CHROMOSOMOVÉ ABERACE U MNOHOČETN ETNÉHO MYELOMU - Molekulárn rně cytogenetická analýza plasmatických buněk Zuzana Zemanová 1, Lenka Pavlištov tová 1, Jana Tajtlová 1, Ivan Špička 2, Evžen Gregora 3, Kyra Michalová 1 1 Centrum nádorovn dorové cytogenetiky ÚKBLD, VFN 1.LF UK, Praha 2 I. interní klinika VFN a 1.LF UK, Praha 3 Oddělen lení klinické hematologie, FN Královsk lovské Vinohrady, Praha IGA MZ ČR R NR 8183-4
KLONÁLN LNÍ CHROMOSOMOVÉ ABERACE U MNOHOČETN ETNÉHO MYELOMU (MM). Klasické G-pruhovací techniky patologický nález n aža 40% nemocných Cca 60% případp padů klasické cytogenetické vyšet etření neinformativní v kultivaci pouze hematopoetické buňky s normáln lním m karyotypem. Interfázick zická FISH (I-FISH) patologický nález n aža u 90% nemocných Molekulárn rně-cytogenetická analýza plasmatických buněk (imunofluorescenční značen ení,, separace)
KLONÁLN LNÍ CHROMOSOMOVÉ ABERACE U MNOHOČETN ETNÉHO MYELOMU (MM). početn etní chromosomové odchylky strukturní přestavby složit ité komplexní změny karyotypu
Numerické změny u MM- aneuploidie: Vyskytují se asi u 2/3 pacientů Modáln lní počet chromosomů je jeden z nejdůle ležitějších prognostických faktorů u nově diagnostikovaných pacientů s MM. Hypodiploidie - nejčast astěji monosomie 8 (případn padně částečná ztráta ta 8p21), 13, 14 a X; chybět t můžm ůže e i kterýkoliv další chromosom - špatná prognóza Hyperdiploidie - trisomie 3, 5, 7, 9, 11, 15 a 19 - lepší prognóza
Strukturní přestavby u MM- translokace: nejčast astěji zahrnují IgH lokus v oblasti 14q32; méněm často IgL lokus v oblasti 22q11 t(11;14)(11q13;14q32) - 13-20% nemocných; příznivá prognóza t(4;14)(p16;q32) - 10-13% 13% nemocných t(14;16)(q32;q23) 5% nemocných nepřízniv znivá prognóza t(6;14)(p21;q32) 5% nemocných Další časté partnerské chromosomové oblasti: 1p13, 1q21, 3p11, 6p25, 7q11, 7q32, 8q24, 11q13, 11q23, 12q24, 13q22, 16q24, 18q21, 21q22, 2, 22q11, atd. nepřízniv znivá prognóza Obvykle kryptické přestavby - nelze je detekovat klasickou metodou
Strukturní přestavby u MM - delece: del(13)(q14) 38-54% nově diagnostikovaných pacientů s MM při p I-FISH významný prognostický ukazatel horší až středn ední prognóza Různý rozsah delece, často rozsáhl hlá ztráta ta v oblasti 13q14-13qter pravděpodobn podobně inaktivace kandidátn tního tumor- supresorového genu U většiny v nemocných (až( 90%) ) pravděpodobn podobně dochází ke ztrátám m celého chromosomu 13 (monosomie( 13). q14 qter delece genu p53 (17p13) asi 10% nemocných s MM špatná prognóza onemocnění časná klonáln lní evoluce; můžm ůže e být detekována i při p i dg, ale nález vždy svědčí o progresi patologického klonu. 17 p13.1
Strukturní přestavby u MM - amplifikace: amplifikace genu CKS1B v oblasti 1q21 asi 30% nemocných s MM kratší OS a EFS špatná prognóza onemocnění duplikace x amplifikaxe index amp(1)(q21) prognóza Další popisované chromosomové aberace u MM: přestavby c-myc c genu (asi u 15% nemocných s MM) přestavby 11q13 monosomie 8 nebo delece 8p21 přestavby 1p, atd. Frekvence těchto t aberací relativně nízká prognostický význam není zcela jasný. Často se jedná o sekundárn rní změny vznikající v pozdější ších stádi diích onemocnění během progrese patologického klonu.
