substráty, ty, koenzymy, enzym,

Enzymová stanovení kompletní konverze analytu na měřm ěřitelné produkty (barevné,, fluoreskující, ) - "end- point" " stanovení kinetická stanovení - rychlost enzymové reakce limituje analyt (funguje např.. jako substrát), t), ostatní komponenty reakční směsi si jsou v nadbytku (další substráty, ty, koenzymy, enzym, ) recyklační stanovení - účastní se dva komplementárn rní enzymy (např.. laktát dehydrogenasa a laktát t oxidasa) katalytická stanovení Následné reakce často nestačí pouze jedna (primárn rní,, měřm ěřená) ) reakce, ale je nutné zařadit adit následnn sledné indikační kroky (sekvence reakcí): E prim A B C X E ind t~0: [B] << K mb, v ind = V ind.[b]/k B - m reakce 1. řádu t>0: k[e prim ] = V ind v ind ind = V ind [B]/(K mb + [B]) = V ind /(K mb /[B] + 1) [B] 100K mb chyba kolem 1% Y je třeba 10 až 100-násobný nadbytek E ind vůči E prim 1

Klinická (potravinářsk ská, )) stanovení C- C CH 2 CH 2 C- 2-oxoglutarát C- HC NH glutamátdehydrogenasa 2 + NADH + NH + 4 CH 2 + NAD + + H 2 amoniak L-glutamát fosfoenolpyruvát fosfoenolpyruvát karboxylasa + C 2 + H - C 2 CH 2 C- C- C~ P CH 2 C- Cmalátdehydrogenasa C HC H CH 2 C- + NADH + H + CH 2 Coxalacetát L-malát + NAD + rg. kyseliny kys. mléčná laktátdehydrogenasa L-laktát + NAD + pyruvát + NADH + H + pyruvát + L-glutamát alaninaminotransferasa L-alanin + 2-oxoglutarát puruvát + NADH + H + L-laktátdehydrogenasa L-laktát + NAD + kys. pyrohroznová 2-oxoglutarát + NADH + NH 4 + glutamátdehydrogenasa kys. oxoglutarová L-glutamát + NAD + + H 2 kys. glutamová glutamátdehydrogenasa L-glutamát + NAD + + H 2 2-oxoglutarát + NADH + NH + 4 NADH + jodonitrotetrazolium.cl + H + diaforasa NAD + + formazan 2

kys. citronová pyruvát + C 2 citrát citrátlyasa oxalacetát + acetát malátdehydrogenasa oxalacetát + NADH + H + L-malát + NAD + L-laktátdehydrogenasa pyruvát + NADH + H + L-laktát + NAD + malátdehydrogenasa L-malát + NAD + oxalacetát + NADH + H+ kys. jablečná oxalacetát + L-glutamát aspartátaminotransferasa L-aspartát + 2-oxoglutarát - C CH C - + H 2 CH fumarasa L-malát kys. fumarová oxalát oxalátdekarboxylasa formiát + C 2 kys. šťavelová formiát + NAD + + H 2 formiátdehydrogenasa HC 3 2- + NADH + H + kys. mravenčí 3

Ethanol, acetaldehyd, kys. octová alkoholdehydrogenasa ethanol + NAD + acetaldehyd + NADH + H + aldehyddehydrogenasa acetaldehyd + NAD + + H 2 kys. octová + NADH + H + acetát + ATP + CoA acetát:coa-ligasa (tv. ADP) acetyl-coa + ADP + Pi acetyl-coa + oxalacetát + H 2 citrátsynthasa H CH 2 C - C - + CoA CH 2 malátdehydrogenasa malát + NAD + oxalacetát + NADH + H + C - citrát Monosacharidy β-d-glukosa + H 2 + 2 glukosaoxidasa glukonolakton + H 2 2 C H 2 H + ATP hexokinasa C H 2 -P + ADP glukosa β-d-glukosa β-d-glukosa-6-fosfát β-d-glukosa-6-fosfát + NADP + G6PDH C H 2 -P + NADPH + H + β-d-fruktosa + ATP glukonolakton-6-fosfát hexokinasa β-d-fruktosa-6-fosfát + ADP fruktosa β-d-fruktosa-6-fosfát fosfoglukoisomerasa β-d-glukosa-6-fosfát 4

