HE4 EIA IVD FOR INFORMATION ONLY. WHEN PERFORMING THE ASSAY ALWAYS REFER TO PACKAGE INSERT SUPPLIED WITH THE KIT. Návod k použití

Transkript

1 FOR INFORMATION ONLY. WHEN PERFORMING THE ASSAY ALWAYS REFER TO PACKAGE INSERT SUPPLIED WITH THE KIT IVD HE4 EIA REF CS Návod k použití EN BG CS DA DE EL ES ET FR HR HU IT LT LV NL NO PL PT RO RU SV SK SL SR TR EXPLANATION OF SYMBOLS ОБЯСНЕНИЕ НА СИМВОЛИТЕ VÝZNAM SYMBOLŮ SYMBOLFORKLARING ERKLÄRUNG DER SYMBOLE ΕΠΕΞΗΓΗΣΗ ΤΩΝ ΣΥΜΒΟΛΩΝ SIGNIFICADO DE LOS SÍMBOLOS SÜMBOLITE SELGITUS EXPLICATION DES SYMBOLES OBJAŠNJENJE SIMBOLA JELMAGYARÁZAT SPIEGAZIONE DEI SIMBOLI SIMBOLIŲ PAAIŠKINIMAI SIMBOLU SKAIDROJUMS VERKLARING DER SYMBOLEN SYMBOLFORKLARING OBJAŚNIENIE SYMBOLI EXPLICAÇÃO DOS SÍMBOLOS SEMNIFICAŢIA SIMBOLURILOR ОБОНАЧЕНИЯ SYMBOLFÖRKLARING VÝZNAM SYMBOLOV RAZLAGA SIMBOLOV OBJAŠNJENJE SIMBOLA SEMBOLLERİN AÇIKLAMALARI Use By/Годно до/použitelné do/ Holdbar til/verwendbar bis/ Ημερομηνία λήξης/fecha de caducidad/kõlblik kuni/ Utiliser jusque/rok valjanosti/ Felhasználható/Utilizzare entro/ Sunaudoti iki/izlietot līdz/houdbaar tot/brukes innen/użyć przed/ Prazo de validade/expiră la/ Использовать до/använd före/ Použite né do/ Uporabno do/ Upotrebljivo do/son Kullanma Tarihi Batch code/номер на партида/ Číslo šarže/lotnummer/ Chargenbezeichnung/Αριθμός Παρτίδας/Código de lote/partii kood/code du lot/kod serije/ Sarzsszám/Codice del lotto/ Partijos kodas/partijas kods/lot nummer/partikode/kod partii/ Código do lote/număr de lot/ Номер лота/lotnummer/číslo šarže/številka serije/kod partije/ Parti Kodu 1

2 IVD REF Date of manufacture/дата на производство/datum výroby/ Produktionsdato/Herstellungsdatum/ 2 o C Ημερομηνία παραγωγής/fecha de fabricación/valmistamise kuupäev/ Date de fabrication/datum proizvodnje/ Gyártási idő/data di produzione/ Pagaminimo data/ražošanas datums/ Productiedatum/Fremstillingsdato/ Data produkcji/data de fabrico/data fabricaţiei/дата производства/ Tillverkningsdatum/Dátum výroby/datum izdelave/datum proizvodnje/üretim tarihi In Vitro Diagnostic Medical Device/ Медицински уред за диагностика ин витро/diagnostický zdravotnický prostředek in vitro/medicinsk udstyr til in vitro-diagnostik/in-vitro-diagnostikum/ Ιατροτεχνολογικό προϊόν για διάγνωση In Vitro/Dispositivo médico para diagnóstico in vitro/in vitro diagnostiline meditsiiniseade/dispositif médical de diagnostic in vitro/diagnostički medicinski uređaj In Vitro/In vitro orvosdiagnosztikai eszköz/dispositivo medico per test diagnostici in vitro/in Vitro Diagnostinė Medicinos Priemonė/Medicīniska ierīce in vitro diagnostikai/in vitro-diagnostisch medisch instrument/in vitro diagnostisk medisinsk utstyr/wyrób medyczny do diagnostyki in vitro/dispositivo Médico de Diagnóstico In Vitro/Dispozitiv medical pentru diagnostic in vitro/только для диагностики In Vitro/Endast för in vitro-diagnostik/ Zdravotnícka pomôcka na diagnostiku in vitro/in vitro diagnostični pripomoček/diagnostički medicinski uređaj In Vitro/<96> testleri için yeterlilik içerir Catalogue number/каталожен номер/ Katalogové číslo/katalognummer/ Bestellnummer/Αριθμός καταλόγου/ Número de catálogo/kataloogi number/ Numéro de catalogue/kataloški broj/ Katalógusszám/Numero di catalogo/ Katalogo numeris/numurs katalogā/ Catalogusnummer/Katalognummer/ Numer katalogowy/número do catálogo/ Număr de catalog/номер по каталогу/ Produktnummer/Katalógové číslo/ Kataloška številka/kataloški broj/ Katalog numarası 2 8 o C Temperature limitation/ Температурни граници/ Teplotní omezení/ Temperaturbegrænsning/ Temperaturbegrenzung/ Περιορισμοί θερμοκρασίας/ Límites de temperatura/ Temperatuuri piirang/ Limite de température/ Temperaturno ograničenje/ Hőmérsékletre vonatkozó korlátozás/ Limiti di temperatura/ Temperatūriniai apribojimai/ Temperatūras ierobežojums/ Temperatuurbeperking/ Temperaturbegrensninger/ Temperatury graniczne/ Limite de temperatura/ Limite de temperatură/ Температурный режим/ Temperaturbegränsning/ Teplotné obmedzenie Omejitev temperature/ Temperaturno ograničenje/ Sıcaklık sınırlaması/ Contains sufficient for <96> tests/съдържа достатъчно количество за тестове <96>/Lze použit pro <96> testů/indeholder tilsttrækkeligt/inhalt ausreichend für <96> Prüfungen/Περιεχόμενο επαρκές για «96» εξετάσεις/contenido suficiente para <96> ensayos/kogusest piisab <96> testi läbiviimiseks/contenu suffisant pour 96 tests/sadrži dovoljno za <96> testova/a doboz tartalma <96> vizsgálat elvégzéséhez elegendő/contenuto sufficiente per 96 saggi/turinys skirtas atlikti <96> tyrimus/ Saturs pietiekams <96> testiem/inhoud voldoende voor 96 testen/til 96 test/ Tilstrekkelig innhold for <96> prøver/ Wystarczy na wykonanie <96> testów/ Conteúdo suficiente para 96 ensaios/ Conţinut suficient pentru 96 de teste/ Содержит достаточные количества для «96» определений/innehåller tillräckligt till 96 antal tester/obsah postačuje na tento počet testov: <96>/Vsebina zadostuje za <96> testov/sadržina dovoljna za <96> testova/<96> testleri için yeterlilik içerir

