VYUŽIT ITÍ PRŮTOKOV TOKOVÉ CYTOMETRIE V IMUNOLOGII Helena Langhansová 30. listopadu 2011 Projekt Vytvoření a rozvoj týmu zaměřeného na výzkum a výuku v oblasti medicínské biologie, reg. č. CZ.1.07/2.2.00/15.0361, je spolufinancován z Evropského sociálního fondu a státního rozpočtu České republiky.
Schéma přednášky I. část: Základní principy průtokové cytometrie II. část: Aplikace v imunologickém výzkumu Flow Cytometry Course Department of Biology, University of York 12 th 16 th September 2011
Průtokov toková cytometrie Měření a analýza fyzikálních a chemických vlastností jednotlivých buněk v proudu kapaliny během jejich průchodu laserovým paprskem Přímý rozptyl (forward scatter) velikost Boční rozptyl (side scatter) granularita Fluorescence
Výhody: velké množství buněk během krátkého času, subpopulace, třídění (sorting) Nevýhody: jednotlivé buňky, lokalizace proteinu (x konfokální mikroskop)
Průtokový cytometr Fluidika Zdroj(e) světla Optika Detektory Zpracování dat BD FACS CantoII
FLUIDIKA pohyb buněk cytometrem hydrodynamická fokusace low - medium - high (tlak vzorku určuje průměr jádra)
ZDROJ SVĚTLA Laser - stejná vlnová délka i fáze (Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation) 488 nm, 633 nm, (405 nm)
OPTIKA Sběr emitovaného světla pomocí systému filtrů Filtry dichroické, selektivně propouští 1 vlnovou délku a odrážejí ostatní SP, LP, BP
DETEKTORY sběr světla a konverze na měřitelný signál (analogový, digitální) Fotodioda (forward scatter), fotonásobič (fluorescence) konverze světla na napětí Poměr signálu k šumu šum biologický, elektronický Dynamický rozsah poměr mezi největší a nejmenší měřitelnou hodnotou Digitální systémy zvyšují rychlost a přesnost měření
ZPRACOVÁNÍ DAT komunikace mezi přístrojem a uživatelem zisk použitelných dat (počet buněk exprimujících daný antigen, počet buněk v určité fázi cyklu, odpověď populace na stimul, síla exprese antigenu, absolutní množství buněk, ) Analytický software Vyčíslení subpopulace (% pozitivních) Intenzita fluorescence (medián)
Fluorescence Emise fotonu při přechodu elektronu z S1 do S0 Absorpce světla (λ A ) excitovaný stav emise světla (λ B ) základní stav Fluorofory přírodní, syntetické Použití filtrů Závislá na prostředí (ph, vazebné vlastnosti, bleaching)
Proč fluorescence? Mnoho buněk má stejnou/podobnou morfologii Značení specifických částic/komponent Identifikace a charakterizace subpopulací Kvantifikace znaku Specifická diskriminace (např. živé/mrtvé buňky, buněčný cyklus)
II. Průtokov toková cytometrie v imunologii Povrchové značení (fenotypizace) Intracelulární značení Buněčný cyklus a proliferace Apoptóza Funkční parametry
Plánování experimentu Účel, hypotézy, literatura, důvod použití průtokové cytometrie (x mikroskopie, RT-PCR) Technické specifikace cytometru a fluorochromů (lasery, počet barev, absorpční a emisní spektra, kompenzace) Finanční náklady a personální možnosti
Optimalizace experimentu Silné/slabé fluorochromy Hustota antigenu CD4PE CD38FITC Tandemové fluorochromy FRET nestabilní
Optimalizace vzorků! dublety, shluky (filtrace, Dnáza), mrtvé buňky Suspenzní x adherentní buňky, tkáně nebo řezy Fixace buněk + prevence infekce, stabilita vzorku, pohodlí - vyloučení mrtvých buněk, změna rozptylu, autofluorescence Titrace protilátek
Použití kontrol V KAŽDÉM EXPERIMENTU Nastavení cytometru (nebarvené buňky) Kompenzační kontroly (jednobarevné) FMO (gating při mnohobarevné analýze) Isotypové kontroly (vazba protilátek) Experimentální (naivní buňky)
POVRCHOVÉ ZNAČEN ENÍ Fenotypizace Povrchové molekuly aktivační molekuly, receptory pro cytokiny a chemokiny, mediátory zánětu Monoklonální protilátky, přímé x nepřímé značení Leukémie, HIV dg, efekt léčby, zbytková nemoc
Diwan et al. PNAS 2007, 104: 6794-6799 Pecora et al. JI 2006, 177: 422-429.
