Kvalita v laboratorní a kontrolní praxi Část: Validace analytických metod vhodnost pro daný účel Vladimír Kocourek Praha, 2018
Výběr zkušebních metod pro daný účel Kvalimetrie 9. Vhodnost analytických metod pro daný účel (laboratorní příručka pro validaci metod a související činnosti), Miloslav Suchánek, EURACHEM ČR, Praha 1999 Procesem VALIDACE se zjišťují PRACOVNÍ CHARAKTERISTIKY analytické metody: je metoda vhodná pro zamýšlený účel?
Co je tedy VALIDACE? poskytnutí důkazu, že metoda je vhodná pro daný účel = zjišťování její platnosti (validity). Analytická metoda je definována: principem a rovnicí měření algoritmem pracovního postupu, požadavky na materiály, přístroje, zařízení,.. pracovními (provozními) charakteristikami způsobem kvantifikace (kalibrace a výpočet) SOP: Standard Operation Procedure
Analytická metoda jako součást řešení problému Definování problému Výběr vhodné metody Úprava vzorku (sample handling) Zpracování a měření vzorku Kalibrace a výpočet Statistické zpracování Interpretace, Prezentace
Struktura SOP ČSN/EN/ISO Normalizovaná analytická (zkušební) metoda: podstata zkoušky (princip, definice analytu) chemikálie (činidla, rozpouštědla, standardy,..) přístroje, zařízení pracovní postup (algoritmus vč. kalibrace a výpočtu) konfirmační zkoušky (identita, kvantita) preciznost (opakovatelnost, reprodukovatelnost) pravdivost (výtěžnost odchylka) protokol o zkoušce (uvádění výsledků, interpretace)
VALIDUJÍ se pracovní charakteristiky: 1. PŘESNOST: opakovatelnost, reprodukovatelnost náhodné vlivy pravdivost (zpravidla výtěžnost) - vychýlení 2. SPECIFIČNOST, SELEKTIVITA: specifická metoda - zcela oproštěna od vlivu matrice selektivní metoda výsledky ovlivňuje složení matrice (interference, cross-reactivity, ) 3. CITLIVOST: směrnice kalibrační přímky
VALIDUJÍ se pracovní charakteristiky: 4. MEZ DETEKCE a MEZ STANOVITELNOSTI: LOD jaké množství analytu lze ještě spolehlivě prokázat LOQ jaké množství analytu lze s definovanou přesností ještě stanovit nebo nejnižší bod kalibrační křivky (LCL) 5. PRACOVNÍ ROZSAH a LINEARITA: v jakém koncentračním rozsahu lze měřit/kalibrovat a v jakém rozsahu je kalibrační závislost lineární Měření má probíhat za stejných podmínek jako kalibrace! 6. ROBUSTNOST (ruggedness, robustness): jak je výsledek ovlivněn malými změnami v dodržení SOP (test robustnosti parametrů).
Požadavek ISO 17025: Laboratoř musí používat takových zkušebních metod, (a metod vzorkování), které splňují potřeby zákazníka a jsou vhodné pro zkoušky, které laboratoř provádí. V řadě sektorů, zejména při kontrole kvality a bezpečnosti potravin, se požaduje plně validovaná metoda. Zhodnocení opakovatelnosti a reprodukovatelnosti ČSN ISO 5725: Přesnost metod a výsledků měření Mezilaboratorní studie
MEZILABORATORNÍ VALIDACE Zhodnocení opakovatelnosti a reprodukovatelnosti Nákladný a zdlouhavý proces Obtížné sehnat dostatečný počet kompetentních laboratoří Pro multireziduální metody, prakticky nemožné zahrnout všechny existující analyty, matrice a koncentrační hladiny Tato cesta validace je ve stopové analýze spíše ojedinělá, zvláště organických sloučenin v biotických matricích, ojedinělá - většina laboratoří má svoji metodu in-house validace
Dlouhodobá opakovatelnost ( intralaboratorní přesnost ) (i) Preciznost opakování v rámci jedné série měření směrodatná odchylka σ r (ii) Preciznost mezi více sériemi, zahrnující jednotlivé systematické vlivy (dílčí odchylky) směrodatná odchylka σ run σ tot = (σ r2 /n + σ run2 ) 1/2 Rozptýlení výsledků se hodnotí opakovanou analýzou duplikátních vzorků, resp. referenčního materiálu (např. při vedení regulačního diagramu).
