ELISA-VIDITEST anti-borrelia recombinant IgG+VlsE (CSF) OD-335 Návod k použití soupravy VÝROBCE: VIDIA spol.s r.o., Nad Safinou II č. 365, Vestec, 252 42 Jesenice, www.vidia.cz, tel.: +420 261 090 565 1. NÁZEV SOUPRAVY: ELISA-VIDITEST anti-borrelia recombinant IgG + VlsE (CSF) souprava III. generace s vysokou diagnostickou citlivostí a specifitou. enzymoimunoanalytická 2. POUŽITÍ: Souprava je určena pro semikvantitativní a kvantitativní detekci specifických IgG protilátek proti antigenům hlavních patogenních kmenů borelie (B. afzelii, B. garinii a B. burgdorferi sensu stricto) v lidském séru nebo plazmě, mozkomíšním moku a synoviální tekutině, a pro stanovení intrathekální syntézy. Je jedním z nástrojů uplatňujících se při diagnostice lymeské boreliózy (LB). Diagnostika LB je založena na kombinaci klinického a laboratorního vyšetření. Protilátky IgG se tvoří od 6. týdne po infekci. Ve II. fázi onemocnění jejich hladina zpravidla stoupá, ve III. fázi onemocnění mohou dosahovat vysokých titrů, které mohou přetrvávat několik let. Některé symptomy LB mohou být podobné symptomům jiných nemocí, proto se stanovení protilátek proti boreliím uplatňuje i v rámci diferenciální diagnostiky neuroinfekcí, artropatií, karditid a kožních onemocnění. 3. PRINCIP TESTU: ELISA-VIDITEST anti-borrelia recombinant IgG + VlsE (CSF) je enzymoimunoanalytický test III. generace s vysokou diagnostickou citlivostí a specifitou. Na povrch jamek je navázána směs specifických antigenů. Jsou-li v testovaných vzorcích přítomny příslušné protilátky, navážou se na imobilizovanou směs antigenů. Navázané protilátky pak v dalším kroku reagují s protilátkami proti lidskému IgG značenými křenovou peroxidázou. Množství navázaných značených protilátek se stanoví barevnou enzymatickou reakcí. Negativní vzorky nereagují, mírná změna v zabarvení jamek je pozadím reakce. 4. OBSAH SOUPRAVY: ELISA odlamovací stripy v manipulačním rámečku, potažené směsí specifických rekombinantních antigenů STRIPS Ag 2 x 12 ks 1,3 ml Standardu A=negativní kontrolní sérum, r.t.u. 1) STA/CTRL- 2 lahvičky 1,3 ml Standardu D=Standard 1 (kalibrátor), r.t.u. ST D/ST 1 2 lahvičky 1,3 ml Standardu E=Standard 2 (pozitivní kontrolní sérum), r.t.u. ST E/ST 2 2 lahvičky 13 ml protilátek proti lidskému IgG značených peroxidázou (konjugát anti-igg Px) r.t.u. CONJ 2 lahvičky 125 ml Promývacího roztoku 10x konc. WASH 10x 1 lahvička 100 ml Ředicího roztoku anti-borrelia rec. r.t.u. DIL 1 lahvička 13 ml Chromogensubstrátového roztoku TMB r.t.u. TMB 2 lahvičky 26 ml Stop roztoku r.t.u. STOP 1 lahvička Sáček se zipem Návod k použití soupravy 1
Certifikát kontroly kvality 1) r.t.u., ready to use (v pracovní koncentraci) Ředicí roztok r.t.u. DIL pro Borrelia rec. je určen pouze pro soupravy ELISA-VIDITEST anti- Borrelia recombinant a NENÍ VZÁJEMNĚ ZAMĚNITELNÝ mezi ostatními soupravami ELISA-VIDITEST vyráběných firmou VIDIA spol. s r.o. Chromogensubstrátový roztok TMB r.t.u. je zaměnitelný pouze mezi soupravami ELISA- VIDITEST, které obsahují TMB, a NENÍ VZÁJEMNĚ ZAMĚNITELNÝ s ostatními roztoky TMB použitými v jiných soupravách ELISA-VIDITEST TMB-O, TMB-BF. 5. POTŘEBNÝ MATERIÁL NEDODÁVANÝ SE SOUPRAVOU: Destilovaná/deionizovaná voda pro ředění promývacího roztoku, pipetovací zařízení, zařízení pro rozplňování roztoků a promývání stripů, spektrofotometr/kolorimetr pro mikrotitrační destičky s filtrem pro vlnovou délku 450 nm a 620-690 nm referenčním filtrem (není podmínkou). 