3 CONT Consult Instructions for Use/ Прочетете инструкцията за употреба/konzultujte s návodem k použití/se brugsanvisning/siehe Gebrauchsanweisung/Συμβουλευτείτε τις Οδηγίες σχετικά με τη χρήση/ Consulte las instrucciones de uso/ Vt kasutusjuhendit/consulter le mode d emploi/pročitajte upute za uporabu/ Olvassa el a használati utasítást/ Consultare le istruzioni per l uso/dėl naudojimo žiūrėkite instrukcijas/izlasiet lietošanas instrukciju/raadpleeg de instructies voor gebruik/les instruksene før bruk/sprawdzić w instrukcji użycia/ Consulte as Instruções de Utilização/ Consultaţi instrucţiunile de utilizare/ Обратитесь к инструкции по применению/se bruksanvisning/ Prečítajte si návod na používanie/ Pročitajte uputstvo za upotrebu/ Kullanım Talimatlarına Bakınız Contents of kit/съдържание на набора/ Obsah soupravy/kittets indhold/inhalt des Kits/Περιεχόμενα του κιτ/contenido del kit/komplekt sisaldab/contenu du kit/sadržaj opreme/a készlet tartalma/ Contenuto del kit/rinkinio turinys/ Komplekta saturs/inhoud van de set/ Settets innhold/zawartość zestawu/ Conteúdo do kit/conţinutul setului/ Компоненты набора/kit innehåll/ Obsah súpravy/vsebina kompleta/sadržaj opreme/kitin içindekiler Biological risks/биологическа опасност/biologická rizika/biologisk fare/biologische Gefahren/Βιολογικοί κίνδυνοι/riesgos biológicos/ Bioloogilised ohud/risques biologiques/ Biološkli rizici/biológiai kockázatok/rischi biologici/biologinis pavojus/bioloģiskais risks/biologische risico s/biologiske risikoer/zagrożenie biologiczne/riscos biológicos/ Biologisk risk/pericole biologice/биологическая опасность/ Biologicky rizikové/biologické riziká/ Biološkli rizici/biyolojik riskler ORIG ORIG ORIG HUM MOU BOV Human/С човешки произход/lidské/ Humant/Human/δείγματα αναφοράς/ Humano/Inimpäritolu/Humaine/Ljudskog porjekla/humán/origine Umana/ Žmogaus kilmės/cilvēku izcelsmes/ Human/Menneske/Ludzka/Humano/ Origine umană/человеческого происхождения/human/ľudské/ Humanega izvora/ljudskog porekla/insan From mouse/с миши произход/myší/ Fra mus/maus/απο ποντίκι/de ratón/ Hiirtelt/De souris/mišijeg porjekla/ Egérből/Murino/Pelės kilmės/no peles/ Van muizen/fra mus/mysia/do rato/de la şoareci/мышиного происхождения/ Från mus/myšie/mišjega izvora/mišijeg porekla/fareden Bovine/С говежди произход/ Hovězí/Bovin/Rind/από βοοειδή/ Bovino/Veistelt/Bovine/Rogate stoke/ Szarvasmarha/Bovino/Jaučio/No liellopa/bovien/bovin/wołowy/bovino/ Origine bovină/крупного рогатого скота/från ko/hovädzie/govejega izvora/rogate krupne stoke/bovin Reconstitute with/разтваряне с/ Rozřeďte pomocí/rekonstitueres med/ Rekonstituieren mit/ανασύσταση με/ Reconstituir con/lahjendamine/ Reconstituer avec/rekonstituirajte s/ Feloldáshoz/Ricostituire con/atkurti, ištirpdant su/atšķaidīt ar/reconstitutie met/rekonstitueres med/odtworzyć za pomocą/reconstituir com/a se reconstitui cu/растворить в/ Rekonstituera med/rozrieďte pomocou/ Rekonstituirajte z/s/ponovno formiranje sa/yeniden oluşturulur Manufacturer/Производител/Výrobce/ Producent/Hersteller/Kατασκευαστής/ Fabricante/Tootja/Fabricant/Proizvođač/ Gyártó/Fabbricante/Gamintojas/ Ražotājs/Fabrikant/Produsent/ Producent/Fabricante/Producător/ Производитель/Tillverkare/ Výrobca/ Izdelovalec/Proizvođač/Üretici 3

4 4

5 HE4 EIA CS Návod k použití Enzymoimunometrická souprava Pro 96 stanovení POUŽITÍ HE4 EIA je enzymoimunometrická zkouška ke kvantitativnímu stanovení HE4 v lidském séru. Zkouška slouží jako vodítko při sledování odpovědi na terapii pacientek s invazivním epitelovým ovariálním karcinomem. Opakované testování hodnot HE4 u pacientek je nutno používat ve spojení s dalšími klinickými metodami používanými pro monitorování ovariálního karcinomu. Dále je určena pro použití buď spolu s ARCHITECT CA125 II nebo CanAg CA125 EIA, případně Lumipulse G CA125II, jako vodítko na určení rizika epitelového ovariálního karcinomu u žen v premenopauze a postmenopauze s přítomným pánevním ložiskem. Výsledky musí být interpretovány ve spojení s dalšími metodami v souladu se standardními klinickými postupy. SHRNUTÍ A VYSVĚTLENÍ ZKOUŠKY Lidský epididymální protein 4 (HE4) patřící do rodiny syrovátkových kyselých proteinů se čtyřdisulfidickým jádrem (WFDC) s předpokládanými vlastnostmi inhibice trypsinu. Další proteiny v této rodině jsou také SLPI, Elafin a PS20 (WFDC1) (1, 2). Gen HE4 kóduje 13 kda protein, avšak v jeho zralé glykosylované struktuře má hmotnost přibližně kda a skládá se z jednoho peptidu obsahujícího dvě WFDC domény (3). HE4 byl jako první identifikován v epitelu distálního epididymia a původně se předpokládalo, že slouží jako proteázový inhibitor zapojený do dozrávání spermií (4,5). Od té doby byla exprese HE4 objevena u několika normálních tkání včetně epitelu respiračních a reprodukčních tkání a také v tkáni karcinomu ovaria (6-10). Navíc kromě exprese na buněčné úrovni byly zjištěny vysoké hodnoty vylučovaného HE4 v séru pacientek s ovariálním karcinomem. V případě případové/kontrolní studie porovnávající pacientky s ovariálním karcinomem se zdravými a benigními stavy Hellström a kolektiv zjistili, že HE4 detekoval ovariální karcinom se 67% citlivostí a 96% specificitou (11). V následující studii vyhodnocení velkého množství známých biomarkerů pro ovariální karcinom ukázalo, že HE4 má nejlepší citlivost pro detekci ovariálního karcinomu, zvláště v časné fázi nemoci. V této studii byla kombinace HE4 a CA125 přesnějším prediktorem malignity než jednotlivé biomarkery samostatně, s citlivostí 76% a specificitou 95% (12). 5

