Návrh laboratorní směrnice pro konvenční cytogenetickou analýzu karyotypu buněk kostní dřeně a/nebo periferní krve Kyra Michalová, Zuzana Zemanová Centrum nádorové cytogenetiky, Ústav klinické biochemie a laboratorní diagnostiky VFN a 1.LF UK Praha 1. Úvod Tato metodika platí pro kultivaci a zpracování buněk kostní dřeně a periferní krve a je závazná pro pracovníky cytogenetických laboratoří při přípravě cytogenetických preparátů a konvenční cytogenetické analýze karyotypu. 2.Indikace k cytogenetickému vyšetření Cytogenetické vyšetření indikuje lékař se specializací v lékařské genetice případně u vybraných diagnóz indikaci provádí hematolog, onkolog, internista nebo jiný specialista. Postup vyšetření probíhá podle uvedeného schématu (viz. Obrázek č. 1). 3. Princip metody Zpracování buněk kostní dřeně a/nebo periferní krve (přímo nebo po kultivaci), příprava cytogenetických preparátů, diferenciační barvení chromosomů a analýza karyotypu v cca 10-20 mitosách přímo ve světelném mikroskopu a za použití počítačové analýzy obrazu (Obrázek č. 2 Algoritmus cytogenetického vyšetření). 4. Materiál k vyšetření Chromosomové preparáty je možné připravovat z nejrůznějších tkání po určité době kultivace za sterilních podmínek v příslušném kultivačním médiu. Nejčastěji se vyšetřuje karyotyp z periferní krve tj. lymfocytů stimulovaných k dělení fytohemaglutininem (PHA). U pacientů s podezřením na onkohematologické onemocnění se vyšetřují buňky kostní dřeně odebrané sternální punkcí nebo trepanobiopsií. Buňky kostní dřeně se kultivují bez stimulace. 5. Odběr vzorku Odběr vzorku pro konvenční cytogenetickou analýzu provádí příslušné klinické oddělení do předepsaných odběrových zkumavek a vzorky neprodleně odesílá do cytogenetické laboratoře, která provede následnou analýzu. 5.1. Odběr kostní dřeně Vzorky kostní dřeně pro cytogenetické vyšetření musí být odebírány pouze do předem připravených odběrových zkumavek! Odběrové zkumavky jsou připravovány v příslušné cytogenetické laboratoři a jsou distribuovány na jednotlivá pracoviště, která provádějí odběry. Musí vždy obsahovat heparin, aby se periferní krev nebo její příměs ve vzorku kostní dřeně nesrážela.
Nejméně 0,5 1 ml kostní dřeně odebrat sterilně do předem připravené a označené zkumavky s PBS nebo kultivačním médiem (bez přídavku séra) a s heparinem. Zkumavku s roztokem lze získat v příslušné cytogenetické laboratoři a je nutné ji skladovat v lednici při 4 0 C. Expirace zkumavek s PBS a heparinem je 6 měsíců od data přípravy, expirace odběrového media je kratší maximálně 7 dnů. Po odběru je nutné ihned převést odpovídající množství kostní dřeně do odběrové zkumavky opatřené štítkem se jménem a dalšími údaji pacienta, zkumavku uzavřít a důkladně protřepat, aby nedošlo ke sražení vzorku. Odebraný vzorek s vyplněnou žádankou se všemi požadovanými údaji odeslat v co nejkratší době do příslušné laboratoře, která provede cytogenetickou analýzu. Vzorek v žádném případě nemrazit! Při prodlení s odesláním uchovat vzorek v lednici nebo při pokojové teplotě. 5.2. Odběr periferní krve Do zkumavky Vacuette (zelený uzávěr) nebo jiný vyzkoušený výrobce s heparinem sterilně odebrat 5 ml periferní krve, důkladně protřepat. Zkumavku opatřit štítkem pacienta a s vyplněnou žádankou se všemi požadovanými údaji odeslat ihned do cytogenetické laboratoře. Vzorek v žádném případě nemrazit! Při prodlení s odesláním uchovat vzorek v lednici. 