Separační metody používané v proteomice

Rozměr: px

Začít zobrazení ze stránky:

Download "Separační metody používané v proteomice"

Lenka Mašková
před 7 lety
Počet zobrazení:

1 Separační metody používané v proteomice

2 Proteome = komplexní směsi proteinů Lidská buňka 10,000 typů proteinů Rozdíl v koncentraci 10 6,plasma10 9 Nutnost separace, frakcionace Na úrovni Proteinů Obtížně identifikovatelné, je nutné měřit velké molekulové hmotnosti, s velkým rozlišením lze pomocí FTICR Peptidů štěpení

3 Proteinové štěpení Chemické CNBr M Enzymatické Vysoce specifické Trypsin K, R AspN - D GluC E ArgC R LysC - K Méně specifické Chymotrypsin - aromatické Pepsin F,L,W,Y Nespecifické Proteináza K

4 Vlastnosti proteinů, peptidů pi mw Hydrofobicita

6 Alanine Valine Aspartic acid

8 Rozložení aminokyselin v proteinech podle četnosti

9 Separační metody Elektromigrační metody SDS PAGE 2DE IEF SDS PAGE Nativní elektroforéza Kapilární elektroforéza Free flow eletrophoresis Chromatografické metody Jednorozměrná Na reverzní fázi Iontově výměnná Gelová chromatografie Hydrofilní Afinitní Vícerozměrná 2D nejčastěji SCX+RP Chromatofokusace Beckman-Coulter

10 Elektromigrační metody 1DE - SDS PAGE 2DE IEF SDS PAGE Nativní elektroforéza Kapilární elektroforéza Free flow electrophoresis

11 Elektromigrační metody SDS polyakrylamidová gelová elektroforéza (PAGE) Molekulová hmotnost

12 Elektromigrační metody isoelektrická fokusace Separace proteinů v závislosti na isoelektrickém bodě IPG proužky imobilizovaný ph gradient Různý Gradient ph 3-10, 4-7, 6-11, 4,5-5,5

13 Elektromigrační metody Dvoudimensionální elektroforéza 2-DE IEF SDS PAGE MS analýza +

14 Elektromigrační metody + Dvoudimensionální elektroforéza 2-DE První dimense pi pi 10 _ Druhá dimense - - Polyakrylamid rylamidový gel

15 Elektromigrační metody 2-DE Vizualizace proteinů: Citlivost Kompatibilita s identifikací Dynamický rozsah Stříbření Modření koloidní coomasie modří Fluorescenční barvení Sypro Ruby

16 Elektromigrační metody 2-DE

17 Elektromigrační metody DIGE - Differential gel electrophoresis Modifikace 2DE vzorky označené různou flourescenční barvou CY-2, CY-3, CY-5 různé maximum excitační energie

18 Elektromigrační metody Nativní elektroforéza Elektroforéza bez denaturačních činidel a detergentů Zachovává aktivní konformaci proteinů Lze testovat aktivitu Lze purifikovat velké komplexy Modrá nativní elektroforéza BN Coomasie modř, udává proteinům negativní náboj V kombinaci s SDS PAGE 2D BN/SDS PAGE

19 2-D BN/SDS-PAGE membránových proteinových komplexů E. coli J.-P. Lasserre et al. Electrophoresis 2006, 27,

20 Elektromigrační metody Kapilární elektroforéza Vysoké rozlišení spojení s MALDI Nekompatibilní s ESI, příliš solí v pufrech

21 Elektromigrační metody Free Flow electrophoresis Metoda založená na principu isoelektrické fokusace v roztoku Vysoké rozlišení Odpadá problém s precipitací proteinů v gelu Obdobný princip ROTOFOR ZOOM

22 Chromatografické metody HPLC vysokotlaká kapalinová chromatografie Jednorozměrná Na reverzní fázi Iontově výměnná Gelová chromatografie Hydrofilní Afinitní Vícerozměrná 2D nejčastěji SCX+RP Nízkotlaká chrom. - FPLC Extrakce na tuhé fázi - SPE video

