VÝZNAM NĚKTERÝCH FAKTORŮ PREANALYTICKÉ FÁZE V MOLEKULÁRNÍ BIOLOGII Plíšková L., Hrochová K., Kutová R. Ústav klinické biochemie a diagnostiky FN Hradec Králové
PREANALYTICKÁ FÁZE V MOLEKULÁRNÍ BIOLOGII Preanalytická chyba cokoli, co se objeví před vlastní analýzou a má vliv (zhoršení) na výsledek (53 75 %, Plebani 2007 61,9 %) Soustředíme se především na některé faktory, které mají v mol.biologii zásadní vliv na výsledek
TYPICKÉ OBLASTI PREANALYTICKÉ FÁZE K minimalizaci preanalytické variability poskytuje laboratoř svým klientům soubor potřebných informací o přípravě pacienta, odběru materiálu, skladování a transportu vzorku. Příprava pacienta Odběr materiálu Uchování a transport Uchování a úprava vzorku v laboratoři
PŘÍPRAVA PACIENTA Dieta, fyzická zátěž, stres Načasování odběru monitorování léčby zásadní při odběru krve na průkaz bakterií Informovaný souhlas extrahumánní x humánní genom
TYPICKÉ OBLASTI PREANALYTICKÉ FÁZE Příprava pacienta Odběr materiálu Uchování a transport Uchování a úprava vzorku v laboratoři
ODBĚR MATERIÁLU identifikace, shoda s žádankou, žádanka. lokalizace odběru důležité u patogenů odběr ze stejného místa jako pro mikroskopii vhodný odběrový materiál - inhibice (heparin, aktivní uhlí, formaldehyd) - vazba na konkrétní metodu (výtěžnost DNA borélie monitorování ) množství odebraného materiálu zvýšení citlivosti, možnost izolace virové DNA, bakteriální DNA, virové RNA
TYPICKÉ OBLASTI PREANALYTICKÉ FÁZE Příprava pacienta Odběr materiálu Uchování a transport Uchování a úprava vzorku v laboratoři
UCHOVÁNÍ A TRANSPORT Interval mezi odběrem vzorku a příjmem do laboratoře uchování před transportem teplota, doba transport forma transportu, teplota, doba souvisí se stabilitou DNA/RNA Obecně platí: teplota 4 8 st. C, do 72 hod, při delším skladování zamrazit (jak poté dodat do laboratoře?)
UCHOVÁNÍ A TRANSPORT Nejméně validních informací (laboratorní příručky, internet, publikace) Informace v kitech - v rámci protokolu odběr, centrifugace, transport, stabilita, dále izolace, PCR, detekce např. kity Qiagen - artuscmv, artushbv, artushcv plná krev dodat chlazenou, plasma -20 st. C ne heparin - artus EBV, HSV žádná informace experimentální testování stability
UCHOVÁNÍ A TRANSPORT EBV (kopie/ml) CMV (kopie/ml) Teplota Den odběru, izolace a PCR 5. den izolace a PCR 2 8 st. C 9x10 4 7x10 4 2x10 4 2 8 st. C 7x10 2 1x10 3 2x10 3 VZV (Ct) 2 8 st. C 19,27 19,79 16,49 HBV DNA IU/ml 2 8 st. C 2 500 4 370 3 150 RT 3x10 4 2x10 4 2x10 4 HCV (IU/ml) 2 8 st. C 5x10 5 8x10 5 5x10 5 7. den izolace a PCR RT 7x10 4-9x10 4 Pravidla Laboratorní příručka - 5 dnů
TYPICKÉ OBLASTI PREANALYTICKÉ FÁZE Příprava pacienta Odběr materiálu Uchování a transport Uchování a úprava vzorku v laboratoři
UCHOVÁNÍ A ÚPRAVA VZORKU V LABORATOŘI Preanalytická fáze až analytická fáze příjem, centrifugace, alikvotace teplota a doba skladování materiálu (experimentální ověření - předchozí) teplota a doba skladování NA Testování stability DNA u vybraných patogenů pomocí rt PCR, kde je měřitelná hodnota (Ct hodnota nebo absolutní kvantita)
VLIV SKLADOVÁNÍ (1 ROK) NA STABILITU DNA HSV1 DNA (likvor) Mycobacterium TBC (DNA) Analýza po izolaci DNA Analýzy po skladování 12 24 měsíců 190 kopií/ml HSV neprokázána opakovaně Ct = 36,48 Ct = 40,12 (cut-off = 38) Testování 30 vzorků.
