedy mírně odlišnou hmotnost a tak 27

i odlišnou mobilitu v koloně, což může vést k problémům při separaci. Tento problém odstraňuje metoda itraq, využívající izobarických značek. Metoda umožňuje kvantifikaci až čtyř vzorků v jednom běhu. Kvantifikace probíhá na základě množství reportérového štěpu. Pokud bych měla vybrat nejvhodnější metodu pro kvantifikaci bakteriálních membránových proteinů, použila bych z výše uvedených důvodů metodu itraq. 28

5. Literatura 1. Bouchal P., Kučera I.: Dvourozměrná elektroforéza v proteomice: principy a aplikace. Chem. listy 2003, 97, 29-36. 2. Rabilloud T.: Two-dimensional gel electrophoresis in proteomics: old, old fashioned, but it still climbs up the mountains. Proteomics 2002, 2,3-10. 3. http://bart.chemi.muni.cz/courses/kurs%20proteomiky%202006.pdf 4. http://en.wikipedia.org/wiki/quadrupole_mass_analyzer 5. Češková P., Brožková K., Hernychová L., Štěrba J., Valík D., Vojtěšek B. : Hmotnostní spektrometrie v kvantitativní a diagnostické proteomice: možnosti a limitace. Chem. listy, v tisku. 6. Link A.J., Eng J., Schieltz D.M., Carmack E., Mize G.J. Morris D.R., Garvik B.M., Yates J.R.: Direct analysis of protein complexes using mass spectrometry. Nat. biotechnol. 1999, 17, 676-682. 7. Gevaert K., Goethals M., Martens L., Staes A., Thomas G.R., Vandekerckhove J. : Exploring proteomes and analyzing protein processing by mass soectrometric identification of sorted N-terminal peptides. Nat. biotechnol. 2003, 21, 566-569. 8. Gygi S.P., Rist B., Gerber S.A., Turecek F., Gelb M.H., Aebersold R. : Quantitative analysis of komplex protein mixtures using isotope-coded affinity tags. Nat. biotechnol. 1999, 17, 994-999. 9. Ong S., Blagoev B., Kratchmarova I., Kristensen D.B., Steen h., Pandey A., Mann M. : Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics. Mol. Cell. Proteomics, 1, 376-386. 10. Ross P.L., Huang Y.N., Marchese J.N., Williamson B., Parker K., Hattan S., Khainovski N., Pillai S., Dey S., Daniels S., Purkyastha S., Juhasz P., Martin S., Bartel-Jones M., He F., Jacobson A., Pappin D.J. : Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Mol. Cel. Proteomics 2004, 3, 1154-1169, 11. Bouchal P., Přecechtělová P., Zdráhal Z., Kučera I.: Protein composition of Paracoccus denitrificans cells grown on various electron acceptors and in the presence of azide. Proteomics 2004, 4, 2662-2671 29

6. Seznam zkratek 2-DE two-dimensional electrophoresis dvourozměrná elektroforéza COFRADIC combined fractional diagonal chromatography kombinovaná frakční diagonální chromatografie DNA deoxyribonucleic acid deoxyribonukleová kyselina ESI electrospray ionization ionizace elektrosprejem ICAT isotope-coded afinity tags - izotopově kodované afinitní značky IEF isoelectric focusing isoelektrická fokusace IMAC immobilized metal affinity capture - povrch s vazbou přes zakotvený kov IPG immobilised ph gradient imobilizovaný ph gradient itraq isobaric tags for relative and absolute quantitation isobarické značky pro relativní a absolutní kvantifikaci LC liquid chromatography kapalinová chromatografie MALDI matrix-assisted laser desorption/ionization laserová desorpce/ionizace za přítomnosti matrice MS mass spectrometry hmotnostní spektrometrie MudPIT multidimensional protein identification technology několikarozměrná proteinová identifikační technologie pi isoelectric point isoelektrický bod PFS peptide fragment sequencing sekvenování peptidových fragmentů PMF peptide mass fingerpriting český název se dosud nevžil RP reverse-phase reverzní fáze SDS-PAGE sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropforesis polyakrylamidová gelová elektroforéza v přítomnosti dodecylsulfátu sodného SELDI surface enhanced laser desorption/ionization - laserová desorpce/ionizace s vylepšeným povrchem SILAC stable isotope labeling by amino acids in cell culture stabilními izotopy značené aminokyseliny v buněčné kultuře. SCX strong cation exchange chromatografie na katexu 30

TOF TNBS TNP time-of-flight doba letu 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid - 2,4,6-trinitrobenzensulfonová kyselina trinitrophenyl-peptides - trinitrophenyl- peptidů 31