Laboratorní diagnostika klíšťové encefalitidy a dalších

Transkript

1 Laboratorní diagnostika klíšťové encefalitidy a dalších flavivirových neuroinfekcí Hana Zelená Jan Raszka Jiří Januška Zdravotní ústav se sídlem v Ostravě Centrum klinických laboratoří Virologické i oddělení NRL ČR pro arboviry

2 Čeleď Flaviviridae,, Rod Flavivirus ICTV taxonomie ~ 80 druhů a poddruhů, 10 genoskupin skupina savčích virů přenášených klíšťaty v. klíšťové encefalitidy (podtypy: evropský, sibiřský a dálněvýchodní) v. Louping-ill v. Omské hemoragické horečky skupina v. dengue vv. dengue 1-4 skupina v. japonské encefalitidy v. japonské encefalitidy v. West Nile v. Usutu skupina v. žluté zimnice v. žluté zimnice

3 Čeleď Flaviviridae,, Rod Flavivirus ICTV taxonomie ~ 80 druhů a poddruhů, 10 genoskupin skupina savčích virů přenášených klíšťaty v. klíšťové encefalitidy (podtypy: evropský, sibiřský a dálněvýchodní) v. Louping-ill v. Omské hemoragické horečky skupina v. dengue vv. dengue 1-4 skupina v. japonské encefalitidy v. japonské encefalitidy v. West Nile v. Usutu skupina v. žluté zimnice v. žluté zimnice

4 Čeleď Flaviviridae,, Rod Flavivirus ICTV taxonomie ~ 80 druhů a poddruhů, 10 genoskupin skupina savčích virů přenášených klíšťaty v. klíšťové encefalitidy (podtypy: evropský, sibiřský a dálněvýchodní) v. Louping-ill v. Omské hemoragické horečky skupina v. dengue vv. dengue 1-4 skupina v. japonské encefalitidy v. japonské encefalitidy v. West Nile v. Usutu skupina v. žluté zimnice v. žluté zimnice

5 Laboratorní vyšetřovací metody Přímá diagnostika průkaz viru nebo jeho části pozitivní v časné fázi infekce (během ě virémie) u flavivirových neuroinfekcí omezený význam kultivace virů (izolační pokus) elektronová mikroskopie průkaz antigenu molekulárně genetické metody (PCR) Nepřímá diagnostika průkaz protilátek komplementfixační reakce (KFR) virusneutralizační test (VNT) ELISA nepřímá imunofluorescence (NIF) imunoblot celkové Ig IgG IgM avidita IgG intrathekální protilátky

6 Kultivace virů (izolační pokus) neselektivní metoda trvání pokusu 1-2 týdny (alespoň 2 pasáže) nezbytný správný odběr a rychlý transport t vzorku do laboratoře ř buněčné kultury pokus na zvířeti buněčné linie CV-1, PS cytopatický efekt (CPE) intracerebrální inokulace sajících myší pro arboviry nejcitlivější onemocnění a úhyn zvířat buňky CV-1 - částečný CPE buňky CV-1 - totální CPE

7 Průkaz antigenu KFR nebo VNT pro identifikaci i izolovaného viru komerční kity pro detekci cirkulujících antigenů v krvi vv. dengue: NS-1 antigen metoda ELISA

8 Molekulárně genetické metody rychlá diagnostika vysoká citlivost pro flaviviry většinou home made druhově nebo rodově specifické Metody: RT-PCR v reálném čase nested-pcr sekvenace

9 Komplementfixační reakce (KFR) pro průkaz akutní infekce nutné vyšetření párových sér zkřížené reakce s jinými flaviviry, možnost záchytu infekce jiným flavivirem princip: vyvazování komplementu z reakční směsi specifickými komplexy Ag-Ab Ab zábrana hemolýzy senzibilizovaných ovčích erytrocytů kvantifikace stanovením KF titru KF titr: převrácená ř á hodnota nejvyššího ředění í séra (likvoru), která za přítomnosti antigenu ještě váže komplement komplement nejlépe vážou protilátky IgM, proto nejvyšší KF titry jsou v akutní fázi infekce interpretace výsledků: negativita: KF titr = 0 séropozitivita: KF titr 4 akutní infekce: sérokonverze nebo minim. 4-násobný vzestup titru v párových sérech KF titr 128 v jediném vzorku vysoce suspektní