6 Ovariální karcinom je na světě 4. nejčastější příčinou smrti v důsledku rakoviny u žen. V Evropě je úmrtnost mezi 3,6 až 9,3 na žen (13). Příznaky ovariálního karcinomu jsou spojené s přítomností adnexálních ložisek a jsou často nejasné a nespecifické. Hlavní cíl diagnostického hodnocení adnexálních ložisek je určení, zda jsou maligní nebo benigní. Odhadem 5 až 10 procent žen ve Spojených státech během života podstoupí operaci podezřelého ovariálního novotvaru, a u 13 až 21 procent z nich se zjistí ovariální malignita (14). American College of Obstetricians and Gyneacologists Practise Bulletin publikoval v roce 2007 následující prohlášení: U žen s ovariálním karcinomem v péči lékařů, kteří jsou dokonale proškoleni a mají odbornou způsobilost v léčbě žen s ovariálním karcinomem, jako jsou gynekologičtí onkologové, se zlepšil celkový poměr přežití v porovnání s těmi, které nebyly léčeny v takové spolupráci. (15). Pokud je většina adnexálních ložisek benigní, je důležité stanovit předoperačně, zda je u pacientky vysoké riziko ovariálních malignit, aby se zajistil vhodný postup (15). Od úvodní zprávy v roce 1988 byly klinický nález, sérový CA125 a ultrazvuk spolu s CT snímkováním, MR a CT/PET standardními postupy při stanovení podezření, zda je u adnexálních ložisek podezření na malignitu (16). Přestože literatura uvádí celou řadu článků popisujících, která metoda je přesnější, kombinace lékařského vyšetření, CA125 a zobrazovací metody má nejvyšší pozitivní prediktivní hodnotu (17 19). Pro zlepšení třídění pacientek s pánevním ložiskem může být použita HE4 EIA buď spolu s ARCHITECT CA125II, nebo CanAg125 EIA, případně zkouška Lumipulse G CA125II, jako pomůcka při vyhodnocení rizika skrytého epiteliálního ovariálního karcinomu. Výsledky musí být interpretovány ve spojení s dalšími metodami v souladu se standardními klinickými postupy. Další použití soupravy HE4 EIA je pomůckou při sledování odpovědi na terapii pacientek s invazivním epiteliálním ovariálním karcinomem. Výsledky by měly být využity spolu s dalšími klinickými metodami použitými při sledování ovariálního karcinomu. PRINCIP ZKOUŠKY HE4 EIA je nekompetitivní imunoanalytické stanovení v pevné fázi, založené na přímé sendvičové technice s použitím dvou myších monoklonálních protilátek 2H5 a 3D8 specifických pro dva různé epitopy v doméně C-WFDC HE4. Kalibrátory, kontrolní vzorky a vzorky pacientek jsou inkubovány společně s biotinylovanou Anti-HE4 monoklonální protilátkou (MAb) 2H5 v mikroproužcích potažených streptavidinem. HE4, přítomný v kalibrátorech nebo vzorcích, se během inkubace adsorbuje na mikroproužky potažené streptavidinem prostřednictvím biotinylované Anti-HE4 MAb. Proužky se pak promyjí a inkubují s HRP značenou Anti-HE4 MAb MAb 3D8. Po promytí se do každé jamky přidá tlumivý substrát / chromogenní činidlo (peroxid vodíku a 3, 3, 5, 5 tetrametylbenzidin) a umožní se enzymatická reakce. Během enzymatické reakce se v přítomnosti antigenu objeví modré zbarvení. Intenzita zabarvení je úměrná množství HE4 přítomného ve vzorcích. 6

7 Intenzita zabarvení se změří ve spektrofotometru pro mikrodestičky při 620 nm (nebo volitelně při 405 nm po přidání zastavovacího roztoku). Pro každou zkoušku se vytvoří kalibrační křivky vyhodnocením hodnot absorbance proti koncentraci u každého kalibrátoru. Z kalibrační křivky se potom odečtou koncentrace HE4 vzorků pacientek. REAGENCIE Každá souprava HE4 EIA obsahuje reagencie pro 96 testů. Datum exspirace soupravy je vyznačeno na štítku na vnější straně krabičky soupravy. Nepoužívejte po uplynutí doby exspirace. Nesměšujte reagencie ze souprav různých šarží. Soupravu skladujte při 2 8 C. Nezamrazujte. Otevřené reagencie jsou stabilní, pokud jsou skladovány v souladu s údaji v tabulce uvedené níže, nejsou kontaminovány, jsou uchovávané v původních obalech a je s nimi manipulováno předepsaným způsobem. Ihned po použití opět uložte do prostředí s teplotou 2 8 C. Složka Množství Skladování a stabilita po prvním použití MICROPLA Mikrodestička 1 destička 2 8 C do doby exspirace uvedené na destičce 12 x 8 odlamovatelných jamek potažených streptavidinem. Po otevření ihned vraťte nepoužité proužky do hliníkového sáčku, který obsahuje pohlcovač vlhkosti. Sáček opět důkladně uzavřete, aby byly proužky uchovávány v suchu. CAL HE4 A Kalibrátor HE4 A 1 x 8 ml 2 8 C do data exspirace uvedeného na lahvičce Fosfátový tlumivý solný roztok obsahující hovězí sérový albumin, inertní žluté barvivo a neazidové antimikrobiální konzervační činidlo. Připraven k použití. Určen i pro naředění vzorků. 7

8 Složka Množství Skladování a stabilita po prvním použití Kalibrátory HE4 B-F 5 lahviček, lyofilizováno Stabilita po rekonstituci 4 týdny při teplotě 2 8 C 4 měsíce při teplotě 20 C či nižší CAL HE4 B CAL HE4 C CAL HE4 D CAL HE4 E CAL HE4 F 1 x 1 ml 1 x 1 ml 1 x 1 ml 1 x 1 ml 1 x 1 ml Lyofilizované kalibrátory obsahují antigen HE4 ve fosfátovém tlumivém solném roztoku obsahujícím hovězí sérový albumin, inertní žluté barvivo a neazidové antimikrobiální konzervační činidlo. Před použitím rozpustit v destilované nebo deionizované vodě. POZNÁMKA: Přesná koncentrace HE4 je pro danou šarži specifická a je vyznačena na štítku každé lahvičky. Kontrolní vzorky HE4 2 lahvičky, lyofilizováno Stabilita po rekonstituci 4 týdny při teplotě 2 8 C 4 měsíce při teplotě 20 C či nižší CONTROL HE4 1 1 x 1 ml CONTROL HE4 2 1 x 1 ml Lyofilizované kontrolní vzorky obsahují antigen HE4 v matici lidského séra a neazidové antimikrobiální konzervační činidlo. Před použitím rozpustit v destilované nebo deionizované vodě. BIOTIN Anti-HE4 Biotin Anti HE4 1 x 15 ml 2 8 C do data exspirace uvedeného na lahvičce 8

9 Biotinylovaná myší monoklonální protilátka Anti-HE4, přibližně 1 μg/ml. Obsahuje fosfátový tlumivý solný roztok (ph 7,2) s hovězím sérovým albuminem, blokovacími činidly, detergentem, inertním modrým barvivem a neazidovým antimikrobiálním konzervačním činidlem. Připraven k použití. Složka Množství Skladování a stabilita po prvním použití CONJ Anti-HE4 Indikátor, HRP Anti-HE4 1 x 0,75 ml 2 8 C do data exspirace uvedeného na lahvičce Zásobní roztok myší monoklonální protilátky HRP Anti-HE4, přibližně 40 μg/ml. Obsahuje neazidové antimikrobiální konzervační látky. Před použitím naředit ředidlem pro indikátor. DIL CONJ Ředidlo pro indikátor 1 x 15 ml 2 8 C do data exspirace uvedeného na lahvičce Fosfátový tlumivý solný roztok (ph 7,2) s hovězím sérovým albuminem, blokovacími činidly, detergenty, inertním modrým barvivem a neazidovým antimikrobiálním konzervačním činidlem. Připraven k použití. SUBS TMB Substrát TMB HRP 1 x 12 ml 2 8 C do data exspirace uvedeného na lahvičce Osahuje tlumivý peroxid vodíku a 3, 3, 5, 5 tetra-metylbenzidin (TMB). Připraven k použití. STOP Zastavovací roztok 1 x 15 ml 2 8 C do data exspirace uvedeného na lahvičce Obsahuje 0,12 M kyselinu chlorovodíkovou. Připraven k použití. 9