METODY Klasická cytogenetická analýza Fluorescenční in situ hybridizace (I-FISH) imunofluorescen fluorescenční monoklonáln lní protil značen ení plasmatických buněk protilátky tky AMCA Anti-Human kappa chain nebo AMCA Anti-Human lambda chain (VECTOR Laboratories TM DNA sondy: Abbott VYSIS TM detekce přestaveb p IgH genu t(11;14)(q13;q32) t(4;14)(p16;q32) detekce aberací 13q14 detekce amplifikací 1q21 (CKS1B) TM ) mfish: 24XCyte color kit (MetaSystems TM TM )
SOUBOR NEMOCNÝCH S MM 128 pacient ientů 74 54 průměrný rný věk: v 58,9 let rozmezí: 27-89 let CMG 2002: 42 nemocných jiné: 86 nemocných Isotyp kappa 67 lambda 49 kappa/lambda 1 neurčenýený 11
Klinické parametry věk % PB albumin β 2 microglobulin hemoglobin LD N platné 128 109 97 83 98 91 N nedefinováno 1 20 32 46 31 38 průměr 58,89 22,681 35,273 5,496 100,703 6,877 medián 59,00 18,600 34,700 3,440 100,500 5,800 sm.odchylka 10,579 20,31296 7,663 6,856 28,027 3,303 minimum 27,00 14,00 1,39 10,70 2,60 maximum 89 94,00 50,80 50,26 154,00 18,60 PB - plasmatické buňky, LD - laktát dehydrogenáza Pearsonχ 2 test, nonparametric Mann-Whitney rank-sum test, Kaplan Meier test, Mantel-Cox test
KONVENČNÍ CYTOGENETICKÁ ANALÝZA: Celkem vyšet etřeno: eno: 128 Úspěšné vyšet etření 116x (90,6%): - normáln lní nález u 87 nemocných (75,0%) - patologický nález n u 29 nemocných (25,0%) Chromosomové aberace: strukturní nebo komplexní přestavby: 22x Aneuploidie: 7x Neúsp spěšné vyšet etření (0 mitos / nehodnotitelné): 12x (9,4%)
monosomie 14 monosomie 13
Cytogenetické nálezy analýza OS Funkce přežívání do exitu p = 0,087 1,0 cytogenetika 1Normální nález 2 Aneuploidie 0,8 3 Strukturní ab. 4 Komolexní ab. 1-censored 2-censored Cum Survival 0,6 0,4 Komplexní aberace 3-censored 4-censored 0,2 0,0 0,00 12,00 24,00 36,00 48,00 60,00 72,00 84,00 96,00 p=0,087 doba do exitu
del(13)(q14) / monosomie 13 13q14 (RB-1) SpectrumOrange 13q34 SpectrumGreen Monosomie 13 LSI 13q14(RB-1)/13q34 1)/13q34 ABBOTT-VYSIS TM del(13)(q14)
I-FISH: 13q14/13q34 Celkem vyšet etřeno: eno: 128 pacient cientů Prokázan zaná aberace 13q: 84 pacientů (65,6%) Normáln lní nález: 44 pacientů del(13)(q14): 14x Monosomie 13: 51x (60,7 0,7%) del(13)(q14)/monoso monosomiemie 13: 10x Jiný nález: n 9x
aberace 13q14 aberace 13q14 - klinické stadium negativní pozitivní jiné celkem Systém Durie-Salmona I/A 12 7 2 21 II/A 4 4 1 9 III/A 11 28 1 40 I/B 0 1 0 1 II/B 1 2 0 3 III/B 4 17 6 27 celkem 32 59 10 101 Mezinárodn rodní prognostický index - ISS aberace 13q14 negativní pozitivní jiné celkem I 13 15 1 29 II 10 15 0 25 III 1 17 1 19 celkem 24 47 2 73
aberace 13q14 analýza EFS Funkce přežívání do relapsu p = 0,042 Cum Survival 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 FISH 13q14 1 Normální nález 2-13/del(13)(q14) 3 Jiný nález 1-censored 2-censored 3-censored monosomie 13 a/nebo del(13)(q14) 0,0 0,00 12,00 24,00 36,00 48,00 60,00 72,00 84,00 96,00 p=0,042 doba do relapsu
Detekce aberací IgH genu IgH normáln lní nález Přestavba IgH LSI IgH Dual Color Break Apart Rearrangement Probe ABBOTT-VYSIS TM