Glycerol, tuky, mastné kyseliny H 2 C HC C H 2 H H H + ATP glycerolkinasa L-glycerol-3-fosfát + ADP ADP + fosfoenolpyruvát pyruvátkinasa pyruvát + ATP pyruvát + NADH + H + L-laktátdehydrogenasa L-laktát + NAD + triacylglycerol + 3 H 2 lipasa, esterasa glycerol + 3 mastné kyseliny mastná kys. + CoA + ATP MK:CoA-ligasa (tv. AMP) AMP + acyl-coa + P-P acyl-coa + 2 acyl-coa-oxidasa enoyl-coa + H 2 2 Cholesterol H cholesteroloxidasa cholesterol + 2 4-cholestenon + H 2 2 5

AMP, ADP, ATP AMP + ATP myokinasa 2ADP AMP, ADP ADP + fosfoenolpyruvát pyruvátkinasa ATP + pyruvát pyruvát + NADH + H + L-laktátdehydrogenasa L-laktát + NAD + ATP 3-fosfoglycerát + ATP 3-fosfoglycerátkinasa 3-fosfoglyceroylfosfát + ADP 3-fosfoglyceroylfosfát + NADH + H + glyceraldehyd-3-fosfát triosafosfátisomerasa glyceraldehyd-3-fosfát DH dihydroxyaceton-3-fosfát glyceraldehyd-3-fosfát + NAD + + P i dihydroxyaceton-3-fosfát + NADH + H + 3-fosfoglycerát DH 3-fosfoglycerát + NAD + Enzymové biosensory biosensor je analytický přístroj obsahující citlivý prvek biologického původu, který je buď součástí nebo v těsném kontaktu s fyzikálně-chemickým převodníkem. Poskytuje průběžný elektronický signál, který je přímo úměrný koncentraci jedné nebo několika (skupiny) chemických látek ve vzorku. převodník (transducer) elektronická jednotka výstupní signál biorekogniční vrstva analyt = látka, která se stanovuje 6

Potenciometrické bioelektrody A - A - A - A - základem potenciometrie je změna potenciálu vyvolaná akumulací náboje na rozhraní elektrody s roztokem K + K + převodníkem je iontově selektivní elektroda (ISE) v kombinaci s enzymovou vrstvou měří se potenciál l pracovní elektrody proti referentní elektrodě,, přitom p v systému neteče e proud Potenciometrické enzymové elektrody potenciál l ISE pro sledovaný iont (aktivita a i ) v přítomnosti p rušiv ivého iontu (aktivita a j ) E = E 0 + RT zf ln( a + k a i ij z / y j skleněná elektroda - H + - měření ph, běžb ěžně dostupná pevné ISE - tenká vrstva iontového vodiče monokrystal nebo směs s krystalů precipitát homogenní nebo heterogenní (mnohonásobn sobně levnější ší,, vlastní materiál dispergován n v inertní matrici (PVC, silikon,...) ) 7

Příklady ph : penicilin (penicilin( penicilinasa), acetylcholin (cholinesterasa), esteras asy, nukleové kyseliny (nukle( nukleasy) NH 3 / NH 4+ : močovina ovina (ureas asa), a), aminokyseliny (oxidační deaminace - glutamát DH, oxidas asa L- / D-aminokyselin; α,γ- eliminace amoniaku L-methionin γ-lyáza) C 2 : močovina ovina (ureas asa), a), aminokyseliny (lysin dekarboxylas asa, tyrosin dekarboxylas asa), laktát t (laktát monooxygenas asa - dekarboxylující oxidas asa) a) CN - : amygdalin (β-glukosidasa) Měření kyslíku ku a H 2 2 Clarkův amperometrický sensor Au (Pt) elektroda absolutní specifita pouze ke zatavená ve skle kyslíku ku - rušiv ivé látky nemohou projít t předp edřazenou membránou Ag/AgCl elektroda elektroda pro stanovení peroxidu elektrolyt vodíku je podobná kyslíkov kové s tím rozdílem, že e není použita membrána plynopropustná membána a propustná pro 2 používá se pozitivní polarizace - anodická oxidace e peroxidu Elektrodová redukce kyslíku ku (-750( mv) je čtyřelektronový proces: 2 + 2 H 2 + 2 e - H 2 2 + 2 e - 2 H - Elektrodová oxidace peroxidu vodíku (>( 600 mv): m H 2 2 + 2 H - 2 H 2 2 2 H 2 + 2 + 2 e - + 2 H + 8