6. Příjem vzorků Vzorky do laboratoře přináší sanitární služba nebo jsou doručovány potrubní poštou. Vzorky přijímá pověřený pracovník laboratoře, který je povinen zkontrolovat, zda je vzorek v předepsaných a neporušených odběrových zkumavkách a zda má žádanka o vyšetření všechny náležitosti. 7. Označení vzorků Každý vzorek je po přijetí opatřen identifikačním kódem příslušné cytogenetické laboratoře a pod přiděleným kódem je zaevidován do záznamové knihy či databáze vyšetřených pacientů. V záznamové knize či v databázi musí být u každého identifikačního kódu uvedeno datum vyšetření vzorku, jméno a rodné číslo pacienta, diagnóza, číslo zdravotní pojišťovny, jméno a pracoviště odesílajícího lékaře a dále údaje o provedeném vyšetření (použitá metoda, identifikace pracovníka, který vyšetření provedl atd.), případně další poznámky např. o kvalitě vzorku, předchozích vyšetřeních apod. Po ukončení vyšetření je do záznamové knihy doplněn výsledek a datum odeslání Zprávy o výsledku. 8. Manipulace se vzorky Vzorky kostní dřeně jsou zpracovány v den příjmu. Před samotným zpracováním jsou uchovávány při pokojové teplotě. Vzorky periferní krve jsou buď zpracovány v den příjmu, nebo během následujících dnů (maximálně 2-3 dny). Před zpracováním jsou uchovávány v lednici při teplotě 4±1 C.
9. Uchování vzorků Vzorky pro cytogenetickou analýzu nemohou být dlouhodobě skladovány, protože buňky ztrácejí růstový potenciál. Při dostatečném množství materiálu je po zpracování buněk archivována část fixované buněčné suspenze. Mikrozkumavky s fixovanou buněčnou suspenzí označené identifikačním číslem jsou skladovány v mrazících boxech při teplotě -20±1 C. 10. Pracovní postupy a protokoly 10.1. Příprava zkumavek pro odběr kostní dřeně Sterilní PS zkumavka s uzávěrem (15 ccm): 5ml ± 0,1 sterilního fosfátového pufru (PBS) nebo růstového média bez séra 5 kapek heparinu (Heparinum natricium, Léčiva) Uchovávat v chladničce. 10. 2. Příprava média pro kultivaci buněk Sterilní kultivační lahvičky NUNC-FALCON (50 ml): 9 ml ± 0,1 média RPMI-1640 (Sigma nebo jiný výrobce) s L-glutaminem (3% roztok, 1 ml/100 ml média) a antibiotiky PNC, STM 1 ml ± 0,1 fetálního telecího séra (Sigma nebo jiný výrobce) Uchovávat v mrazničce. 10.3. Nasazení a kultivace buněk periferní krve 0,5-1 ml sterilně odebrané plné krve z odběrové zkumavky převést do připravené kultivační lahvičky s médiem přidat 4-5 kapek PHA (Wellcome nebo jiný výrobce) buněčnou kulturu kultivovat 72 h v termostatu při 37 C 10. 4. Nasazení a kultivace buněk kostní dřeně obsah odběrové zkumavky s cca 0,5-1 ml sterilně odebrané kostní dřeně centrifugovat 10 min při 1800 RPM odsát supernatant, buňky převést do připravené kultivační lahvičky s médiem buněčnou kulturu kultivovat 24h v termostatu při 37 C, nebo přímo zpracovávat 10. 5. Příprava preparátů pro cytogenetické vyšetření Po kultivaci přidat k buněčné kultuře kolcemid (CIBA, koncentrace 0,276 μg/ml média), kultivovat cca 1 h při 37 C Centrifugovat 5 min při 2000 RPM a pokojové teplotě Odsát supernatant, sediment resuspendovat v hypotonickém roztoku (0,075 M KCl 5-10 ml) Inkubovat 20 min v termostatu při 37 C Centrifugovat 5 min při 2000 RPM a pokojové teplotě Odsát supernatant, k sedimentu přidávat po kapkách za stálého třepání čerstvě připravený fixační roztok (ledová kyselina octová a methanol v poměru 1:3) Centrifugovat 5 min při 2000 RPM a pokojové teplotě Přidání fixačního roztoku s následnou centrifugací opakovat cca 4x