Vývoj a optimalizace metody vzorky s přídavkem (spiked samles) Postup validace zvládnutí procesu Referenční materiál opakovaná měření Nezávislá metoda Mezilaboratorní studie OPAKOVATELNOST PRAVDIVOST REPRODUKOVATELNOST LOD/LOQ Rozsah Pracovní charakteristiky Účel analýzy? Selektivita Robustnost
Hodnocení preciznosti (validace, QC) Validace a kontrola preciznosti analytického metody preciznost z mezilaboratorní validační studie: s r a s R (ISO 5725) opakovatelnost zjišťovaná laboratoří: s r (návod na určení rozsahu n) opakovatelnost řízená laboratoří - regulační diagram rozpětí: D Požadavky na RM a analýzu homogenita a stabilita po celou dobu používání (CRM ideální) ref. hodnota nemusí být přesně určena ale koncentrační hladina by měla odpovídat měřeným vzorkům, resp. limitním hodnotám (ML). zajistit vždy nezávislá opakování na celé metodě od navážky přes kalibraci až po výpočet. nedoporučují se paralelky, protože náhodná chyba v jednom kroku může být pak společná pro všechny souběžně zpracovávané vzorky. Vladimir.Kocourek@vscht.cz
Hodnocení preciznosti (validace, QC) Zpracování dat a výpočet : vyloučení technicky neplatných dat (příčina známá), vyloučení odlehlých hodnot (příčina neznámá) alternativní testy, kritické posouzení datového souboru po vyloučení podezřelých hodnot (normalita, počet platných vs. počet vyloučených ve vztahu ke směrodatné odchylce). Porovnání zjištěné s w souboru s požadovaným s w0
Hodnocení vychýlení (trueness) Validace a kontrola pravdivosti (trueness) analytického procesu CRM má zde naprosto zásadní úlohu CRM je nezbytný pro prokázání metrologické návaznosti Diference mezi výsledkem kontrolní analýzy CRM a certifikovanou hodnotou musí být menší nežli standardní nejistota vypočtená kombinací standardních nejistot obou těchto hodnot: Pokud je tato podmínka splněna, pak lze: - prokázat návaznost měření (analýzy) k dané referenci, - použít metodu (měřicí postup) pro zjištění vychýlení výtěžnosti Vladimir.Kocourek@vscht.cz
Hodnocení vychýlení (trueness) 9.2.4. Uživatelé by měli kalibrovat svá zařízení nezávisle na CRM, který je používán pro kontrolu vychýlení. Takže mít pro každý analyt jeden standard ke kalibraci a ještě další ke kontrole vychýlení? 9.3.2. se doporučuje vylepšit metodu tak, aby vychýlení bylo eliminováno, spíše než se snažit vychýlení korigovat. U některých metod jsou udána kritéria pro vychýlení. Vladimir.Kocourek@vscht.cz
Hodnocení vychýlení (trueness) Vladimir.Kocourek@vscht.cz
Hodnocení vychýlení: TNI ISO pokyn 33 Vladimir.Kocourek@vscht.cz
? Citlivost? Mez detekce (Limit Of Detection): nejmenší koncentrace analytu, která ještě vyvolá odezvu měřicího systému rozpoznatelnou (s přijatelnou statistickou jistotou) od ostatních vlivů. Mez stanovitelnosti (Limit Of Quantitation): nejnižší koncentrace analytu, kterou lze s definovanou přesností kvantitativně stanovit a pro kterou byla metoda validována (odpovídá zpravidla nejnižšímu bodu kalibrační křivky). LOD a LOQ se doporučuje vyjadřovat jako koncentraci analytu v původním vzorku, zejména pokud na daných koncentračních hladinách existují rušivé vlivy matrice.
