VYLUČOVACÍ CHROMATOGRAFIE. Jana Sobotníková

Rozměr: px

Začít zobrazení ze stránky:

Download "VYLUČOVACÍ CHROMATOGRAFIE. Jana Sobotníková"

Ondřej Hruda
před 5 lety
Počet zobrazení:

1 VYLUČOVACÍ CHROMATOGRAFIE Jana Sobotníková

2 Vylučovací chromatografie (Size Exclusion Chromatography, SEC) gelová filtrační chromatografie (GFC), gelová permeační chromatografie (GPC), gelová chromatografie, gelová filtrace, filtrace molekulovým sítem Princip Látky se dělí podle velikosti a tvaru jejich molekul, tzv. molekulově sítový efekt (nerovnovážný děj) stacionární fáze tvořena nerozpustným inertním gelem, který obsahuje ve své struktuře póry (vyplněny kapalinou) velké molekuly nemohou proniknout do pórů gelu a jsou unášeny mobilní fází exkluze (V 0 ) malé molekuly difundují do pórů gelu (do kapaliny v pórech) a jsou tak zpomalovány oproti molekulám velkým permeace (V max ) uplatňuje se i adsorpce dělených látek na povrchu gelu látky eluují z kolony podle klesající M (velké-střední-malé) SEC 1

3 SEC 2 GELY POUŽÍVANÉ V SEC 1. hydrofilní: dělení ve vodě rozpustných látek/polární org. rozpouštědlech - dextranové gely (Sephadex) - agarózové gely (Sepharosa, Bio-Gel A) - polyakrylamidový kopolymer (Ultrogel, Bio-Gel, Novema) - hydroxy(alkyl)methakrylátové gely (Spheron, Suprema, TSKgel PW) - sulfonovaný ST-DVB kopolymer (Mcx) 2. hydrofobní: dělení látek rozpustných v organických rozpouštědlech - polystyrenový kopolymer (Poragel, Aquapak, Polefin, SDV, TSKgel H) polyesterový kopolymer (Gram) polyvinylacetátové gely (Fractogel PVA) méně bobtnají než hydrofilní gely menší kapacita, méně pórů 3. nebobtnající (aerogely): univerzální, vhodné pro obě skupiny látek ve vysokotlaké GFC i GPC, kompatibilní s vodnou i organickou fází - porézní modifikovaný silikagel (Proteema, TSKgel SW (1), PFG, PolarSil (2)) - porézní skla

4 Podle mechanických vlastností: a) měkké: málo zesítěné polymery (do 10%); mikroporézní struktura, velké bobtnání - použitelné pro tlaky 1 2 MPa, dlouhé analýzy, malý průtok MF - omezená odolnost vůči ph a organickým rozpouštědlům b) poloměkké (semirigidní): více zesítěné polymery (> 20%); makroporézní struktura, omezené bobtnání - použití v rozmezí 5 15 MPa - různá polarita a velikost pórů gelu (kontrola při výrobě) c) tvrdé: anorganické materiály, silikagely, skla; pro tlaky nad 15 MPa Organické gely ve styku s mobilní fází bobtnají. Stupeň bobtnání je závislý na struktuře polymeru (chemické složení, stupeň zesítění) a na druhu mobilní fáze. SEC 3

5 SEC 4

6 KOLONY V SEC uspořádání stejné jako při jiných technikách kapalinové chromatografie (čerpadlo-dávkovač-kolona-detektor-jímač frakcí/počítač) nízkotlaké (skleněné) a vysokotlaké (silnostěnné skleněné, nerezové) kolony kolony musí být naplněny gelem rovnoměrně a bez vzduchových bublin neuplatňuje se trend zmenšování částic prostor mezi částicemi v koloně potřebný pro pohyb a dobrou přístupnost pórů pro makromolekuly VYLUČOVACÍ LIMIT kolony (stacionární fáze) souvisí s velikostí pórů materiálu (10 6 Å, 10 4 Å, 500 Å dělení v rozsahu molárních hmotností g mol -1 do 500 g mol -1 ) individual pore size mixed bed multipore particles SEC 5

SEC 6 Separation Range [Da] Multipore particles 100-60 000 Combination low 100-1 000 000 Combination medium 100-3 000 000 Combination high 100-30 000 000 Combination ultrahigh Separation Range [Da]

7 SEC 6 Separation Range [Da] Multipore particles Combination low Combination medium Combination high Combination ultrahigh Separation Range [Da] Mixed bed linear S Linear M Linear XL Separation Range [Da] Single Porosity Å Å Å Å Å Å Å Å atomová hmotnostní jednotka u 1 u = 1 Da = (1, ±0, ) kg

8 SEC 7 Kalibrační graf pro single porosity a mixed bed SDV kolonu Kolona: styren-divinylbenzenový kopolymer, eluent: THF, standardy: polystyreny

9 mixed bed x single porosity Cirkulační forma SEC: eluát z kolony se pomocí vícecestného ventilu zavádí opět na kolonu opakování separačního děje, zvýšení dělícího výkonu metody bez nutnosti použít více kolon v sérii SEC 8