I-FISH aberace IgH genu Celkem vyšet etřeno: eno: 118 pacientů Prokázan zaná aberace IgH: 82 pacientů (69,5%) translokace IgH genu delece IgH genu (různ zné varianty) kombinovaný nález: n přestavba/delece p IgH jiný nálezn 33x 28x 9x 12x
Translokace IgH genu Translokace celkem prokázána u 42 nemocných Samostatná translokace IgH genu Kombinovaný nález n (translokace/delece IgH) 33x 9x t(11;14)(q13;q32) t(4;14)(p16;q32) ostatní 14x 4x 24x t(11;14)(q13;q32)
Různé varianty přestaveb p IgH genu zlom obou alel IgH genu přestavba IgH + hyperdiploidie t(11;14)(q13;q32), ztráta druhého fúzního signálu
Delece IgH genu Delece IgH nemocných genu celkem prokázána u 37 -IgH (delece 14q32/monosomie 14) 11x delece V segmentu IgH genu delece 3 konce 3 IgH genu 16x 1x kombinovaný nález: n přestavba/delece p IgH 9x
Různé varianty delecí IgH genu delece celého genu IgH delece V segmentu IgH delece 3 konce genu IgH LSI IgH Dual Color Break Apart Rearrangement Probe ABBOTT-VYSIS TM
aberace IgH analýza EFS Funkce přežívání do relapsu p = 0,007 Cum Survival 1,0 0,8 0,6 0,4 FISH 14q32 1 normální nález 2 přestavba IgH 3 t(11;14) delece IgH 4 5 6 kombinace jiný nález 1-censored 2-censored 3-censored 4-censored 5-censored 6-censored 0,2 delece IgH přestavby IgH 0,0 0,00 12,00 24,00 36,00 48,00 60,00 72,00 84,00 96,00 p=0,007 doba do relapsu
Analýza EFS kombinované aberace 13q a IgH Funkce přežívání do relapsu p = 0,049 Cum Survival 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 FISH kombinace 1normální nález 2-13q 3 přestavby IgH 4 t(11;14) 5 t(igh) /-13q 6 t(11;14)/-13q 7 del(igh)/-13q 1-censored 2-censored 3-censored 4-censored 5-censored 6-censored 7-censored 0,0 0,00 12,00 24,00 36,00 48,00 60,00 72,00 84,00 96,00 p=0,049 doba do relapsu
ZÁVĚRY Metodou konvenční cytogenetické analýzy jsme detekovali chromosomové aberace celkem u 25% nemocných s MM Metodou I-FISH I jsme prokázali přítomnost p chromosomových aberací u 82,8% nemocných s MM. Aberace 13q byly detekovány celkem u 65,6% nemocných; statistická analýza potvrdila souvislost s pokročilým stadiem onemocnění a kratší dobou přežitp ití do relapsu (p=0,042). Aberace IgH genu byly prokázány celkem u 69,5% nemocných; kromě translokací byly detekovány různé varianty delecí IgH genu; ; statistická analýza potvrdila u nemocných s aberacemi IgH genu (translokace/delece) kratší dobou přežitp ití do relapsu (p=0,007).
SPOLUPRACOVNÍCI: CI: Centrum nádorovn dorové cytogenetiky ÚKBLD, VFN a 1. LF UK Praha Libuše e Babická Lucie Houškov ková Libuše Matuchová Jitka NěmcovN mcová Ivana Vlčkov ková Libuše Folberová Hana Grmelová Kateřina Vítovská Kateřina Jetelová Cytogenetická laboratoř ÚHKT Jana BřezinovB ezinová Šárka Ransdorfová Jela Melicherčíkov ková Dana Konvalinková Lucie Voráčkov ková Jana Limberská 1. interní klinika VFN a 1.LF UK: R. Zounar FN Královsk lovské Vinohrady KlinLab s.r.o.: A. Smolíkov ková,, M. Chrz Klaudiánova nemocnice Mladá Boleslav: J. Obernauerová Nemocnice Liberec: L. Walterová IGA MZ ČR R NR 8183-4