6. PŘÍPRAVA REAGENCIÍ: a. Vytemperujte všechny složky soupravy na laboratorní teplotu. b. Těsně před vyšetřením důkladně zamíchejte vzorky vyšetřovaných sér, mozkomíšních moků, synoviální tekutiny a standardy. Testovaná séra řeďte ředicím roztokem 101x (např. 5 μl séra + 500 μl ředicího roztoku). Mozkomíšní moky řeďte ředicím roztokem 2x (např. 75 μl mozkomíšního moku + 75 μl ředicího roztoku). Synoviální tekutinu řeďte ředicím roztokem 81x (např. 5 μl synoviální tekutiny + 400 μl ředicího roztoku). Kontrolní séra (standardy) neřeďte, jsou v pracovní koncentraci (r.t.u., ready to use), před použitím dobře promíchejte obsah každé lahvičky. c. Připravte pracovní koncentraci promývacího roztoku jeho naředěním 10x ve vhodném objemu destilované/deionizované vody (např. 100 ml promývacího roztoku + 900 ml H 2 O). Pokud jsou v koncentrovaném roztoku krystaly soli, zahřejte ho na vodní lázni na +32 až +37 o C a před naředěním dobře promíchejte. Nespotřebovaný promývací roztok v pracovní koncentraci lze skladovat 1 týden při teplotě +2 až +10 o C. d. Konjugát anti-igg Px, chromogensubstrátový roztok TMB a stop roztok neřeďte, jsou v pracovní koncentraci (r.t.u.). Před použitím dobře promíchejte obsah každé lahvičky. 7. PRACOVNÍ POSTUP: a. Stripy, vakuově zatavené s desikantem, nechte před otevřením sáčku vytemperovat na laboratorní teplotu, aby nedošlo k orosení destičky. Připravte si potřebný počet stripů pro reakci. Nepoužité stripy společně s desikantem dobře uzavřete do sáčku se zipem nebo vakuově zatavte. b. Naplňte příslušné jamky po 100 μl standardy a ředěnými testovanými vzorky podle schématu (viz Tab. 1): První jamku naplňte samotným ředicím roztokem DIL pro stanovení pozadí reakce. Dvě jamky naplňte Standardem 1 ST D/ST 1, který slouží jako kalibrátor. Další jamku negativním kontrolním sérem ST A/CTRL- a zbývající jamky ředěnými testovanými vzorky (Vz1, Vz2, Vz3, ). Pro kontrolu je vhodné aplikovat také pozitivní kontrolní sérum ST E/ST 2. Každý vzorek stačí aplikovat na jednu jamku. Pokud chcete vyloučit případnou laboratorní chybu, aplikujte ST D/ST 1 na tři jamky, vyšetřované vzorky a kontrolní séra aplikujte po dvou jamkách. Pro ověření správnosti kalibrace, návaznosti a variability testu doporučujeme zahrnout vzorek pozitivního referenčního séra (vaši vnitřní kontrolu) do každého běhu. Inkubujte 60 minut (+/- 5 min.) při laboratorní teplotě. c. Odsajte obsah jamek do pojistné sběrné láhve obsahující vhodný dezinfekční prostředek (viz Bezpečnostní předpisy). Jamky poté 4x promyjte 250 L promývacího roztoku. Vyvarujte se přetékání roztoku ven z jamek. Obsah jamek odsajte a destičku vyklepněte na přířez buničité vaty. 2
d. Důkladně promíchejte lahvičku s konjugátem anti-igg Px r.t.u. CONJ, a napipetujte do jamek po 100 L konjugátu anti-igg Px r.t.u.. Inkubujte 60 minut ( 5 min.) při laboratorní teplotě. e. Tekutinu z jamek odsajte a promyjte je 4x 250 L promývacího roztoku. Odsajte a vyklepněte. f. Napipetujte do jamek po 100 L chromogensubstrátového roztoku TMB. Inkubujte 10 minut (+/- 30 sec.) při laboratorní teplotě. Dobu inkubace začněte měřit po napipetování 1. stripu destičky. Dodržujte toto pravidlo, vyvarujete se tak nedodržení časového intervalu. Pipetujte rychle v pravidelném rytmu, případně použijte vhodný