10 Složka Množství Skladování a stabilita po prvním použití WASHBUF 25X Koncentrát promývacího roztoku 1 x 50 ml 2 8 C do doby exspirace uvedené na lahvi Tlumivý solný roztok Tris-HCl s Tween 20. Obsahuje Germall II jako konzervační činidlo. Před použitím naředit 25krát destilovanou nebo deionizovanou vodou. Známky nestability Substrát TMB HRP by měl být bezbarvý nebo jemně namodralý. Modré zbarvení znamená, že činidlo bylo kontaminováno a je třeba ho zlikvidovat. UPOZORNĚNÍ A BEZPEČNOSTNÍ OPATŘENÍ Pro diagnostické použití in vitro: Postupujte podle pokynů v příbalové informaci. Spolehlivost výsledků zkoušky nelze zaručit v případě, že dojde k jakýmkoliv odchylkám od pokynů v této příbalové informaci. Se všemi vzorky pacienta manipulujte jako s potenciálně infekčním materiálem. S reagencií lidského původu a lidskými vzorky se doporučuje manipulovat v souladu s normou organizace OSHA o patogenech přenášených krví (20). U materiálu, který obsahuje infekční agens, nebo u něhož je podezření, že jej obsahuje, je nutno používat postupy pro úroveň biologického nebezpečí 2 (21) nebo jiné příslušné postupy pro biologické nebezpečí. Při likvidaci odpadu postupujte podle místních bezpečnostních předpisů. Upozornění Materiál použitý při přípravě reagencie lidského původu byl testován a bylo zjištěno, že nereaguje s protilátkami proti antigenům HIV1 a HIV2, HCV a povrchovému antigenu hepatitidy B (HBsAg). Avšak žádná metoda nemůže kompletně vyloučit přítomnost nemocí přenášených krví, a proto se musí se všemi reagenciemi lidského původu zacházet a musí se likvidovat jako potenciálně infekční. ODBĚR VZORKŮ A MANIPULACE S NIMI Souprava HE4 EIA je určena pro použití se vzorky séra (včetně séra odebíraného do separačních zkumavek (SST)). Plazma nebo jiné lidské tekutiny nebyly schváleny pro soupravu HE4 EIA. Krev odeberte ze žíly a dodržujte postup výrobce uvedený v návodu pro odběrové zkumavky. Při zkoumání série vzorků by se měl použít stejný typ vzorků v průběhu celé studie. 10

11 Sérum může být skladováno 3 dny před analýzou při teplotě 2 8 C. Chcete-li vzorky uchovat po delší dobu, skladujte je při teplotě -40 C či nižší. Zmrazené vzorky přeneste do prostředí s pokojovou teplotou a před analýzou je DŮKLADNĚ promíchejte několikerým jemným obrácením. Vzorky obsahující hrubé částice je třeba před použitím centrifugovat při x g po dobu 10 minut; tak se eliminují jakékoli částice, které by mohly vzniknout v průběhu rozmrazování. POSTUP Potřebné materiály, které nejsou součástí dodávky v soupravě 1. Třepačka pro mikrodestičky Třepání by mělo být střední až intenzivní, přibližně kmitů/min. 2. Promývačka pro mikrodestičky Automatická promývačka destiček, která umožní nastavit 1, 3 a 6 promývacích cyklů s minimálním objemem 350 µl/jamka/promývací cyklus. Pokud není k dispozici automatická promývačka pro mikrodestičky, doporučujeme 8kanálovou pipetu s vyměnitelnými plastovými špičkami o objemu 350 µl. 3. Spektrofotometr pro mikrodestičky S vlnovou délkou 620 nm a/nebo 405 nm a rozsahem absorbance od 0 do 3,0. 4. Přesné pipety S jednorázovými plastovými špičkami pro směšování mikrolitrových objemů. Doporučená, ale nikoli vyžadovaná, je 8kanálová pipeta nebo automatická pipeta s jednorázovými plastovými špičkami pro dávkování objemu 100 µl. Pipety pro směšování mililitrových objemů. 5. Destilovaná nebo deionizovaná voda Pro rekonstituci kalibrátorů HE4, kontrolních vzorků HE4 a pro přípravu zředěného promývacího roztoku. Poznámky k postupu 1. Aby bylo zajištěno správné používání soupravy HE4 EIA, je třeba důkladně porozumět obsahu této příbalové informace. Reagencie dodávané se soupravou jsou nedílnou součástí při jejím použití. Nemíchejte stejné reagencie ze souprav, které mají různá čísla šarží. Nepoužívejte reagencie ze soupravy po uplynutí data exspirace vytištěného na vnější straně krabice soupravy. 2. Reagencie je třeba před použitím zahřát na pokojovou teplotu (20 25 C). Zmrazené vzorky je třeba po rozpuštění jemně, ale důkladně promíchat. Abyste získali správné výsledky, měla by se zkouška provádět pouze při teplotě mezi 20 a 25 C. 11

12 3. Před započetím pipetování kalibrátorů a vzorků pacientů vám doporučujeme označit si jednotlivé proužky, abyste byli schopni během zkoušky i po jejím skončení jednoznačně identifikovat všechny vzorky. 4. Podmínka efektivního a důkladného promytí proužků za účelem oddělení vázaného a nevázaného antigenu a reagencií z komplexů antigen-protilátka vázaných na pevné fázi je jedním z nejdůležitějších kroků v EIA. Pro zajištění účinného promytí se ujistěte, že všechny jamky byly během každého promývacího cyklu zcela naplněny promývacím roztokem až k hornímu okraji, že byl vymývací roztok dávkován při dobré průtokové rychlosti, že aspirace jamek mezi promývacími cykly a po nich byla úplná a že jamky zůstaly na konci prázdné. Pokud v nich zůstala tekutina, obraťte destičku a opatrně ji vyklepejte proti absorpčnímu papíru. - Automatická promývačka pásku: Postupujte podle pokynů výrobce ohledně čištění a údržby a proveďte promytí požadovaným počtem mycích cyklů před a po každém inkubačním kroku. Aspirační/promývací zařízení nesmí zůstávat naplněné promývacím roztokem delší dobu, protože by mohlo dojít k ucpání jehel vedoucímu ke špatnému rozvodu tekutiny a k aspiraci. 5. Substrát TMB HRP je velmi citlivý na kontaminaci. Abyste zachovali optimální stabilitu substrátu TMB HRP a vyhnuli se kontaminaci reagencie, odlijte požadované množství z lahvičky do pečlivě vymyté nádobky nebo nejlépe do plastové nádobky na jedno použití.. Ujistěte se, že používáte čisté jednorázové pipetovací špičky (nebo dispenzní pipetovací špičku). 6. Ujistěte se, že při manipulaci se vzorky a reagenciemi používáte čisté jednorázové plastové pipetovací špičky a vhodnou a přesnou pipetovací techniku. Dbejte na to, aby se pipetovací špička nedotýkala povrchu tekutiny a zamezilo se tak vzájemné kontaminaci. Při manipulaci se vzorky a roztokem substrátu TMB HRP je velmi důležitá přesná pipetovací technika. Příprava reagencií Kalibrátory HE4 B-F Stabilita připravené reagencie 4 týdny při teplotě 2 8 C 4 měsíce při teplotě -20 C či nižší Do každé lahvičky přidejte přesně 1 ml destilované nebo deionizované vody. Ponechte alespoň 15 minut stát, aby se obsah dokonale rozpustil, a před použitím jemně promíchejte. POZNÁMKA: Koncentrace kalibrátorů je uvedena na štítcích a musí být použita při výpočtu výsledků. 12