10 kontrolní antigen pozitivní antigen ředění séra KFR č. vzorku 4

11 Virusneutralizační test nejspecifičtější sérologická metoda pro průkaz akutní infekce nutné vyšetření párových vzorků sér princip: specifické protilátky neutralizují infekčnosti viru ochrana buněk před cytopatickým efektem viru použití vitálního barviva (neutrální červeň) zabarví se pouze živé nepoškozené buňky možnost makroskopického odečtení výsledku výsledky: VNtitr=převrácená hodnota nejvyššího ředění séra, které je ještě schopno neutralizovat cytopatický efekt viru u více než 50% buněk interpretace výsledků: negativita: VN titr = 0 séropozitivita: VN titr 4 akutní infekce: sérokonverze nebo minim. 4-násobný vzestup titru v párových sérech KF titr 128 v jediném vzorku vysoce suspektní

12 Virusneutralizační test (VNT)

13 Využití VNT zlatý standard v sérologické diagnostice flavivirů konfirmační vyšetření např. atypická protilátková odpověď subklinický nebo netypický průběh infekce nespecifické a zkřížené reakce přítomnost protilátek proti jiným flavivirům (jap. enc., žl. zimnice, dengue, West Nile) stanovení úrovně ochrany po očkování diagnostika selhání očkování dynamika v párových sérech Nevýhody: trvání 5-7 dní nerozliší třídy protilátek práce s živým virem a s buněčnými kulturami vyhrazeno pro specializované laboratoře

14 ELISA využívá vazby antigenu s protilátkou vázané na pevné fázi, enzymem značená protilátka (konjugát), vznik barevných produktů rychlá, jednoduchá metoda, komerčně dostupné kity rozliší třídy protilátek různé varianty uspořádání reakce nepřímá metoda (sandwich) IgM, IgG, avidita IgG capture IgM vyšší citlivost i specificita kompetitivní ELISA pro průkaz celkových specifických Ig, lze detekovat protilátky u různých živočišných druhů semikvantitativní stanovení v relativních číslech (index pozitivity = IP) - porovnáním hodnoty absorbance vzorku s referenční hodnotou

15 Avidita IgG protilátek Avidita vyjadřuje pevnost vazby mezi antigenem a protilátkou, úroveň rezistence vazby Ag-AbAb vůči denaturujícím látkám. Na začátku imunitní odpovědi (primární infekce, očkování) nejprve produkce IgG protilátek s nízkou aviditou. S vyzráváním imunitní odpovědi postupné zvyšování podílu protilátek s vysokou aviditou. Při reinfekci nebo reaktivaci paměťové B-buňky ihned tvorba protilátek s vysokou aviditou. Vyšetření avidity IgG = stanovení pevnosti vazby Ag- Ab po přidání denaturačního činidla (urey) do reakční směsi. ě Protilátky s nízkou aviditou jsou působením urey z vazby uvolněny a odstraněny ypromytím. Protilátky s vysokou aviditou urea neuvolní.

16 Vyšetření avidity IgG metodou ELISA Séra pacientů se testují paralelně ve 2 jamkách v 1 z nich se nechá působit urea, 2. jamka ponechána bez urey. Na konci testu porovnáme naměřenou optickou denzitu v jamce s ureou a bez urey, podíl vyjadřujeme v %. Ag Ag Ag Ag Ag Ag Ag Ag

17 Vyšetření avidity IgG metodou ELISA Séra pacientů se testují paralelně ve 2 jamkách v 1 z nich se nechá působit urea, 2. jamka ponechána bez urey. Na konci testu porovnáme naměřenou optickou denzitu v jamce s ureou a bez urey, podíl vyjadřujeme v %. IgG IgG Ag Ag Ag Ag Ag Ag Ag Ag

18 Vyšetření avidity IgG metodou ELISA Séra pacientů se testují paralelně ve 2 jamkách v 1 z nich se nechá působit urea, 2. jamka ponechána bez urey. Na konci testu porovnáme naměřenou optickou denzitu v jamce s ureou a bez urey, podíl vyjadřujeme v %. IgG IgG U U U U Ag Ag Ag Ag Ag Ag Ag Ag

19 Vyšetření avidity IgG metodou ELISA Séra pacientů se testují paralelně ve 2 jamkách v 1 z nich se nechá působit urea, 2. jamka ponechána bez urey. Na konci testu porovnáme naměřenou optickou denzitu v jamce s ureou a bez urey, podíl vyjadřujeme v %. IgG Ag Ag Ag Ag Ag Ag Ag Ag