23 Chromatografické metody HPLC - Reverzní fáze (RP) Sorbent - stacionární fáze - je hydorfóbní náplň Uhlovodíkový řetězec navázaný na: silikagelu polymeru Hydrofobicita Různý počet uhlíků C4, C8, C18 Mobilní fáze Vodný roztok s přídavkem TFA nebo kys. mravenčí Gradient tvořený organickým rozpouštědlem ACN Hydrofóbní řetězec rozměry kolony velikost částic porozita Příklad označení kolony: C18, 75 um x 15 cm, 3um, 300Å

24 Chromatografické metody HPLC -RP mv Rozdělení směsi 9-ti peptidů UV detekce -8,40-8,60-8,80-9,00-9,20-9,40-9,60 1-9,80-10,00-10,20 mv -7,00-7,50-8,00-8,50-9, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,423 Rozdělení tryptického digestu hemoglobinu UV detekce -9, ,00-10,68 0,0 2,5 5,0 7,5 10,0 12,5 15,0 17,5 20,0 22,5 25,0 27,5 30,0 32,5 35,0 37,5 40,0 42,5 45,0 47,5 50,0 52,5 56,0 min

25 Chromatografické metody Iontově výměnná chromatografie Separace probíhá na základě afinity nabitých proteinových/peptidových částic ke stacionární fázi Eluce probíhá vyplavením pufru o větší iontové síle krokově gradientově Kationtově výměnná Aniontově výměnná

26 Chromatografické metody Gelová chromatografie (size exclusion chrom.) Větší částice se pohybují rychleji než malé, které jsou brzděny interakcí s póry gelu Spíše jako hrubá frakcionace

27 Chromatografické metody Afinitní chromatografie Vazba proteinu přes specifickou vazebnou schopnost Substrát Protilátka Využíváno např. pro odstranění proteinů o veliké koncentraci ze séra Až 20 nejkoncentrovanějších (albumin, immunoglobuliny) purifikaci proteinových komplexů

28 Ukázka specificity separačních technik

29 Chromatografické metody Multidimenzionální kapalinová chromatografie Iontově výměnná + na reverzní fázi SCX-RPLC, WAX-RPLC Gelová permeační + na reverzní fázi SEC-RPLC Afinitní + na reverzní fázi AC-RPLC Na reverzní fázi + kapilární elektroforéza RPLC-CE

30 Chromatografické metody 2D-LC SCX kolona 1. dimenze nástřik trap RP odpad pumpa pumpa peptidová směs RP kolona 2. dimenze MS (ESI) štěpení proteinová směs (celý lysát, frakce)

31 Chromatografické metody Separace komplexních peptidových směsí Benefit: Drawback: Sensitive Not Robust Yates J.R. (1999) Nature Biotechnol. 17, Yates J.R. (2001) Nature Biotechnol. 19,

32 Chromatografické metody 2DLC MS - příklady SCX-RPLC Kvasinky 1484 proteinů (Washburn et al, Nat. Biotech, 19, 2001, ) Nano 2D-LC 100 fmol BSA proteinů E.coli / analýzu (celkem 500) (Nagele et al, J.Chromatogr. A, 1009, 2003, )

33 Chromatografické metody Analýza HMEC (human mammary epithelial cells) Lyzát celých buněk Gelová permeační chromatografie 6 frakcí Digesce (trypsin) 1574 proteinů SCX separace RP separace 114 frakcí (NET evaluace) 5836 jedinečných peptidů MSMS spekter (LCQ Thermo Finnigan) peptidů Jacobs et al., J. Proteome Res, 2004, Vol 3, No.1

34 Separace organel - frakcionace Analýza subproteomu Cytoplasma Membrány G- Bakterie Vnější Vnitřní Mitochondrie, chloroplasty Fagozómy, jiné buněčné váčky Jádro

35 Frakcionace Diferenciální centifugace různé sedimentační schopnosti organel Zónální centrifugace gradient Sacharóza, ClCs

Podobné dokumenty

Separační metody používané v proteomice

Separační metody používané v proteomice Pavel Řehulka rehulka@pmfhk.cz Analýza proteomu analýza komplexní směsi proteom = soubor vyprodukovaných bílkovin v daném typu buněk nebo organismu v daném čase