13 Příprava reagencií Stabilita připravené reagencie Kontrolní vzorky HE4 1 a 2 4 týdny při teplotě 2 8 C 4 měsíce při teplotě 20 C či nižší Do každé lahvičky přidejte přesně 1,0 ml destilované nebo deionizované vody a jemně zamíchejte. Ponechte alespoň 15 minut stát, aby se obsah dokonale rozpustil, a před použitím jemně promíchejte. POZNÁMKA: Rozmezí kontrolních vzorků je uvedeno na štítcích. Promývací roztok 2 týdny při teplotě 2 25 C v uzavřené nádobě Nalejte 50 ml promývacího koncentrátu do čisté nádoby a nařeďte jej 25krát přidáním ml destilované nebo deionizované vody. Tak získáte tlumivý promývací roztok. Pracovní roztok indikátoru 4 týdny při teplotě 2 8 C v uzavřené nádobě Připravte požadované množství pracovního roztoku indikátoru smícháním 50 µl indikátoru, HRP Anti-HE4 s 1 ml ředidla indikátoru (viz tabulka uvedená níže): Počet proužků Indikátor, HRP Anti-HE4 Ředidlo indikátoru (µl) (ml) Ujistěte se, že při přípravě pracovního roztoku indikátoru používáte čistou plastovou nebo skleněnou zkumavku. Další možnost: Nalijte obsah indikátoru, HRP Anti-HE4 do lahvičky s ředidlem indikátoru a jemně promíchejte. Přesvědčte se, že jste do lahvičky s ředidlem indikátoru opravdu přenesli veškerý indikátor HRP Anti- HE4. 13

14 POZNÁMKA: Pracovní roztok indikátoru je stabilní po 4 týdny při teplotě 2 8 C. Nepřipravujte více pracovního roztoku indikátoru, než se použije během tohoto období, a ujistěte se, že je správně uložen. POSTUP ZKOUŠKY Každé stanovení kalibrátorů, kontrolních a neznámých vzorků provádějte v duplikátech. V každé zkoušce by měla být provedena kalibrační křivka. Všechny reagencie a vzorky musí před použitím dosáhnout pokojové teploty (20 25 C). 1. Začněte připravovat kalibrátory B-F, kontrolní vzorky 1 a 2, promývací roztok a pracovní roztok indikátoru. Je důležité používat čisté nádoby. Postupujte přesně podle návodu. 2. Do rámečku na proužky vložte požadovaný počet proužků s mikrojamkami. (Zbývající proužky ihned vraťte do hliníkového obalu obsahujícího pohlcovač vlhkosti a pečlivě jej zavřete). Každý proužek jednou propláchněte promývacím roztokem. Nepromývejte více proužků, než kolik zvládnete zpracovat za 30 minut. 3. Do jamek napipetujte 25 μl kalibrátorů HE4 (KAL A, B, C, D, E a F), kontrolní vzorky HE4 (C1, C2) a neznámé vzorky (Nez) podle následujícího schématu: A B C D E F G H atd. Kal A Kal A Kal B Kal B Kal C Kal C Kal D Kal D Kal E Kal E Kal F Kal F C1 C1 C2 C2 1. Nez 1. Nez 2. Nez 2. Nez 4. Pomocí přesné pipety na 100 μl (nebo přesné 8kanálové pipety na 100 μl) přidejte do všech jamek 100 μl biotinylované Anti-HE4. Dbejte na to, aby se pipetovací špička nedotýkala povrchu tekutiny a zamezilo se tak vzájemné kontaminaci. 14

15 5. Rámeček s proužky inkubujte za stálého třepání po dobu 1 hodiny (± 10 min.) při laboratorní teplotě (20 25 C), na třepačce pro mikrodestičky. 6. Po první inkubaci všechny proužky třikrát odsajte a promyjte podle promývacího postupu popsaného v Poznámkách k postupu, bod Do všech jamek přidejte 100 μl pracovního roztoku indikátoru. Použijte stejný postup pipetování, jak je popsán výše v bodu Rámeček inkubujte za stálého třepání 1 hodinu (± 5 min.) při pokojové teplotě (20 25 C). 9. Po druhé inkubaci všechny proužky šestkrát odsajte a promyjte podle promývacího postupu, popsaného v Poznámkách k postupu, bod Do všech jamek přidejte 100 μl substrátu TMB HRP. Použijte stejný postup pipetování, jak je popsán výše v bodu 4. Substrát TMB HRP pipetujte co nejrychleji, doba mezi napipetováním první a poslední jamky nesmí přesáhnout 5 minut. 11. Inkubujte po dobu 30 minut (± 5 min.) při pokojové teplotě (20 25 C) za stálého třepání. Zabraňte působení přímého slunečního světla. 12. Okamžitě změřte absorbanci při 620 nm ve spektrofotometru pro mikrodestičky. Další varianta Pokud nemá laboratoř přístup k spektrofotometru pro mikrodestičky, který je schopen odečtů při 620 nm, lze absorbanci alternativně stanovit podle postupu popsaného níže v bodě 12: Alt. 12. Přidejte 100 µl zastavovacího roztoku, promíchejte a během 15 minut od přidání roztoku ve spektrofotometru pro mikrodestičky odečtěte absorbanci při 405 nm. Rozsah měření Soupravou HE4 EIA lze měřit koncentrace mezi 15 a 900 pm. Jestliže očekáváte koncentrace HE4 nad tímto rozsahem měření, doporučujeme vzorky před měřením naředit kalibrátorem HE4 - A (viz Výpočet výsledků naředěných vzorků ). Kontrola kvality Pro validaci každé série zkoušek použijte kontrolní vzorky HE4 1 a 2. Rozsahy očekávaných výsledků jsou uvedeny na štítcích lahviček. Výsledky zkoušky HE4 by se měly považovat za platné, pokud: - Střední hodnoty kontrolních duplikátů jsou v rámci specifikovaného rozsahu. - Duplikáty replikátů kalibrátorů B-F a kontrolních vzorků nepřesahují hodnotu VK 15%. - Duplikáty replikované z kalibrátoru A (nula) se od sebe neliší o více než 0,06 jednotek OD. 15