dispenzor. Překryjte stripy alobalem, neprůhledným víčkem, nebo je po dobu reakce uložte na temné místo. g. Zastavte reakci přidáním 100 L stop roztoku STOP. Pipetujte ve stejném rytmu jako při rozplňování chromogensubstrátového roztoku TMB, aby enzymatická reakce probíhala ve všech jamkách po stejnou dobu. Zkontrolujte, zda nejsou v jamkách bubliny, pokud ano, jemným poklepem na rámeček destičky je odstraňte. h. Intenzitu barevné reakce změřte na spektrofotometru/kolorimetru při 450 nm nejpozději do 10 minut po zastavení reakce. Doporučujeme použít referenční filtr 620-690 nm. Schéma aplikace vzorků: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 a DIL b ST D/ST 1 c ST D/ST 1 d ST A/CTRL - e f g h Vz1 Vz2 Vz3. 8. HODNOCENÍ TESTU: Pokud chcete kvantitativně stanovit koncentraci Borrelia IgG specifických protilátek ve vyšetřovaném vzorku a stanovit intrathekální syntézu protilátek v mozkomíšním moku, využijte kvantitativní stanovení pomocí programu VIDISOFT a postup uvedený v příloze k návodu. Nejdříve odečtěte absorbanci jamky se samotným ředicím roztokem (DIL = pozadí reakce) od hodnot standardů a testovaných vzorků. 8.1. Kvalitativní orientační hodnocení 1. Spočítejte průměrnou hodnotu OD Standardu 1 ST D/ST 1. Pokud aplikujete Standard 1 na tři jamky a některá z těchto hodnot se liší o více než 20% od průměru, nepoužívejte ji k výpočtu a spočítejte průměr ze zbývajících dvou hodnot. 2. Stanovte cut-off hodnotu. Cut-off hodnotu stanovíte tak, že průměrnou hodnotu Standardu 1 vynásobíte korekčním faktorem. Hodnota korekčního faktoru Standardu 1 se určuje pro každou šarži soupravy a je uvedena v Certifikátu kontroly kvality dané šarže. 3. Séra s hodnotou OD < 90% cut-off jsou negativní a séra s hodnotou OD > 110% cut-off jsou považována za pozitivní. Hodnocení pro mozkomíšní moky a synoviální tekutiny viz bod 8.2. Semikvantitativní hodnocení. 8.2. Semikvantitativní hodnocení Stanovte hodnotu indexu pro jednotlivé vzorky sér, mozkomíšních moků a synoviální tekutiny: 1. Nejdříve stanovte cut-off hodnotu jako v předešlém způsobu hodnocení (čl. 8.1., bod 2). 3
2. Stanovte hodnotu indexu pro jednotlivé vzorky tak, že vydělíte OD testovaného vzorku cut-off hodnotou. 3. Odečtěte v tabulce (viz HODNOCENÍ VÝSLEDKŮ) odpovídající stupeň reaktivity vzorku. HODNOCENÍ VÝSLEDKŮ: a) séra Hodnota indexu Vyhodnocení < 0,90 negativní 0,90-1,10 +/- 1,11-2,70 + 2,71-4,30 ++ 4,31-6,00 +++ > 6,00 ++++ Pokud Váš spektrofotometr (ELISA reader) ukáže maximální měřitelnou hodnotu ( over ), považujte tyto výsledky v indexu pozitivity za > 6,00. Příklad: Získaná OD Standardu 1 = 1,231; 1,198; 1,215 Průměrná hodnota OD Standardu 1 = 1,215 OD vzorku séra = 1,587 Korekční faktor Standardu 1 = 0,29 Cut-off hodnota = 1,215 x 0,29 = 0,352 Hodnota indexu = 1,587 / 0,352 = 4,51 b) mozkomíšní mok Hodnota indexu Vyhodnocení < 1,00 Negativní 1,00 1,30 +/- > 1,30 Pozitivní Pokud Váš spektrofotometr (ELISA reader) ukáže maximální měřitelnou hodnotu ( over ), považujte tyto výsledky v indexu pozitivity za > 1,30. c) synoviální tekutina Hodnota indexu Vyhodnocení < 1,00 Negativní 1,00 1,30 +/- > 1,30 Pozitivní Pokud Váš spektrofotometr (ELISA reader) ukáže maximální měřitelnou hodnotu ( over ), považujte tyto výsledky v indexu pozitivity za > 1,30. Pozn.: Hodnocení +/- znamená, že vzorek leží v rozmezí šedé zóny. V případě tohoto výsledku test opakujte. Leží-li vzorek po opakovaném testování opět v rozmezí šedé zóny, opakujte testování alternativní metodou, nebo použijte vzorek odebrané od téhož jedince o 1-2 týdny později. 4