Kyslíkov ková elektroda Enzymové elektrody s oxidasami tyto enzymy oxidují molekulu substrátu tu (analytu( analytu) ) za účasti kyslíku, ku, přitom vzniká buď peroxid vodíku nebo voda: substrát t + 2 produkt + H 2 2 substrát t + 2 produkt + H 2 detekce peroxidu je obecně citlivější (nulová výchozí hladina) Proud 0 2 analyt H 2 2 č as Rozsahy detektoru oxidace peroxidu vodíku je spojená s nebezpečím m interference ze strany jiných oxidabilních látek, l např.. v séru s mohou vadit kyseliny askorbová a močov ová či paracetamol specifita se dád zlepšit předp edřazením kontrolní membrány, která omezí přístup interferujících ch látekl 9

Přehled oxidas Substrát oxidasy Zkratka EC číslo koenzym H 2 2 Alkohol AD 1.1.3.13 FAD ano L-Aminokyseliny 1.4.3.2 FAD ano D-Aminokyseliny 1.4.3.3 FAD ano Askorbát 1.10.3.3 Cu ne Bilirubin BR 1.3.3.5 ne Diaminy DA 1.4.3.6 Cu ano Fenol (Tyrosinasa) 1.14.18.1 Cu ne Galaktosa 1.1.3.9 Cu ano Glukosa GD 1.1.3.4 FAD ano L-Glutamát 1.4.3.11 FAD ano Cholin 1.1.3.17 FAD ano Cholesterol CD 1.1.3.6 FAD ano p-difenoly (Lakasa) 1.10.3.2 Cu ne L-Laktát LD 1.1.3.2 FAD ano L-Laktát (dekarb.) LM 1.13.12.4 FMN ne L-Lyzin 1.4.3.14 ano Monoaminy MA 1.4.3.4 FAD ano NADH ano xalát 1.2.3.4 Fp ano Pyruvát 1.2.3.3 FAD ano Sulfit 1.8.3.1 Mo ano Urát(Urikasa) 1.7.3.3 Cu ano Xanthin XD 1.1.3.22 Mo ano Enzymové elektrody s dehydrogenasami největší skupinou oxidoreduktas jsou dehydrogenasy (250 NAD + a 150 NADP + dependentních enzymů) substrát + NAD(P) + + 2 e - + H + produkt + NAD(P)H bioanalyticky významné druhy jsou shrnuty v tabulce: Přehled dehydrogenas Substrát Zkratka EC číslo Alkohol ADH 1.1.1.1 3-Hydroxybutyrát 3-HBDH 1.1.1.30 Aldehyd AlDH 1.2.1.5 3-Hydroxysteroid 3-HSDH 1.1.1.50 Alanin Ala-DH 1.4.1.1 Isocitrát ICDH 1.1.1.42 Formiát FDH 1.2.1.2 Inositol IDH 1.1.1.18 Galaktosa Gal-DH 1.1.1.48 L-Laktát L-LDH 1.1.1.27 Glycerol Gly-DH 1.1.1.6 D-Laktát D-LDH 1.1.1.28 Glukosa GDH 1.1.1.47 L-Leucin L-LeDH 1.4.1.9 Glukosa-6-fosfát G6P-DH 1.1.1.49 L-Malát L-MDH 1.1.1.37 Glutamát GlDH 1.4.1.3 Sorbitol SDH 1.1.1.14 10