Matriční vlivy: např. pokles a deformace signálu Vysoký obsah matrice Nízký obsah matrice
Mez detekce: odlišení signálu od šumu? S/N > 6 S/N > 2 signál šum
S/N dle různých autorit: 1. Evropský lékopis: 2. Alternativně:
Limit detekce (LOD) kdy lze prohlásit, že látka je přítomna Limit kvantifikace (LOQ) kdy lze obsah látky dobře změřit LOD je koncentrace, kdy látka vyvolá odezvu (S) měřicího přístroje větší než je trojnásobek úrovně šumu (N) pozadí S/N = 3 LOQ je koncentrace, kdy látka vyvolá odezvu měřicího přístroje větší než je desetinásobek úrovně šumu pozadí S/N = 10
Konverze signálu na koncentraci v oblasti nízkých koncentrací 1 0 0 8 Pracovní rozsah 0 6 Signál 0 4 0 2 0 LOD LOQ Lineární rozsah 0 0 2 0 4 0 6 0 8 1 0 1 2 Koncentrace
Nejnižší kalibrační hladina (LCL) nejnižší koncentrace, od které vyjadřujeme výsledky analýzy kvantitativně nižší koncentrace nelze měřit i když je přítomnost látky kvalitativně prokázána (> LOD); LCL nesmí být nižší než LOQ Signál Lineární rozsah Strmost = citlivost < LCL Oblast kvantifikace (S/N = 10) Intercept (S/N = 3) LOD LOQ LCL Koncentrace
DETEKTABILITA jak snížit LOD? Zvýšení poměru S/N v GC/MS-NCI analýze nitronaftalenů (vzorek trávy) pomocí zvýšení napětí na fotonásobiči detektoru (1-nitroNAP = 0,1 ppb, 2-nitroNap = 0,08 ppb) A - EMV = 1300 V B - EMV = 1800 V 84 82 80 1-nNap 2-nNap A 280 260 240 220 1-nNap 2-nNap B 78 200 180 76 160 74 140 120 72 100 80 70 60 Time--> 11.80 12.00 12.20 12.40 12.60 Time--> 11.80 12.00 12.20 12.40
Mez detekce: odlišení signálu od slepých pokusů 30 25 Soubor slepých pokusů + vzorek LOD 3 x směrodatná 20 odchylka σ 0 ug/kg 15 průměr slepých pokusů X 0 10 5 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Pokus č. LOD = X 0 + k* σ 0
Mez detekce: odlišení signálu po korekci pozadí 5 4 Soubor slepých pokusů + vzorek 3 2 3 x směrodatná odchylka σ 0 ug/kg 1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15-1 -2-3 Pokus č. LOD = X 0 + k*σ 0 X 0 = 20,6 ug/kg; k = 3
Vztah mezi LOD a slepými pokusy (blank) 1,64*s blank 1,64*s blank β = 5 % α = 5 % s blank y blank Odezva blank Y LOD Signál analytu
Jak malé množství látky lze ještě zjistit? Moderní analytické techniky:.. často už ani nejde o to Jak nízkou koncentraci látky lze ještě zjistit (resp. měřit)? ale o spíše to Jak nízkou koncentraci látky je nutno ještě zjistit (resp.měřit)?
ANALYTICAL QUALITY CONTROL AND VALIDATION PROCEDURES FOR PESTICIDE RESIDUES ANALYSIS IN FOOD AND FEED. Document N SANTE/11945/2015
ANALYTICAL QUALITY CONTROL AND VALIDATION PROCEDURES FOR PESTICIDE RESIDUES ANALYSIS IN FOOD AND FEED. Document N SANTE/11945/2015 Within-laboratory method validation should be performed to provide evidence that a method is fit for the purpose for which it is to be used. Method validation is a requirement of accreditation bodies, and must be supported and extended by method performance verification during routine analysis (analytical quality control and on-going verification). The method must be tested to assess at least - for mean recovery (as a measure of trueness or bias), precision, limit of quantification (LOQ), and sensitivity. If the analytical method does not permit determination of recovery (for example, direct analysis of liquid samples, SPME, or headspace analysis), the precision is determined from repeat analyses of calibration standards. The bias is usually assumed to be zero, although this is not necessarily so. In SPME and headspace analysis, the trueness and precision of calibration may depend on the extent to which the analyte has equilibrated!
ANALYTICAL QUALITY CONTROL AND VALIDATION PROCEDURES FOR PESTICIDE RESIDUES ANALYSIS IN FOOD AND FEED. Document N SANTE/11945/2015 Validation of qualitative screening methods is focused on detectability: the lowest spiking level for which has been demonstrated that a certain analyte can be detected in at least 95% of the samples (i.e. a false-negative rate of 5% is accepted).