PREANALYTICKÁ FÁZE ANALYTICKÁ FÁZE Kde je hranice? Část preanalytické fáze prováděné v laboratoři zasahuje do vlastní analýzy - průkaz DNA bakterií při léčbě ATB (zvolit centrifugaci) - zvolit vhodnou extrakci pro DNA/RNA (mikroorganismus, typ biolog.materiálu) Informace spolupráce s klinikem
Odběr materiálu humánní genom dle požadovaného typu vyšetření typ materiálu DNA RNA typ odběrových zkumavek Informace v laboratorní příručce
ODBĚR MATERIÁLU - HUMÁNNÍ GENOM vhodný typ odběrového materiálu dle typu vyšetření DNA x RNA DNA - germline mutace, somatické mutace, volná plazmatická DNA nádorová fetální RNA total RNA, small RNA, mirna, expresní profily, mutace nesrážlivá krev/kd- vhodný antikoagulační prostředek EDTA, citrát/ NE heparin suchá výtěrovka/konzervační medium tkáň nativní, fixovaná
LOKALIZACE ODBĚRU HUMÁNNÍ GENOM Somatické mutace - hematoonkologie KD, periferní krev, uzliny, CSF - onkologie nádorová tkáň, fixovaný nátěr počet nádorových buněk ovlivňuje výsledek vyšetření
ODBĚR MATERIÁLU - HUMÁNNÍ GENOM vhodný typ odběrového materiálu dle typu vyšetření DNA x RNA DNA - germline mutace, somatické mutace, volná plazmatická DNA nádorová fetální RNA total RNA, small RNA, mirna, expresní profily, mutace nesrážlivá krev- vhodný antikoagulační prostředek EDTA, citrát/ NE heparin KD, tkáň, CSF,..
TYPICKÉ OBLASTI PREANALYTICKÉ FÁZE- humánní genom Příprava pacienta Odběr materiálu Uchování a transport Uchování a úprava vzorku v laboratoři
UCHOVÁNÍ A TRANSPORT interval mezi odběrem vzorku a příjmem do laboratoře Uchování před transportem teplota, doba RNA nesmí se mrazit! Transport forma transportu, teplota, doba definováno v laboratorní příručce dle obecného doporučení dle experimentálních dat
TYPICKÉ OBLASTI PREANALYTICKÉ FÁZE Příprava pacienta Odběr materiálu Uchování a transport Uchování a úprava vzorku v laboratoři
UCHOVÁNÍ A ÚPRAVA VZORKU V LABORATOŘI - DLE TYPU VYŠETŘENÍ příjem, centrifugace, alikvotace teplota a doba skladování (DNA- stabilní, možné opakovaně mrazit X RNA velmi nestabilní, nemrazit) preanalytika až analytika - prolínání - separace buněk, izolace DNA/RNA, reverzní transkripce) - většina komerčních kitů začíná rt PCR preanalytiku neřeší
Stabilita RNA- kvantifikace fúzního transkriptu BCR/ABL metodou rt PCR 80 70 60 50 40 30 4 st. RT 20 10 0 2 24 48 72 144 čas (h)
ZÁVĚR Chyby v preanalytické fázi Rozvoj metod molekulární biologie 21.století Náročné metody Individuální přístup k vzorkům
ZÁVĚR Chyby v preanalytické fázi Rozvoj metod molekulární biologie 21.století Náročné metody Individuální přístup k vzorkům Standardizace metod v laboratoři Standardizace metod mezi laboratořemi př.- European LeukemiaNet (ELN) snaha o standardizaci preanalytické fáze u metody kvantifikace fúzního transkriptu BCR/ABL u CML pacientů
děkuji Vám za pozornost