Po poslední fixaci nechat buněčnou suspenzi ve fixačním roztoku v lednici při 4-7 C do druhého dne Centrifugovat 5 min při 2000 RPM a pokojové teplotě Odsát supernatant, sediment resuspendovat ve fixačním roztoku (množství fixačního roztoku závisí na hustotě buněčné suspenze) Pasteurovou pipetou kapat 1-3 kapky buněčné suspenze na podložní sklo, suspenzi nechat zaschnout na vzduchu nebo na histologické plotýnce při teplotě 37 C, kvalitu a hustotu preparátu zhodnotit v mikroskopu, případně upravit ředění Preparáty uchovávat v krabicích na mikroskopická skla při pokojové teplotě Zbylou buněčnou suspenzi uchovávat v mrazničce při -18 až -20 C 10. 6. Barvení cytogenetických preparátů 10. 6.1. Barvení Giemsovým barvivem Do skleněné kyvety (kapacita 10 skel) připravit 3% roztok Giemsy (Merck) v Sörensenově fosfátovém pufru, ph 6,8 ± 0,1 Vložit preparáty, inkubovat 10 min při pokojové teplotě Opláchnout pod tekoucí vodou Kvalitu barvení zkontrolovat v mikroskopu, v případě potřeby preparáty dobarvit ve stejném roztoku nebo naopak odbarvit v metanolu a opakovat celý postup barvení s kratším časem. 10. 6. 2. Barvení dle Wrighta barvit alespoň týden staré preparáty, vysychání preparátů pro statimová vyšetření lze urychlit jejich umístěním na histologickou plotýnku cca 1 h, 95± 0,1 C Příprava Wrightova barviva: 2,5±0,1 g Wrightova barviva rozpustit v 1 000±0,1 ml metanolu (p.a.). Na magnetické míchačce míchat 5-7 hodin. Filtrovat přes dvojitý filtr, objem rozdělit na menší podíly do tmavých lahví a nechat inkubovat 5 dní při 37 C v termostatu. Dále skladovat v lednici při 4 7 C Příprava pufru: roztok A: 10,68 g Na 2 HPO 4. 2H 2 0 do 1000±0,1 ml redestilované vody roztok B: 8,10 g KH 2 PO 4 do 1000 ±0,1 ml redestilované vody smíchat 49±0,1 ml roztoku A a 51±0,1 ml roztoku B (ph=6,8±0,1) Postup při barvení: Preparáty vložit do 0,2 N HCl po dobu 5 min při pokojové teplotě Preparáty vložit do 2xSSC, 60±0,1 C, 20 min Smíchat 3±0,1 ml pufru a 1±0,1 ml Wrightova barviva a přelít chromosomový preparát umístěný v horizontální poloze, nechat působit 3-5 min Délku barvení je nutné určit pro každou sérii preparátů individuálně, záleží na stáří preparátů Po obarvení opláchnout pod tekoucí vodou, usušit na vzduchu Kvalitu obarvení chromosomů zkontrolovat ve světelném mikroskopu. Při nedostatečném nabarvení lze ihned pokračovat přidáním nové směsi pufru a
Wrightova barviva, při přebarvení lze preparáty odbarvit v methanolu a po usušení opakovat celé barvení s kratším časem. 10. 6. 3. Barvení C pruhů Preparáty vložit do 0,2 N HCl na 45 min při pokojové teplotě Opláchnout v destilované vodě Vložit do 5% roztoku Ba(OH) 2, 37 C na 1,5-2 min 5x opláchnout v destilované vodě ponořit do 2xSSC, inkubovat 1 hod při 60±0,1 C preparáty vložit do 3% roztoku Giemsova barviva, inkubovat 40 min při pokojové teplotě opláchnout pod tekoucí vodou, nechat oschnout na vzduchu při pokojové teplotě Další barvicí techniky viz. Metody analýzy chromozómů (1988). 