Codex Alimentarius: numerical values for the criteria Applicability: The method has to be applicable for the specified provision, specified commodity and the specified level: maximum and/or minimum - ML. The minimum applicable range of the method depends on the specified level (ML) to be assessed, and can either be expressed in terms of the reproducibility standard deviation (s R ) or in terms of LOD and LOQ. Minimum applicable range: ML 0.1 mg/kg [ML - 3 s R, ML + 3 s R ] ML < 0.1 mg/kg [ML - 2 s R, ML + 2 s R ] Limit of Detection (LOD): ML 0.1 mg/kg LOD ML 1/10 ML < 0.1 mg/kg LOD ML 1/5 Limit of Quantification (LOQ): ML 0.1 mg/kg LOQ ML 1/5 ML < 0.1 mg/kg LOQ ML 2/5 CL 2008/7-MAS, March 2008
Codex Alimentarius: numerical values for the criteria CL 2008/7-MAS, March 2008
Parametry pro stopovou analýzu - biotické matrice Kompletní návod pro validaci metod a kriteria jejich vhodnosti pro úřední kontrolu
KLASIFIKACE ANALYTICKÝCH METOD (charakteristiky, které musí být verifikovány) COMMISSION DECISION 2002/657/EC implementing Council Directive 96/23/EC concerning the performance of analytical methods and the interpretation of results. Typ metody CCβ [k.lod] CCα [DL] Pravdivost Opakovatelnost Selektiv./ specific. Pouzit./ robust. KVALITATIVNÍ S + - - - + + K + + - - + + KVANTITATIVNÍ S + - - + + + K + + + + + + pro všechny oblasti stopové analýzy se spíše uvažuje LOD a DL S screeningová; K - konfirmační + - stanovení je závazné
SCREENINGOVÉ METODY - nutno validovat požadavek: falešně negativní výsledky < 5% (chyba 2. řádu - β) na rozhodovací koncentrační hladině Požadovaná úroveň detekce, DL koncentrace NEGATIVNÍ vzorky STOP POSITIVNÍ vzorky KONFIRMACE
ROZHODNUTÍ KOMISE 2002/657/EC o provádění analytických metod a interpretaci výsledků. CCβ Detekční schopností CCß se rozumí nejmenší množství látky, které může být s chybou ß ve vzorku detekováno a/nebo identifikováno. V případě látek, pro něž není stanovena nejvyšší přípustná hodnota, je to nejnižší koncentrace, kdy lze identifikovat skutečně kontaminované vzorky se spolehlivostí 1 ß. V případě látek, pro něž je stanovena nejvyšší přípustná hodnota, se detekční schopností rozumí koncentrace, při jejímž dosažení lze metodou detekovat nejvyšší přípustné koncentrace s pravděpodobností 1 β. CCα Rozhodovací mezí CCα se rozumí mez, při jejímž dosažení a překročení lze konstatovat, že vzorek s pravděpodobností α nesplňuje požadavky.