Detekce NAD(P)H elektrochemick N PMS Fenazin methosulfát N + CH CH 3 S 3 3 R: methyl Meldola Blue N H 2 N N + R 2 R: ethyl Nile Blue H 3 C N XHN S N + Me 2 X: H Toluidine Blue X: naphthoyl Naphthoyltoluidine Blue M ox + NADH CT M red + NAD + M red M ox + 2 e - + n + CT elektrochemická detekce NADH je možná amperometrickou reoxidací vznikajícího NADH (E -560 mv/sce); přímá oxidace vyžaduje vysoký potenciál l (přes 1 V na uhlíku), nastává dimerizace a adsorpce produktů na povrch elektrody reoxidace se můžm ůže e provést st lépe l prostřednictv ednictvím m modifikujících ch látek l vázaných na povrchu elektrody nejčast astěji se používaj vají fenaziny, fenoxaziny a fenothiaziny,, oxidace nastává již kolem 0 V/SCE lze užít u t také hexakyanoželezitan elezitan nebo TTF.TCNQ průběh h reakce je homogenní - vzniká charge transfer komplex CT, po rozpadu je pak reoxidován mediátor tor,, přitom p E > E lze pracovat při p i nižší ším m potenciálu Přenos elektronů z biomolekul substrát produkt E ox e - E red přímý přenos elektronů pro konstrukci biosensorů je atraktivní - zjednodušil by konstrukci bohužel, byl pozorován u malých redoxních bílkovin (cytochrom( cytochromy c a b, azurin, ferredoxin) ) a některn kterých enzymů (lakas asa, peroxidas asa). přímý reversibilní přenos elektronů z biomolekuly (bílkovina, nukleová kyselina) je obvykle ztížen řadou faktorů v enzymech se sice vyskytuje celá řada redoxně aktivních skupin (disulfidické můstky, Fe-S S skupiny, flaviny, hem, řada iontů kovů), ale nachází se obvykle uvnitř molekuly kontakt redoxní skupiny s povrchem elektrody je možný pouze pro orientované molekuly, což výrazně snižuje odezvy velikost molekuly vede k velmi pomalé difúzi biomolekuly se adsorbují pevně na povrch elektrod a dochází tím současn asně k jejich denaturaci 11

Přenos elektronů z biomolekul substrát produkt E ox E red M red e - M ox Požadavky na mediátor pro usnadnění výměny elektronů mezi enzymy a elektrodou se používaj vají nízkomolekulární redoxní látky mediátory použití mediátor torů urychluje a obvykle vůbec v umožň žňuje výměnu elektronů mezi aktivním m centrem enzymu a elektrodou. reaguje s biokomponentou a elektrodou dostatečně rychlý přenos p elektronů (známa stechiometrie a počet přenášených elektronů) stabilní formy (redukovaná i oxidovaná) ) za podmínek použit ití neúčastn astní se postranních reakcí vhodný redoxní potenciál bez vlivu ph na průběh h redoxní reakce netoxický (např.. pro aplikace in vivo) vhodný k imobilizaci (nerozpustný či i snadno adsorbovatelný) Mediátory Název E (V) tris-(2,2 -bipyridyl)ruthenium(iii) 1.031 tris-(2,2 -bipyridyl)osmium(iii) 0.603 ferrocen-1,1 -dikarboxylová kyselina 0.403 ferrocenylmethyltrimethylamonium 0.388 1,1 -bis(hydroxymethylferrocen] 0.224 ferrokyanid K 4 [Fe(CN) 6 ] 4-0.190 hydroxyethylferrocen 0.161 N,N -dimethyl-p-fenylendiamin 0.139 ferrocenoctová kyselina 0.124 p-benzochinon 0.039 N,N,N,N -tetramethyl-p-fenylendiamin 0.029 2,6-dichlorfenolindofenol (DCIP) -0.016 1,2-naftochinon -0.090 fenazin methosulfát (PMS) -0.161 methylenová modř -0.230 tetramethyl-p-benzochinon (durochinon) -0.191 2-hydroxy-1,4-naftochinon -0.378 fenosafranin -0.493 NC NC Fe ferrocen Fc S S S S tetrathiafulvalen TTF C N C N tetrakyanochinodimethan TCNQ 12