16 Pokud zkouška vede k nesprávným výsledkům kalibrátoru nebo kontrolního vzorku, je nutné kompletně zkontrolovat reagencie, přesnost pipet, promývacího zařízení a odečítacího výkonu a poté analýzu opakovat. Každá laboratoř si může připravit svou vlastní sérii vzorků sér pacientů na různých úrovních, které se použijí jako interní kontrolní vzorky, a tak se zajistí přesnost zkoušky. Referenční materiál Protože není dostupný běžný referenční materiál pro antigen HE4, jsou hodnoty kalibrátorů HE4 EIA přiřazeny na základě souboru referenčních standardů výrobce. VÝPOČET VÝSLEDKŮ Pokud používáte spektrofotometr pro mikrodestičky s integrovaným programem kalkulace dat, postupujte podle příručky spektrofotometru a vytvořte program pomocí koncentrace uvedené na štítcích jednotlivých lahviček kalibrátorů HE4. Pro automatický výpočet výsledků HE4 se doporučuje použít jednu z následujících metod: Aproximace křivky cubic spline. Do křivky je třeba zahrnout kalibrátor A s hodnotou 0 pm. Interpolace s vyhodnocením point-to-point. Do křivky je třeba zahrnout kalibrátor A s hodnotou 0 pm. Metoda kvadratické aproximace křivky. Do křivky je třeba zahrnout kalibrátor A s hodnotou 0 pm. POZNÁMKA: 4parametrová nebo lineární regrese by neměly být používány jako metody vyhodnocení. Při manuálním vyhodnocování se kalibrační křivka sestrojí vynesením hodnot absorbance (A) každého kalibrátoru HE4 proti odpovídající koncentraci HE4 (v pm). Neznámé koncentrace HE4 lze pak z kalibrační křivky odečíst pomocí střední hodnoty absorbance každého vzorku pacienta. Výpočet výsledků s naředěnými vzorky Jestliže při první analýze vzorky vykazují hodnoty HE4 vyšší než je hodnota 900 pm, musí být naředěny kalibrátorem HE4 A v poměru 1/10 a 1/100 a znovu analyzovány, aby se získala přesná koncentrace HE4 vzorků. - 1/10 ředění = 50 μl vzorku μl kalibrátoru HE4 A - 1/100 ředění = 50 μl roztoku 1/ μl kalibrátoru HE4 A Koncentrace HE4 neředěného vzorku se vypočte následovně: - Ředění 1/10: 10 x naměřená hodnota - Ředění 1/100: 100 x naměřená hodnota 16

17 Výpočet hodnoty ROMA Algoritmus pro stanovení rizika epiteliálního ovariálního karcinomu (ROMA) je sérový test, který kombinuje výsledky HE4, CA125 a stav menopauzy do hodnoty ROMA. Výpočet prediktivního indexu Prediktivní index (PI) se vypočítá zvlášť pro ženy v premenopauze a postmenopauze podle níže uvedených rovnic (1) a (2). K výpočtu PI se do příslušné rovnice algoritmu níže vkládají hodnoty získané soupravou HE4 EIA, a dále buď soupravami ARCHITECT CA125II nebo CanAg CA125 EIA, případně Lumipulse G CA125II v daném pořadí, podle menopauzálního stavu žen. (1) Premenopauzální žena Prediktivní index (PI) = -12,0 + 2,38*LN[HE4] + 0,0626*LN[CA125] (2) Postmenopauzální žena Prediktivní index (PI) = -8,09 + 1,04*LN[HE4] + 0,732*LN[CA125] Výpočet hodnoty ROMA Pro výpočet hodnoty ROMA (tj. prediktivní pravděpodobnost) vložte vypočítanou hodnotu prediktivního indexu do rovnice (3); (3) Hodnota ROMA (%) = exp(pi) /[1+exp(PI)]*100 Níže uvedené příklady mohou být použity pro účel validace výpočtů PI a hodnoty ROMA: Menopauzální stav Premenopauzální Premenopauzální Postmenopauzální Postmenopauzální HE4 (pm) CA125 (U/ml) 37,5 74,9-12,0+(2,38*3,624) +(0,0626*4,316) 386,6 21,8-12,0+(2,38*5,957) +(0,0626*3,082) 66,7 11,3-8,09+(1,04*4,200) +(0,732*2,425) 383,1 22,7-8,09+(1,04*5,948) +(0,732*3,122) Výpočet PI PI ROMA (%) -3, ,29 2, ,5-1, ,5 0, ,4 17

18 Pracovní protokol HE4 EIA REF Bezprostředně před použitím připravte složky. Použijte způsob míchání a inkubace uvedený v návodu. Poznámka: pro získaní správných výsledků se musí stanovení provádět při teplotách C. Krok Lahvička/Destička Postup 1. Připravte kalibrátory HE4 Připravte kontroly HE4 Připravte promývací roztok CAL HE4 B, C, D, E, F 1, 2 CONTROL HE4 WASHBUF 25X Do každé lahvičky přidejte 1 ml destilované nebo deionizované vody a jemně promíchejte. Nechte alespoň 15 minut stát. POZNÁMKA: Přesná koncentrace každého kalibrátoru je uvedena na štítku. Stabilita rozpuštěných přípravků: 4 týdny při 2 8 C. Nařeďte 50 ml koncentrátu promývacího roztoku 1200 ml destilované nebo deionizované vody Připravte pracovní roztok Indikátoru (tracer) CONJ DIL CONJ Anti-HE4 Pro jeden proužek smíchejte 50 μl indikátoru HRP Anti-HE4 s 1 ml ředidla pro indikátor: Počet Indikátor, HRP anti-he4 Ředidlo pro proužků (µl) indikátor (ml) Promývejte MICROPLA Jednou promyjte každou jamku promývacím roztokem. Promývejte ručně nebo použijte 18

19 2. Promývejte 3. Přidejte kalibrátory, kontroly a vzorky 4. Přidejte biotinylovanou anti-he4 5. Inkubujte 6. Promývejte 7. Přidejte pracovní roztok indikátoru (tracer) 8. Inkubujte 9. Promývejte 10. Přidejte substrát TMB HRP 11. Inkubujte 12. Odečítejte absorbanci Alt.12 Přidejte Stop roztok Alt.13 Promíchejte Alt.14 Odečítejte absorbanci MICROPLA CAL HE4 A, B, C, D, E, F CONTROL HE4 1, 2 BIOTIN Anti-HE4 MICROPLA MICROPLA TRACER WORKING SOLUTION MICROPLA MICROPLA SUBS TMB MICROPLA MICROPLA STOP MICROPLA MICROPLA Jednou promyjte každou jamku promývacím roztokem. Promývejte ručně nebo použijte automatickou promývačku. 25 μl do každé jamky 100 μl do každé jamky 1 hodina třepání při teplotě C Všechny jamky třikrát promyjte promývacím roztokem. Promývejte ručně nebo použijte automatickou promývačku. 100 μl do každé jamky 1 hodiny třepat při teplotě C Všechny jamky šestkrát promyjte promývacím roztokem. Promývejte ručně nebo použijte automatickou promývačku. 100 μl do každé jamky 30 minut třepání při teplotě C 620 nm 100 μl do každé jamky Promíchejte při teplotě C Odečítejte v průběhu 15 minut při 405 nm 19

