PCR v diagnostice Lymeské boreliózy Plíšková L. Ústav klinické biochemie a diagnostiky LF a FN Hradec Králové
obtížná Diagnostika lymeské boreliózy klinický obraz velmi rozmanitý anamnestické údaje (přisátí klíštěte ~ 60 %) laboratorní l b í - nejednoznačnost laboratorních nálezů ů elektronová mikroskopie, průkaz Ab (ELISA), western blot, imunofluorescenční analýza, PCR, CSF - vyšetření leukocytů (pleocytóza, zejm. mononukleáry), celkové bílkoviny (, někdy gamaglobuliny) někdy norm. nález
Molekulárně biologické metody (PCR) výhody rychlost, citlivost, specifita, možnost vyšetření v jakémkoliv materiálu úskalí úklí preanalytická fáze výběr pacientů, materiálů a jejich načasování, podmínky transportu apod. příprava vzorků, izolace, uchování DNA výběr primerů, validace metody kontrola kvality y( (VKK, EHK)
Preanalytická fáze výběr pacientů dif. dg. akutní LB - genom. DNA ve vyšších konc. chronická LB stopová množství genom. DNA (doplnit o detekci plazmidové DNA) záchytnost y??? výběr materiálů, načasování odběru materiály krev, likvor, moč, synoviální tekutina, tkáň, vzorky kůže z EM apod. X klíště volba materiálu dle příznaků, stádia a doby onem. transport v chladu (nemrazit!!!) vysoká teplota snižuje procento pozitivity, hemolytické materiály inhibicí
Materiály krev k nízká senzitivita boreliémie pouze krátkodobá, přechodná, pouze v období diseminovaného onem. (EM, neuroborelióza, karditidy) plazma (10) X sérum (20) X plná krev (100 spirochet/ml) - Mouritsen et al., Am.J.Clin.Pathol., 1996 CSF neuroborelióza nepřímá závislost na délce trvání onem. do 2 týdnů PCR pozit. u 50 % X více než 2 týdny pouze u 13 % - Lebech et al., Mol. Diagn., 2000 možnost adheze ke tkáním nízká senzitivita v pozdních stádiích, význam PCR pouze v časných stádiích
močč Materiály nižší senzitivita, nereprodukovatelnost neodebírat 1. proud ranní moče centrifugace při 36 000 g (při 14 000 g všechny moče negat.) Bergmann et al., J. Clin. Microbiol., 2002 synoviální tekutina artritida vyšší procento pozitivit závislost na antibiotické terapii po léčbě negat. PCR v synoviální tekutině, ale možnost detekce BB v synoviální membráně Priem et al., Ann. Rheum. Dis., 1998
Materiály kůže kožní manifestace vysoká senzitivita léze EM - 36 až 88 % pac. s chron. atrofickou akrodermatitidou 54 až 100 % uchování v transportním, t kultivačním č médiu po 24 hod. migrace spirochét do média izolace DNA z kůže, ale i z média klíště výpovědní hodnota??? pozitivní nález nemusí znamenat nákazu (doba přisátí klíštěte odstranění do 24 hod. riziko rozvoje LB velmi nízké) význam pro epidemiologické a jiné vědecké studie
Izolace co nejdříve (zamrazit max. 3 měsíce) porovnání 3 izolací Exner et al., Diagn. Microbiol. Infect. Dis., 2003 fenol-chloroformová extrakce, QIAamp DNA kity (OIAGEN), automatická izolace na přístroji MagNA Pure (mg. partikule) stejná citlivost u vzorků krve, CSF, synov. tekutiny X moč horší citlivost u QIAamp DNA kitu ÚKBD porovnání 2 izolací QIAamp DNA Mini Kit, MagNA Pure LC DNA Isolation Kit III srovnatelná citlivost CSF, plazma, moč, synoviální tekutina atd. centrifugace max. otáčky sediment uchování DNA 2 až 8 C ( teplota - citlivost)
Výběr primerů neobvyklý genom BB lineární chromozom + různý počet lineárních a cirkulárních plazmidů (BB je mohou ztrácet ) škála Ag specifit výběr primerů (schopnost detekce DNA BB) G - transport a metabolizmus sacharidů J - translace, ribosomální struktura a biogeneze L - DNA replikace, rekombinace a oprava M biogeneze buněčného obalu, vnější membrány R hlavní funkce je pouze předpokládána U neznámá funkce
- Borrelia burgdorferi B31 NC_001318, lineární dsdna, délka 910 724 bp, 874 genů, 21 plazmidů (9 lineárních a 12 cirkulárních) - Borrelia afzelii PKo NC_008277, lineární dsdna, délka 905 394 bp, 894 genů, 8 plazmidů (6 lineárních a 2 cirkulárních) - Borrelia garinii Pbi NC_006156, lineární dsdna, délka 904 246 bp, 904 genů, 2 plazmidy (1 lineární a 1 cirkulární)
Výběr primerů 1. PCR 1989 (chromozomální gen) publikováno o mnoho sekvencí primerů rů z různých genů -chromozomální m oblast 5S/23S rrna, reca, flagellin - plazmidová oblast OspC, OspA komerční kity nejčastěji flagelin. gen (FlaB) př. QIAGEN, GeneProof, Dynex
Vývoj metody nested PCR Flagelinový gen rdna gen
Vývoj metody rt PCR Flagelinový gen HLA DQ QuantiFast + IC
Porovnání různých metod
Validace metody Detekce DNA BB a IC v jedné zkumavce - flagelinový gen, QuantiFast Pathogen + IC Specifita B.garinii, B. afzelii, B. burgdorferi s.s., B.valaisiana Mez detekce 1 2 org. BB/ml, resp. 0,39 pg BB/ml Opakovatelnost CV = 1,35 % Mezilehlá přesnost CV = 1,35 % Kontrola kvality VKK, EHK
chybovost 1 řádu Kontrola kvality - VKK počet procenta 1 řád 65 90,3 mimo 1 řád 7 9,7 celkem 72 Pozitivní, negativní, inhibiční kontrola chybovost 1/2 řádu počet procenta 1/2 řádu 46 63,9 mimo 1/2 řádu 26 36,1 celkem 72
EHK - INSTAND e. V. Kontrola kvality mezilaboratorní porovnání (reprodukovatelnost) r. 2008 2010 100 lab. ověření metody (validace)
Soubor pacientů vyšetřených metodou rtpcr na přítomnost DNA Borrela burgdorferi sensu lato rok krev likvor punktát celkem 2008 403/0 986/8 39/0 1428/8 2009 240/0 852/9 56/2 1148/11 2010 205/0 823/7 36/1 1064/8 celkem 848/0 2661/24 131/3 3640/27
Závěr PCR není v dg. LB 100% negativní výsledky nevylučují onemocnění X pozitivní výsledky onemocnění potvrzují nutnost výběru pacientů, resp. načasování odběru, výběr biologického materiálu, dodržení preanalytické fáze v laboratoři udělat maximum (validní výsledky) klinická korelace PCR je neuspokojivá
Děkuji za pozornost.