Použit ití mediátor torů přímý přenos p v roztoku v micelách ch v elektrodě kovalentně na elektrodě 3D-polymern polymerní mediátor navázaný na enzym Biosensor pro glukosu Enzymová elektroda na jedno použití Měřící jednotka 13

Konduktometrické biosensory sledování změn n vodivosti - produkce či spotřeba iontů nebo změny velikosti nabitých částic vznik iontů je spojen s účinkem hydrolas (lipidy štěpené lipasou) a amidas,, změna velikosti nabitých částic probíhá u reakcí fosfatas, sulfatas či nukleas klasickým příkladem je reakce ureas asy y při p i stanovení močoviny: oviny: NH 2 CNH 2 + 3 H 2 2 NH 4+ + HC 3- + H - problémem je vlastní vodivost pracovního prostřed edí (použit ití málo vodivých pufrů - organické,, např. imidazol) také změnu vodivosti vyvolanou samotným přídavkem p vzorku je třeba t odlišit, it, je žádoucí zanedbat změny ny vodivosti v celém m roztoku a sledovat především m těsnt sné okolí elektrod s imobilisovanými enzymy (vlastní signál v důsledkud bioreakce) proto se výhodně používá diferenční uspořádání. Konduktometrické převodníky kontakty izolace enzymová referentní vrstva detail elektrod interdigitated array ukázka dvojitého konduktometrického převodníku (sítotiskov totisková technologie, rozměry ry 7 x 25 mm) 14

Enzymové optody Přímé typy - opticky měřm ěřená látka (nejčast astěji fluorofor) ) se přímo p vyskytuje v biokatalytické reakci NADH - poměrn rně slabý fluofor (Φ f = 0.02), extinkční a emisní maxima jsou při p i 350 a 450 nm. Biorekogničním elementem jsou dehydrogenasy imobilisované před koncem optického vlákna. Aby se i koenzym dal zachytit v systému biosensoru,, používá se jeho konjugát s polyethylenglykolem,, který neprochází dialysační membránou. Výhodná je konstrukce sensoru pro alkohol, kde je vzorek oddělen mikroporézn zní teflonovou membránou, NADH se nachází ve vnitřním m roztoku sensoru Existuje řada pokusů využít t fluorescenci flavinových koenzymů (FADH 2, FMNH 2 ) vázaných v pevně v molekule mnoha oxidas.. Při P i vyšší koncentraci substrátu tu se zpomaluje zpětn tná oxidace redukované formy kyslíkem kem a intensita vnitřní (intrinsic)) fluorescence redukovaného koenzymu narůst stá.. Výhodou je reversibilita takového systém Enzymové optody Nepřímé ( mediované, extrinsic) ) optické biosensory využívaji vaji optické indikátory. Nejčast astější jsou optické sensory pro měřm ěření kyslíku ku a ph. sledování kyslíku ku využívá zháš ášení fluorescence indikační molekuly, pokles intensity fluorescence je dán d n Stern-Volmerovým vztahem: I f = I f 0 /(1 + K SV [ 2]) Indikátor se obvykle nachází v silikonové vrstvě před čelem optického vlákna. Nejčast astěji se používá kyselina pyrenmáseln selná (pyrenebutyric acid, PBA), excitace při p i 350 aža 400 nm; další možnosti jsou perylen a dekacyklen,, organokovové komplexy ruthenia lze výhodně excitovat při p 460 nm,, takže e jako zdroj může m e sloužit modrá LED. (CH 2 ) 3 CH PBA ph změny lze sledovat pomocí acidobasických indikátor torů.. Z fluorescenčních ch lze použít t např. 1-hydroxypyren-3,6,8-trisulfonovou kyselinu (HPTS, ph přechod p 5 aža 8) nebo 4-methyl4 methyl- umbelliferon. Absobčních indikátor torů je celá řada, kresolová zeleň a bromthymolová modř. 15