Kombinace rozptylu a fluorescence progrese nádoru
PerCP=CD45, FITC=CD3, APC=NK1.1, Alexa700=CD4, PE-Cy7=CD8
Důležité: Stimulace (restimulace buněk) Receptor shedding (inhibitory, 4 C) Kvalita protilátek (nespecifická vazba blok, iso kontroly (FcR)) Citlivost 200-500 mlk/b Přímé x nepřímé značení
INTRACELULÁRN RNÍ ZNAČEN ENÍ Cytokiny, transkripční faktory Inhibice transportu ven z buňky (brefeldin A) Fixace a permeabilizace buněk (! změna scatteru, vyloučení mrtvol Často v kombinaci s povrchovým značením Sadanaga et al. Clin Cancer Res 2001, 7: 2277
APOPTÓZA = programovaná buněčná smrt fyziologická - normální vývoj a obnova tkání, negativní selekce, CTL patologická - autoimunitní a neurodegenerativní onemocnění, rakovina expozice různým podmínkám (léky, jedy ) rychlý a dynamický proces, kombinace s mikroskopií
Scatter, změny v buněčné membráně, mitochondriích, aktivace specifických enzymů, rozpad DNA
Změna velikosti a tvaru Zvýšená propustnost pro DNA barviva (PI, DAPI, Sytox Green atd.)
Depolarizace mitochondriální membrány akumulace v aktivních mitochondriích (membránový potenciál zachován) - CMXRos, LDS-751, JC-1, TMRE Uvolňování cytochromu c Nonyl Acridine Orange (NAO), protilátky
Aktivace enzymů kaspáza 3 FLICA (fluorochrome-labelled inhibitors of caspase activity) Protilátky proti aktivní formě enzymu Fixace a permeabilizace nelze užít live/dead diskriminaci
Změny v buněčné membráně expozice fosfatidylserinu na vnější straně Annexin V, YO-PRO-1
Degradace DNA Sub-G1 populace TUNEL assay řetězcové zlomy
BUNĚČ ĚČNÁ PROLIFERACE CFSE, SNARF-1, PKH-26 Carboxy-fluorescein-diacetate-succinimidal ester
Odpověď na stimulaci mitogenem, superantigenem nebo specifickým antigenem Cytostatika Dělení všech buněk x dělení subpopulace
FUNKČNÍ PARAMETRY Buněčné interakce, změny Ca 2+, fagocytóza, oxidační vzplanutí Indo-1, Fluo-3 vazba na vápenaté ionty a změna fluorescence
BUNĚČ ĚČNÝ CYKLUS G0 na G1- lymfocyt po stimulaci, růst buňky, syntéza RNA a proteinů, exprese CD69 DNA-vázající látky
BromdeoxyUridin (BrdU) - Analog thyminu S fáze Anti-BrdU protilátky Odlišení aktivně se dělících buněčných frakcí, kinetika Kombinace s PI, event. povrchovým značením In vivo i.p., pitná voda CFSE
Většina postupů je aplikovatelných i na subcelulární struktury (jádra, mitochondrie), kuličky a prokaryotní buňky (s ohledem na velikost a tvar)
singlety 2 populace? F4/80 mrtvé živé fagocytující
Užitečné odkazy www.bdbiosciences.com/immune_function ISAC - International Society for Advancement of Cytometry http://www.isac-net.org/ Česká společnost pro analytickou cytologii www.csac.cz http://www.cyto.purdue.edu/hmarchiv/index.htm
Projekt Vytvoření a rozvoj týmu zaměřeného na výzkum a výuku v oblasti medicínské biologie, reg. č. CZ.1.07/2.2.00/15.0361, je spolufinancován z Evropského sociálního fondu a státního rozpočtu České republiky. DĚKUJI ZA POZORNOST