Mez detekce: kvalita rozhodnutí? signál Skutečnost šum nepřítomen přítomen Rozhodnutí nedetekován detekován Správné rozhodnutí Falešně Pozitivní (chyba I. druhu) Falešně Negativní (chyba II. druhu) Správné rozhodnutí
Graf operativní charateristiky ilustrující detekční schopnost (CC β analytické metody) Pravděpodobnost pozitivního nálezu Limit 0.5
Mez detekce: spolehlivost rozhodnutí α k 0,5000 0,0 0,1587 1,0 0,0228 2,0 0,0062 2,5 0,0026 2,8 0,0013 3,0 0,0005 3,3 X 0 X LOD = X D α - riziko, že výsledek bude falešně pozitivní (FP): rozhodneme, že analyt je přítomen ale ve skutečnosti tam není
Mez detekce: riziko FP (α) a FN (β) výsledků Mez rozhodnutí X DL = X LOD X 0 X LOD = X D
Mez detekce: riziko FP (α) a FN (β) výsledků Mez rozhodnutí X DL > X LOD X 0 X LOD X D
Mez detekce: riziko FP (α) a FN (β) výsledků Mez rozhodnutí X DL = 2 x X LOD X 0 X LOD X D
Mez detekce: riziko FP (α) a FN (β) výsledků LOD X DL FP (α) FN (β) 3 σ 3 σ 0,1 % 50 % 3 σ 4 σ 0,1 % 16 % 3 σ 5 σ 0,1 % 2,3 % 3 σ 6 σ 0,1 % 0,1 % 2,33 σ 2,33 σ 1 % 50 % 2,33 σ 4,66 σ 1 % 1 % 1,64 σ 3,28 σ 5 % 5 %
Mez stanovitelnosti (LOQ) - pravidla LOQ se zpravidla stanoví jako nejnižší koncentrace, pro kterou ještě metoda splňuje kriteria přijatelnosti pro preciznost a pravdivost (tj. opakovatelnost, výtěžnost) LOQ nelze deklarovat nižší, nežli odpovídá nejnižšímu bodu kalibrační křivky (LCL) LOQ nejnižší bod kalibrační křivky nemá být níže, nežli odpovídá trojnásobku LOD (tedy asi 9-10 x σ). Výsledky ležící mezi LOD a LOQ se nepovažují za kvantitativní (uvedou se např. stopy nebo semikvantitativní vyjádření)
Hmotnostní rozlišení - MASS RESOLVING POWER Mass resolving power schopnost hmotnostního analyzátoru rozlišit ionty podobné hmotnosti Mass resolution 1,0 m 1 m Δm 2 FWHM = m m Full Width at Half Maximum (FWHM) Defined for the profile (continuum) spectra Normalised intensity 0,5 Max. Δm 50% of Max. FWHM 5% of Max. Δm 10% Valley 0,0 99 100 101 102 m/z
Hmotnostní rozlišení - MASS RESOLVING POWER nízkorozlišovací (LR) hmotnostní spektrometr vysokorozlišovací (HR) hmotnostní spectrometr 100 219.9459 500 FWHM (jednotkové rozlišení) 100 e at e te s ty 219.9459 6,000 FWHM 50 50 0 220 221 222 223 224 220 221 222 223 224 m/z m/z Separace hmot: iontů 220 a 221 Možná separace iontů: 220,00 a 220,08 0
Spolehlivost identifikace: hmotnostní spektrometrie Steven J. Lehotay, Katerina Mastovska et al. Trends in Analytical Chemistry, Vol. 27, No. 11, 2008
MASS ACCURACY Rozdíl mezi hmotou iontu experimentálně naměřenou a teoreticky vypočtenou (accurate mass vs. exact mass) Vyjádřeno jako chyba hmotnosti (mda, ppm) ( ) 3 m m ( mda) = exp. teor. 10 mexp. mteor. ( ppm) = 10 m teor. 6 Unit resolution (LR) mass spectrometers Přesnost hmoty 0,1 0,2 Da (např. 200,0 and 200,1 Da) High-resolution (HR) mass spectrometers Přesnost hmoty 0,001 Da (< 5 ppm) (např. 200,000 and 200,001 Da)
DG SANTE/11813/2017 o validaci metod a QC v analýze reziduí pesticidů Kriteria pro identifikaci a konfirmaci analytů
ROZHODNUTÍ 2002/657/EC o provádění analytických metod a interpretaci výsledků Vztah mezi typem fragmentace a dosaženým počtem identifikačních bodů Hmotnostně spektrometrická technika Dosažený počet identifikačních bodů na iont Hmotnostní spektrometrie s nízkým rozlišením (LR)MS 1,0 LC-MS n prekurzorový iont 1,0 LC-MS n dceřiný produkt 1,5 Hmotnostní spektrometrie s vysokým rozlišením (HR-MS) 2,0 HR-MS n prekurzorový iont 2,0 HR-MS n dceřiný produkt 2,5 Poznámky: (1) Každý iont může být počítán pouze jednou. (2) GC-MS s elektronovou ionizací a GC-MS s chemickou ionizací se považují za odlišné techniky.
ROZHODNUTÍ 2002/657/EC o provádění analytických metod a interpretaci výsledků Příklady počtu identifikačních bodů
DG SANTE/11813/2017 o validaci metod a QC v analýze reziduí pesticidů