10 MOBILNÍ FÁZE V SEC mobilní fáze neovlivňuje interakce mezi dělenými látkami a stacionární fází mění stupeň bobtnání gelu a tím velikost pórů, eluční pořadí nemění musí dobře rozpouštět vzorek; nesmí reagovat s náplní kolony, ale musí ji dobře smáčet a umožnit tak průnik do pórů Hydrofobní látky a gely: THF; toluen; xylen; chloroform; dichlormetan; 1- dichlorbenzen; 1,2,4 trichlorbenzen; nižší alkoholy; ethylacetát; aceton; dioxan; DMF; DMSO Hydrofilní látky a gely: voda; roztoky pufrů, methanol, acetonitril ČERPADLA V SEC mobilní fáze se kolonou pohybuje samospádem, na kolonu je i tak přiváděna Nízkotlaká SEC: peristaltická čerpadla (kompatibilita MF a součástí čerpadla) Vysokotlaká SEC: pumpy běžné pro HPLC SEC 9

11 DETEKTORY V SEC Diskontinuální detekce: sbírají se frakce eluátu a pak se obsah dělených látek vyhodnotí vhodnou analytickou metodou Kontinuální detekce: za kolonou připojen nedestruktivní detektor, usnadňuje sběr frakcí 1. spektrofotometrický (UV), refraktometrický, vodivostní 2. light scattering detektor (LSD), viskozimetrický detektor refraktometrický + viskozimetrický + detektor rozptylu světla = triple detection in SEC Detektor rozptylu světla (LSD): reaguje na molekulovou hmotnost analytu, informace o velikosti a konformaci makromolekuly v roztoku - laserový paprsek rozptylován na rozpuštěných polymerních částicích Viskozimetrický detektor: reaguje na vlastnosti molekuly, ne koncentraci - měří specifickou viskozitu vzorku - detekce na základě průchodu kapaliny kapilárou (kapilárami) - určení molekulové hmotnosti analytu + stupeň větvení polymeru SEC 10

12 SEC 11 SEC analýza polymerů za použití gradientové eluce DVB/vinylpyrolidonová kolona (3,9x150 mm) Vzorek: 0,5% styren-akrylonitrilový kopolymer (25% akrylonitril) MF: gradient 100% ACN do 100% THF za 20 minut, průtok 1mL/min SEC analýza agregátů komerčních monoklonálních protilátek kolona TSKgel G3000SW XL (5 mm; 7,8 mm x 30 cm) MF: PBS (phosphate buffred saline, NaCl+KCl+Na 2 HPO 4 +KH 2 PO 4 ), průtok 1 ml/min detekce MALS + RI nm

13 APLIKACE 1. SKUPINOVÉ DĚLENÍ A ODSOLOVÁNÍ oddělení vysokomolekulárních látek jako skupiny od látek nízkomolekulárních, k dělení uvnitř skupin nedochází pokud jsou nízkomolekulární látky anorganické soli nebo jiné disociované ionty, jde o proces odsolování odsolování - oddělení bílkovin, virů a polysacharidů od doprovodných solí (náhrada za zdlouhavou dialýzu - možnost denaturace) odstranění extrakčního činidla fenolu od vzorku nukleových kyselin ukončení reakce nízkomolekulární látky s biopolymerem oddělení koenzymu, substrátu nebo inhibitoru od enzymu SEC 12

14 2. FRAKCIONACE dělení látek s nepříliš odlišnou molekulovou hmotností biochemické laboratoře: purifikace sacharidů, hormonů, enzymů, peptidů, NK, lipidů, AMK, virů a dokonce i buněk organické laboratoře: dělení směsí oligomerů a polymerů široké použití ve farmaceutickém průmyslu v preparativním měřítku Separace mastných kyselin na ST-DVB gelu vylučovací limit kolony 2x10 4 Da (polystyreny) 2 kolony v sérii SEC 13

15 Separace esterů kyseliny ftalové na ST-DVB kopolymeru kolona TSKgel G1000H XL 7,8 mm ID x 30 cm vylučovací limit kolony 1x10 3 Da (polystyreny) 1. polystyren (10 200Da), 2. dioktylftalát (391Da), 3. dibutylftalát (278Da), 4. dipropylftalát (250Da), 5. diethylftalát (222Da), 6. dimethylftalát (194Da), 7. n-propylbenzen (120Da), 8. ethylbenzen (116Da), 9. toluen (92Da), 10. benzen (78Da) MF: THF průtok MF: 1 ml/min detekce: UV při 254 nm SEC 14

16 3. URČENÍ MOLEKULOVÉ HMOTNOSTI látky eluují podle klesající M závislost elučního objemu na velikosti molekul log M = a + b V E log M = a + b V E + c V E2 + d V E 3 (t R = a b log Mr) použitá kolona se okalibruje standardy o známé M z elučního objemu neznámé látky se určí její molekulová hmotnost okalibrovanou kolonu lze využít pro určení distribuce biopolymerů a syntetických polymerů určí se velikost jednotlivých polymerů a jejich kvantitativní zastoupení ve směsi SEC 15

17 SEC 16

18 4. STUDIUM VAZBY LIGANDU NA BIOPOLYMER kolona naplněná gelem (Sephadex G25) je ekvilibrována/promývána MF obsahující ligand přídavek známého množství proteinu vážícího daný ligand vyvázání ligandu ze SF z navázaného množství ligandu na gel při různých koncentracích v MF a z množství vneseného proteinu lze vypočítat charakteristiky interakce protein-ligand (vazebná konstanta a stechiometrie vazby) SEC 17

Podobné dokumenty

Gelová permeační chromatografie

Gelová permeační chromatografie (Gel Permeation Chromatography - GPC) - separační a čisticí metoda - umožňuje separaci skupin sloučenin s podobnou molekulovou hmotností (frakcionace) - analyty jsou po