20 ELISA avidita IgG

21 ELISA avidita IgG IgG s vysokou aviditou IgG s nízkou aviditou

22 Nepřímá imunofluorescence IgG, IgM, IgA rychlá metoda, komerční soupravy princip: antigen = buňky infikované virem na sklíčku vazba specifických protilátek ve vzorku sekundární protilátka značená fluorescenčním barvivem odečet ve fluorescenčním mikroskopu nevýhody: nespecifcké a zkřížené reakce subjektivita nehodí se pro vyšetření velkého množství vzorků

23 Nepřímá imunofluorescence Toscana IgG 1:40 Toscana IgM 1:80

24 Laboratorní diagnostika klíšťové encefalitidy dvoufázový průběh 1. fáze (febrilie): PCR, izolace viru z krve 2. fáze (neurologická): průkaz protilátek (PCR negativní v krvi i v likvoru) IgM i IgG v séru zpravidla hned v úvodu neurologickié fáze Je-li v 1. vzorku pozit. jen IgM (a IgG je negativní), nutno vyšetřit 2. vzorek s odstupem cca 1 týdne. nízká avidita IgG (<40%) při akutním onemocnění IgM mohou přetrvávat i několik měsíců (až rok), IgG celoživotně význam avidity IgG pro stanovení recentní infekce.

25 Dynamika diagnostických markerů u klíšťové encefalitidy

26 Dynamika diagnostických markerů u klíšťové encefalitidy

27 Dynamika diagnostických markerů u klíšťové encefalitidy

28 Vyšetření likvoru u klíšťové encefalitidy Přímý průkaz (PCR, izolace viru): Téměř vždy negativní, ale v případě úmrtí bývá pozit. záchyt v mozku. Sérologie: Likvor obsahuje cca 500x méně protilátek než sérum nižší % pozitivity, záleží na citlivosti metody. nepřímé metody IgG, IgM likvor cca v 50-70% pozitivní, později než v séru capture IgM likvor téměř ve 100% pozitivní KFR zpravidla negativní VNT bývá slabě pozitivní nebo negativní Intrathekální produkce protilátek porovnání hladiny protilátek v séru a v likvoru, výpočet dle Reibera v průběhu klíšťové encefalitidy dochází k intrathekální produkci protilátek velký význam u případů KE u očkovaných

29 Diagnostika klíšťové encefalitidy u očkovaných vždy vyšetření párových vzorků s odstupem dt minimálně ii álě 1 týdne, případně 3. vzorek za další týden vždy konfirmace metodou VNT průkaz akutní infekce u očkovaných: minimálně 4- násobný vzestup titru ve VNT (případně p KFR) IgM je pozitivní nebo negativní, nebo IgM se objeví později (za 7-10 dní) avidita IgG je u očkovaných vysoká i při vysokých hodnotách IgM vyšetření pouze ELISA testy je nedostatečné kvantifikace je nespolehlivá, a to i u tzv. kvantitativních ELISA souprav stanovení intrathekální produkce protilátek

30 Selhání očkování 1. kazuistika pozitivní hodnoty anti/tbev IgM (IP)* souprava A 1,65 4,28 1,1515 >1,11 anti/tbev IgM (IP)* souprava B 2,08 7,68 6,78 1,1 anti/tbev IgM capture (IP)* souprava C 3,50 13,65 13,63 >1,5 anti/tbev IgG (AU/ml)** souprava A > 22 anti/tbev IgG (RU/ml)** souprava B anti/tbev total Ig (IP)* souprava C 3,63 4,32 4,56 >1,5 anti/tbev KFR anti/tbev VNT * IP i d iti it ( ik tit ti í ý l dk ) * IP = index pozitivity (semikvantitativní výsledky) ** Arbitrární jednotky kvantitativní výsledky

31 Selhání očkování 2. kazuistika pozitivní hodnoty anti/tbev IgM (IP)* souprava A neg , ,80 >1,11 anti/tbev IgM capture (IP)* souprava C neg. 3,03 7,80 >1,5 anti/tbev IgG (AU/ml)** souprava A > 22 anti/tbev total Ig (IP)* souprava C 5,48 7,09 8,57 >1,5 anti/tbev KFR anti/tbev VNT * IP = index pozitivity (semikvantitativní výsledky) ** Arbitrární jednotky kvantitativní výsledky

32 Diagnostika sibiřského a dálněvýchodního typu VKE stejné diagnostické metody jako u evropského typu možné rozlišení pouze na základě VNT provedeného paralelně srůznými subtypy virů porovnání VN titrů prakticky pa tc rozlišení na základě anamnestických a estc údajů