20 OMEZENÍ POSTUPU Pacientky s potvrzeným ovariálním karcinomem mohou mít hodnoty zkoušky HE4 ve stejném rozmezí jako zdravé ženy. Určité histologické typy ovariálního karcinomu, např. mucinózní nebo zárodečné buněčné tumory, zřídka exprimují HE4, proto HE4 není doporučována pro sledování pacientek se zjištěným mucinózním a zárodečným buněčným karcinomem (7). Naopak, zvýšené hladiny antigenu HE4 mohou být přítomny u jedinců s nemaligním onemocněním. Hladina HE4 proto nemůže sloužit jako absolutní důkaz potvrzující přítomnost či absenci maligního onemocnění a test HE4 nelze použít ve skríningovém programu pro zachycení rakoviny. Výsledky testu je třeba interpretovat pouze ve spojení s dalšími vyšetřeními a postupy v diagnostice onemocnění a léčbě pacientek; test HE4 nemůže nahradit jiné uznávané klinické vyšetření. Algoritmus rizika ovariální malignity nebyl schválen pro následující skupiny pacientek: pacientky s předešlou léčbou malignity, pacientky aktuálně léčené chemoterapií a pacientky mladší 18 let. Forma matematické funkce, uvedená jako Algoritmus rizika ovariální malignity (ROMA), závisí na premenopauzálním nebo postmenopauzálním stavu ženy. Stanovení premenopauzálního nebo postmenopauzálního stavu musí být provedeno na základě funkce ovarií, určené z informací dostupných z klinického vyhodnocení a zdravotní anamnézy. Hodnota ROMA nezahrnuje věk, rodinnou anamnézu, klinické nálezy nebo výsledky zobrazovacích technik a měla by být interpretována v souvislosti s těmito parametry. Selhání zkoušky HE4 EIA a/nebo CA125, jak je uvedeno, nebo chyba ve výpočtu výsledků může vést k nepřesným vyhodnocení rizika a nevhodné léčbě pacientky. Konkrétně mohou falešně nízké hodnoty zkoušek vést k tomu, že pacientka má nižší riziko epitelového ovariálního karcinomu, což by mohlo zařadit pacientku do méně specializované úrovně péče. Použití výsledků bez zvážení dalších laboratorních nálezů, výsledků zobrazovacích technik a klinického obrazu by mohlo představovat riziko. Přestože jsou v tlumicím roztoku obsaženy specifické blokovací látky, mohou do zkoušky příležitostně zasahovat protilátky proti reagenciím (lidské protilátky proti myším (HAMA) nebo heterofylní protilátky) ve vzorcích pacientky. Zkouška musí být prováděna v prostředí s kontrolou teploty, protože inkubace při teplotách vyšších než v doporučeném rozmezí C mohou poskytovat falešně nízké výsledky. 20

21 OČEKÁVANÉ HODNOTY Rozdělení hladin HE4 stanovených u 1983 vzorků je uvedeno v tabulce níže: Počet subjektů Rozložení hodnot zkoušky HE4 0,0-150,0 pm 150,1-300,0 pm 300,1-500,0 pm > = 500,1 pm ZJEVNĚ ZDRAVÉ Ženy (Premenopauzální) (98%) 4 (0,9%) 0 (0,0%) 3 (0,7%) Ženy (Postmenopauzální) (96%) 16 (3,6%) 2 (0,5%) 1 (0,2%) BENIGNÍ STAVY Těhotenství (95%) 1 (4,5%) 0 (0,0%) 0 (0,0%) Benigní gynekologické (93%) 18 (5,2%) 1 (0,3%) 4 (1,2%) onemocnění Jiné benigní (76%) 8 (7,5%) 7 (6,5%) 11 (10%) onemocnění Hypertenze/Vroz (78%) 16 (17%) 2 (2,1%) 3 (3,1%) srdeční selhání RAKOVINA Ovariální karcinom (21%) 18 (14%) 21 (16%) 61 (48%) Karcinom prsu (87%) 4 (8,7%) 2 (4,3%) 0 (0,0%) Karcinom plic (56%) 16 (32%) 6 (12%) 0 (0,0%) Karcinom endometria (76%) 36 (14%) 11 (4,1%) 16 (6,0%) Gastrointestinální karcinom (84%) 8 (14%) 0 (0,0%) 1 (1,8%) 21

22 Hodnoty zkoušky HE4 rozdělené podle věku u zjevně zdravých subjektů Věk (Let) N Střední Výsledek HE (pm) 95 percentil < ,6 81, ,2 110, ,5 104, ,7 113, ,1 233,3 V této studii mělo 98% premenopauzálních zdravých žen hodnotu HE4 EIA <150 pm a 96 % postmenopauzálních zdravých žen mělo hodnotu HE4 EIA <150 pm. Doporučuje se, aby si každá laboratoř stanovila vlastní referenční hodnotu pro každou skupinu zájmu. Sledování průběhu nemoci u pacientů s diagnostikovaným ovariálním karcinomem Účinnost soupravy HE4 EIA jako pomůcky při sledování stavu nemoci pacientek s ovariálním karcinomem byla stanovena vyhodnocením změn hodnot HE4 u řady vzorků sér od 80 pacientek ve srovnání se změnami stavu onemocnění. Studie s celkovým počtem 354 párů pozorování byla provedena s průměrným počtem 4,4 pozorování na pacientku. Pozitivní změna v HE4 byla definována jako zvýšení hodnoty, které bylo alespoň o 25% větší než předchozí hodnota v testu. Tato úroveň změny zohledňuje variabilitu zkoušky a biologickou variabilitu. Šedesát procent (60%), resp. 76/126 vzorků pacientů s pozitivní změnou korelovalo s progresí onemocnění, zatímco sedmdesát pět procent (75%), resp. 171/228 sérií vzorků pacientů bez významné změny v hodnotě HE4 korelovalo s nulovou progresí. Celková shoda byla sedmdesát procent (70%, resp. 247/354). V následující tabulce jsou uvedena data ve formátu 2 x 2. Změna ve stavu onemocnění podle postupného páru Zvýšení koncentrace HE4 Progrese Bez progrese Celkem >25% < 25% Celkem

23 Následující tabulka uvádí distribuci na pacienta. S progresí onemocnění korelovalo devadesát tři procent (93%), resp. 54/58 souborů sér pacientek s pozitivní změnou, přičemž u onemocnění bez progrese korelovalo třicet dva (32%), resp. 7/22 souborů sér s žádnou významnou změnou hodnot HE4. Celková shoda v této studii byla sedmdesát šest procent (76%), resp. 61/80. Změna ve stavu nemoci na pacientku Zvýšení koncentrace HE4 Progrese Bez progrese Celkem >25% < 25% Celkem Vyhodnocení rizika u pacientek s pánevním ložiskem Účinnost vyhodnocení rizika pro epitelový ovariální karcinom u pacientek s pánevním ložiskem byla stanovena v prospektivní, multicentrické, dvojitě zaslepené klinické studii pomocí soupravy HE4 EIA v kombinaci s CA125 stanoveným buď soupravou ARCHITECT CA125II, nebo CanAg CA125 EIA, případně Lumipulse G CA125II. Algoritmus (ROMA, viz strana 17) byl vyvinut pro vyhodnocení rizika epitelového ovariálního karcinomu. Algoritmus zohledňuje hodnoty HE4 a CA125, stejně jako menopauzální stav pacientky. Algoritmus vypočítává prediktivní pravděpodobnost nalezení epitelového ovariálního karcinomu při chirurgickém zákroku. V prospektivní studii s celkovým počtem 502 pacientek byla vyhodnocena prediktivní pravděpodobnost ovariálního karcinomu, stejně jako možnost rozdělit pacientky do skupiny s vysokým a nízkým rizikem na základě hodnot ROMA. Kumulativní frekvenční distribuce hodnot ROMA pro případy benigního a ovariálního zhoubného nádoru, včetně nádorů s nízkým maligním potenciálem (LMP) s použitím algoritmu, je uvedena na obrázku 1 a 2 pro kombinaci zkoušky HE4 EIA + ARCHITECT CA125 II a na obrázcích 3 a 4 pro kombinaci HE4 EIA a CanAg CA125 EIA. Kombinace zkoušky HE4 EIA + Lumipulse G CA125II prokázala velmi podobnou frekvenční distribuci jako kombinace zkoušky HE4 EIA + ARCHITECT CA125 II. Grafy frekvenční distribuce znázorňují distribuci pacientek s benigním onemocněním a epitelovým ovariálním karcinomem (včetně LMP) v daném pořadí při různých mezních hodnotách ROMA. 23