9. INTERPRETACE VÝSLEDKŮ: Diagnóza (stádium) Klinické projevy Laboratorní průkaz základní podpůrný IgM pozitivní (3-6 I. časná Erythema migrans týden po infekci) lokalizovaná fáze Často séronegativní kožní biopsie II. časná diseminovaná fáze III. pozdní diseminovaná fáze Borreliový lymfocytom Myokarditida Oftalmoborreliosa Neuroborreliosa Artritida Acrodermatitis chronica atrophicans Chronická neuroborreliosa 10. CHARAKTERISTIKY TESTU: 10.1. Platnost testu IgM pozitivní, IgG poz. nebo IgM neg., IgG poz. IgM neg., IgG poz. (vysoké hladiny IgG protilátek) Histologický nález B-buněk pseudo lymphocytoma Hodnota absorbance samotného ředicího roztoku (DIL = pozadí reakce) by měla být < 0,150. Hodnota OD Standardu 1 ST D/ST 1 by měla být v rozmezí uvedeném v Certifikátu kontroly kvality dané šarže. Test je určen pro stanovení specifických IgG protilátek v lidském séru, mozkomíšním moku a synoviální tekutině. 10.2. Přesnost testu Pro stanovení variability mezi jednotlivými testy - reprodukovatelnost (interassay) a během testu - opakovatelnost (intraassay) bylo provedeno srovnání vzorků s různými hodnotami OD. 10.2.1. Opakovatelnost (intraassay) Variační koeficient opakovatelnosti je maximálně 5%. Je měřen pro každou šarži minimálně na 12 paralelních jamkách téže destičky. Příklad: (n = počet paralelních jamek na téže destičce) n A ơ CV opak. 16 1,335 0,050 3,8 % 16 0,614 0,023 3,7 % 10.2.2. Reprodukovatelnost (interassay) Variační koeficient reprodukovatelnosti je maximálně 15%. Je měřen pro každou šarži porovnáním jamek téhož séra v několika po sobě jdoucích testech. Příklad: (n = počet testů určitého vzorku) n A ơ min max CVrepro 18 1,369 0,064 1,223-1,476 4,7% 18 0,463 0,060 0,337-0,569 12,9% 10.2.3. Recovery test Naměřené hodnoty recovery se pohybují pro každou šarži v rozmezí 80 až 120% očekávané hodnoty. 10.3. Diagnostická citlivost a specifita testu Stanovení diagnostické citlivosti bylo provedeno testováním pacientských vzorků, u kterých byl očekáván pozitivní výsledek na IgG proti boreliím. Výsledek byl potvrzen nezávislými 5
komerčními testy v rámci interní studie funkční způsobilosti a externí studie provedené několika klinickými laboratořemi. Diagnostická citlivost je 95%. Specifita testu byla stanovena testováním charakterizovaných vzorků sér, u kterých byla očekávána nepřítomnost IgG proti boreliím. Výsledná specifita testu z daných vzorků byla 99%. 10.4. Interference Hemolytické a lipemické vzorky nevykazují žádný vliv na výsledek testu minimálně do 50mg/mL pro hemoglobin, 5 mg/ml pro bilirubin a 40mg/mL pro triglyceridy. 11. BEZPEČNOSTNÍ PŘEDPISY: Všechny složky soupravy jsou určeny pouze pro laboratorní účely. Lidská séra použitá v soupravě byla testována na nepřítomnost HBsAg, HCV a protilátek anti- HIV-1,2. Přesto s nimi nakládejte jako s infekčním materiálem a předměty, které s nimi přišly do styku, autoklávujte 1 hodinu při 121 C, nebo dezinfikujte minimálně 30 minut 3% roztokem chloraminu. Tekuté odpady obsahující stop roztok (roztok kyseliny sírové) před likvidací neutralizujte 4% roztokem hydrogenuhličitanu sodného. Odpad vzniklý při promývání stripů dezinfikujte v odpadní nádobě pomocí vhodného dezinfekčního roztoku (např. Incidur, Incidin, chloramin,...) v koncentraci doporučené výrobcem. Se stop roztokem pracujte opatrně, aby nedošlo k potřísnění kůže nebo sliznice. Stane-li se tak, omyjte postižené místo větším množstvím tekoucí vody. Při práci nejezte, nepijte a nekuřte. Nepipetujte ústy, ale vhodnými pipetovacími zařízeními. Používejte ochranné rukavice a po práci si důkladně umyjte ruce. Dbejte, aby nedošlo k rozlití vzorků a k tvorbě aerosolu. 