11. CYTOGENETICKÁ ANALÝZA Pro cytogenetickou analýzu jsou nejvhodnější dělící se buňky ve stádiu metafáze s dobře rozloženými chromosomy. ve světelném mikroskopu při použití 10x zvětšujícího objektivu vyhledat vhodnou mitosu za použití 100x zvětšujícího imerzního objektivu spočítat chromosomy, vyhledat jednotlivé homologní páry, porovnat jejich velikost a umístění pruhů případné odchylky v počtu nebo struktuře chromosomů popsat dle mezinárodní ISCN nomenklatury takto vyhodnotit a popsat alespoň 10-22 mitos u každého pacienta (pokud je dostatečné množství hodnotitelných mitos na preparátu) u alespoň 4 mitos sestavit karyotyp podle ISCN nomenklatury pomocí počítačové analýzy obrazu a uložit na pevný či optický disk (viz. Obrázek č. 3 Karyotyp zdravého muže, chromosomy obarveny Wrightovým barvivem). pro dokumentaci vytisknout karyotypy a založit spolu s kopií výsledku do desek příslušného pacienta, originál výsledku odeslat ošetřujícímu lékaři. Všechny výsledky ukládat a archivovat v databázi pacientů. 12. Bezpečnostní opatření Při přípravě a zpracování buněčných kultur a zhotovování cytogenetických preparátů je nutné dodržovat bezpečnostní opatření vyplývající z provozního řádu příslušné laboratoře. 13. Validace Metodu cytogenetické analýzy karyotypu buněk kostní dřeně a/nebo periferní krve provádějí atestované laborantky nebo vysokoškoláci, nálezy jsou popisovány podle mezinárodní ISCN nomenklatury. V pravidelných intervalech jsou veškeré nálezy posuzovány a schvalovány vedoucím laboratoře nebo jeho zástupcem.
14. Interpretace výsledků Interpretaci výsledků provádí vedoucí laboratoře nebo jeho zástupce a zprávu o výsledku poskytuje ošetřujícímu lékaři s případným komentářem. 15. Vydávání výsledků Písemné zprávy o výsledku vydává po podpisu vedoucí laboratoře nebo jeho zástupce. Při vyšetření Statim je možné vydat výsledek telefonicky pouze ošetřujícímu lékaři. 16. Kontrola kvality V pravidelných intervalech (1x ročně) probíhá mezilaboratorní porovnání kvality cytogenetické analýzy mezi akreditovanými cytogenetickými laboratořemi. Kontrolu kvality práce v cytogenetických laboratoří na mezinárodní úrovni připravuje v pravidelných ročních intervalech společnost EUROGENTEST, což je společná organizace EU, která se zabývá testováním kvality práce na genetických pracovištích (CEQA, www.eurogentest.org). Vnitřní kontrola kvality v cytogenetické laboratoři je zavedena průběžně, pravidelně se testuje růstové médium, sérum a další chemikálie používané při kultivaci buněk. Pravidelně se vyhodnocuje kvalita získaných mitos podle diagnóz pacientů. 17. Reference 1. Metody analýzy chromozómů. Metodický sborník k XX. výročnímu zasedání. Cytogenetická sekce československé biologické společnosti při ČSAV v Brně, 1988. 2. ISCN (2005): An International System For Human Cytogenetic Nomenclature. Shaffer L.G., Tommerup N. (eds); S. Karger, Basel, 2005.
Obrázek č. 1: Postup při vyšetření klinický specialista genetik genetická poradna internista, endokrinolog, sexuolog hematolog, onkolog, atd. indikace k cytogenetickému vyšetření odběr vzorku kultivace a zpracování buněk cytogenetická laboratoř normální nález analýza karyoptypu patologický nález molekulárněcytogenetická analýza
Obrázek č. 2: Algoritmus cytogenetického vyšetření
Obrázek č. 3: Karyotyp zdravého muže, chromosomy obarveny Wrightovým barvivem 46,XY