33 West Nile virus Čeleď: Flaviviridae, skupina virů japonské encefalitidy Rezervoár: ptáci Vektor: komár rodu Culex Výskyt: do r Evropa, Asie, Afrika 1999 virus zavlečen do USA případů ročně typ 1 do r. 2008: Izrael, Rusko, Rumunsko, Francie, Itálie, Španělsko, Portugalsko, sev. Afrika typ Maďarsko, Rakousko typ Řecko typ 2 ČR: 1997 a 1999 izolace typu 3 Rabensburg na J. Moravě suspektních případů na J.Moravě ČR import: z USA, 2007 pravděp. z Kypru Inkubační doba: 2-14 dní Klinika: bezpříznakový průběh (~80%) západonilská horečka (~20%) infekce CNS (<1%) smrtnost ~10%

34 Laboratorní parametry infekce WNV

35 West Nile v. laboratorní diagnostika přímý průkaz (PCR, izolace) málo výtěžné, virémie končí s nástupem klinických příznaků záchyt viru v likvoru velmi průkazný, avšak málokdy úspěšný sérologie průkaz specifických protilátek průkaz IgM, IgG v krvi a v likvoru (komerční sety ELISA, NIF) nízká specificita časté zkřížené reakce s jinými flaviviry, u nás zejména s VKE (až 75% v IgG a 12% v IgM) vždy nutná konfirmace VNT! minimálně 4-násobný vzestup nebo sérokonverze v párových sérech pro průkaz akutní infekce

36 Japonská encefalitida Čeleď: l Flaviviridae, i id skupina virů ů japonské encefalitidy Rezervoár: koně, prasata Vektor: komár rodu Culex Výskyt: JV Asie prokázaných případů ročně úmrtí ročně Inkubační doba: 5-15 dní Klinika: bezpříznakový nebo subklinický průběh ~ 99% meningoencefalitida < 1% smrtnost 30%, trvalé následky 50%

37 Japonská encefalitida

38 Japonská encefalitida laboratorní diagnostika Přímý průkaz (PCR, průkaz antigenu) z krve nebo likvoru: jen v prvních dnech infekce izolace viru se běžně neprovádí vysoce rizikové agens! (nutná laboratoř BSL4) Sérologie: IgM a IgG komerční soupravy NIF KFR časté zkřížené reakce s jinými flaviviry konfirmace VNT vždy nutno vyšetřit paralelně i na jiné běžnější flaviviry klíšťovou encefalitidu, dengue

39 Virus Usutu Čeleď: Flaviviridae, skupina virů japonské encefalitidy 1959: izolace z komárů v J. Africe ve Svazisjku; známý výskyt jen v subsaharské Africe 2001: masivní úhyn ptáků v Rakousku v okolí Vídně (kos, puštík, vlaštovka) izolován virus Usutu 2003: detekce protilátek proti u migrujících ptáků ve Velké Británii : izolace viru Usutu z uhynulých kosů v Maďarsku v regionu Budapešti testováno 332 ptáků, z toho 33 kosů, z nich 9 pozitivních na virus Usutu 2006: izolace viru Usutu ve Španělsku z komárů Culex pipiens 2009: 2 případy fatální neuroinfekce u imunosuprimovaných osob v Itálii

40 Úskalí v diagnostice flavivirových infekcí Vzácné infekce absence komerčních souprav. Vysoce riziková ik agens vyhrazeno pouze pro laboratoře ř BSL-3 a 4. Krátká doba virémie u flavivirových neuroinfekcí, pozdní odběr vzorku přímá diagnostika málokdy úspěšná. Sérologie velmi časté zkřížené a nespecifické reakce, interpretace t obtížná, někdy nemožná (pacient je pozitivní na všechny flaviviry): zásadní je detailní anamnéza (cestování, očkování, prodělané nemoce) paralelní vyšetření na různé flaviviry konfirmace VNT Obezřetnost v interpretaci výsledků sérologie flavivirů, zejména: uočkovaných u osob po prodělané flavivirové infekci u osob opakovaně cestujících do rizikových oblastí

41 Přehled vyšeteřní dostupných v NRL ČR pro arboviry (ZÚ Ostrava) V indikovaných případech lze zajistit diagnostiku dalších V indikovaných případech lze zajistit diagnostiku dalších arbovirů v zahraničí.

42 Děkuji Vám za pozornost...