12. UPOZORNĚNÍ: a. Výrobce zaručuje použitelnost soupravy jako celku. b. Promývací roztok, chromogensubstrátový roztok TMB r.t.u. a stop roztok r.t.u. jsou vzájemně zaměnitelné mezi jednotlivými soupravami ELISA-VIDITEST, pokud není v návodu k použití soupravy uvedeno jinak. c. Pracujte asepticky, aby nedošlo k mikrobiální kontaminaci sér a reagencií. d. Při odebírání, ředění a skladování reagencií postupujte tak, aby nedošlo k jejich vzájemné kontaminaci či kontaminaci látkami inhibujícími enzymatickou aktivitu. e. Kontrolní séra (standardy), ředicí roztok, chromogensubstrátový roztok TMB a konjugát anti- IgG Px jsou konzervovány ProClinem 300. f. Chromogensubstrátový roztok nesmí přijít do styku s oxidačními látkami a kovovými povrchy. g. Pro aplikaci roztoků a měření absorbance používejte pouze validované měřící přístroje. h. Dodržujte přesně pokyny uvedené v návodu. Nereprodukovatelné výsledky mohou vzniknout zejména: * nedostatečným promícháním reagencií a vzorků před použitím * nepřesným pipetováním a nedodržováním času inkubací uvedených v kapitole 7. * špatnou technikou promývání a potřísněním okrajů jamek vzorky nebo konjugátem * použitím stejné špičky při pipetování různých roztoků nebo záměnou uzávěrů 6
13. SKLADOVÁNÍ A EXPIRACE: a. Soupravu a její složky skladujte v suchu a temnu při teplotě +2 až +10 C. Za těchto podmínek je expirační doba celé soupravy uvedena na centrálním štítku na obalu soupravy, expirace jednotlivých složek je uvedena na jejich obalu. b. Nespotřebované stripy vložte zpět do obalu a zatavte, nebo dobře uzavřete do sáčku se zipem společně s desikantem. Soupravy se přepravují chlazené v termotaškách. Jestliže po obdržení soupravy zjistíte vážné poškození obalu jakékoliv složky soupravy, ihned informujte výrobce. c. Nespotřebovaná testovaná séra a mozkomíšní moky uchovávejte v neředěném stavu rozplněná na alikvoty a zmrazená při teplotě -18 až -28 C. Časté zmrazování a rozmrazování se nedoporučuje. Pokud skladujete séra při teplotě +2 až +10 C, pak je spotřebujte do jednoho týdne. d. Roztoky testovaných sér v pracovní koncentraci nelze skladovat. Připravujte je vždy čerstvé. 14. TESTOVACÍ SCHÉMA: Krok 1. Připravte reagencie a testované vzorky v pracovním ředění Krok 2. Aplikujte standardy a testované vzorky (100 L/ jamku) Inkubujte 60 minut při laboratorní teplotě 4x promyjte (250 L/ jamku), vyklepněte Krok 3. Krok 4. Aplikujte konjugát anti-igg Px r.t.u. (100 L/ jamku) Inkubujte 60 minut při laboratorní teplotě 4x promyjte (250 L/ jamku), vyklepněte Aplikujte Chromogensubstrátový roztok TMB (100 L/ jamku) Inkubujte 10 minut v temnu při laboratorní teplotě Krok 5. Aplikujte Stop roztok (100 L/ jamku) Krok 6. Změřte absorbanci při 450/ 620-690 nm do 10 minut Souprava byla vyvinuta za finanční podpory ze státních prostředků poskytnutých prostřednictvím Ministerstva průmyslu a obchodu. Datum poslední verze tohoto návodu: 06/2014 7