24 Obr. 1 Kumulativní frekvenční distribuce hodnot ROMA pro premenopauzální ženy. Kombinace zkoušky HE4 EIA + ARCHITECT CA125 II % benigních případů s nižší hodnotou ROMA Benigní (N=200) Rakovina (N=34) % případů rakoviny s nižší hodnotou ROMA Hodnota ROMA: HE4 EIA + Architect CA 125 II Obr. 2 Kumulativní frekvenční distribuce hodnot ROMA pro postmenopauzální ženy. Kombinace zkoušky HE4 EIA + ARCHITECT CA125 II % benigních případů s nižší hodnotou ROMA Benigní (N=151) Rakovina (N=117) % případů rakoviny s nižší hodnotou ROMA Hodnota ROMA: HE4 EIA + Architect CA 125 II 24

25 Obr. 3 Kumulativní frekvenční distribuce hodnot ROMA pro premenopauzální ženy. Kombinace HE4 EIA + CanAg CA125 EIA % benigních případů s nižší hodnotou ROMA Benigní (N=200) Rakovina (N=34) % případů rakoviny s nižší hodnotou ROMA Hodnota ROMA: HE4 EIA + CanAg CA 125 Obr. 4 Kumulativní frekvenční distribuce hodnot ROMA pro postmenopauzální ženy. Kombinace HE4 EIA + CanAg CA125 EIA % benigních případů s nižší hodnotou ROMA Benigní (N=151) Rakovina (N=117) % případů rakoviny s nižší hodnotou ROMA Hodnota ROMA: HE4 EIA + CanAg CA

26 Rozdělení do skupin s nízkým a vysokým rizikem Pro rozdělení žen do skupin podle rizika zjištění epitelového ovariálního karcinomu byl použit algoritmus rizika ovariální malignity. Následující mezní hodnoty byly použity za účelem stanovení míry specifity 75%. Je třeba poznamenat, že různé mezní hodnoty pro rozdělení do skupin s vysokým a nízkým rizikem musí být zvoleno za základě toho, která zkouška CA125 se použije. Mezní hodnoty k zajištění míry specificity 75%, pro kombinaci zkoušky HE4 EIA + ARCHITECT CA125II: Premenopauzální ženy Hodnota ROMA > 13,1% = Vysoké riziko nalezení epitelového ovariálního karcinomu Hodnota ROMA < 13,1% = Nízké riziko nalezení epitelového ovariálního karcinomu Postmenopauzální ženy Hodnota ROMA > 27,7% = Vysoké riziko nalezení epitelového ovariálního karcinomu Hodnota ROMA < 27,7% = Nízké riziko nalezení epitelového ovariálního karcinomu Mezní hodnoty k zajištění míry specificity 75%, pro kombinaci zkoušky HE4 EIA + CanAg CA125 : Premenopauzální ženy Hodnota ROMA > 12,5% = Vysoké riziko nalezení epitelového ovariálního karcinomu Hodnota ROMA < 12,5% = Nízké riziko nalezení epitelového ovariálního karcinomu Postmenopauzální ženy Hodnota ROMA > 14,4% = Vysoké riziko nalezení epitelového ovariálního karcinomu Hodnota ROMA < 14,4% = Nízké riziko nalezení epitelového ovariálního karcinomu Mezní hodnoty k zajištění míry specificity 75%, pro kombinaci zkoušky HE4 EIA + Lumipulse G CA125II: Premenopauzální ženy Hodnota ROMA > 13,1% = Vysoké riziko nalezení epitelového ovariálního karcinomu Hodnota ROMA < 13,1% = Nízké riziko nalezení epitelového ovariálního karcinomu Postmenopauzální ženy Hodnota ROMA > 27,7% = Vysoké riziko nalezení epitelového ovariálního karcinomu Hodnota ROMA < 27,7% = Nízké riziko nalezení epitelového ovariálního karcinomu Zařazení do skupiny vysokého rizika skrytého epitelového ovariálního karcinomu s využitím hodnoty ROMA při 75% míře specifity u všech pacientek s adnexálním ložiskem je uvedeno v tabulce 1, včetně přiřazení rizika získaného pro samostatné skupiny premenopauzálních a postmenopauzálních žen, v daném pořadí. Citlivost zařazení pacientek s epitelovým ovariálním karcinomem stádia I až IV do skupiny s vysokým rizikem byla 94% a specifita byla 75%, takže 75% žen s benigním pánevním ložiskem bylo zařazeno do skupiny s nízkým rizikem. Pozitivní a negativní prediktivní hodnoty byly 58% a 97% v daném pořadí. 26

27 Tabulka 1: Zařazení do skupiny vysokého rizika skrytého epitelového ovariálního karcinomu (EOC) u pacientek s přítomným adnexálním ložiskem s použitím kombinace souprav HE4 EIA + ARCHITECT CA125 II. Premenopauzální mezní hodnota pro zařazení do vysoce rizikové skupiny při 75% míře specifity je > 13,1%, Postmenopauzální mezní hodnota pro zařazení do vysoce rizikové skupiny při 75% míře specifity je > 27,7%, Kombinace EOC a LMP - stádium I až IV Nízký maligní potenciál Premenopauzální ženy n = 234 Postmenopauzální ženy n = 268 Kombinace premenopauzálních a postmenopauzálních žen n = /34 (76%) 108/117 (92%) 134/151 (89%) 10/16 (63%) 3/6 (50%) 13/22 (59%) EOK stádium I-II 6/7 (86%) 24/28 (86%) 30/35 (86%) Stádium I IIIC a EOK Stádium I IV EOK 7/8 (88%) 35/39 (90%) 42/47 (89%) 16/18 (89%) 105/111 (95%) 121/129 (94%) a Stádium I - IIIb a stádium IIIC (předstěra negativní, mízní uzliny pozitivní) epitelového ovariálního karcinomu Falešně negativní míry a procenta epitelového ovariálního karcinomu u pacientek s přítomným adnexálním ložiskem, zařazující do skupiny s nízkým rizikem skrytého epitelového ovariálního karcinomu, s použitím hodnot ROMA při 75% míře specifity, jsou zobrazeny v tabulce 2. Rozdělení do skupin s nízkým a vysokým rizikem skrytého epitelového ovariálního karcinomu s použitím algoritmu ROMA při 75% míře specifity vedlo k celkové falešně negativní míře 6,2%. Tři (3) procenta všech případů zařazených do skupiny s nízkým rizikem představovaly epitelový ovariální karcinom. 27

28 Tabulka 2: Falešně negativní míra (FNR) a procento epitelových ovariálních karcinomů pro všechny případy zařazené do skupiny s nízkým rizikem, u pacientek s přítomným adnexálním ložiskem, s použitím hodnoty ROMA. Premenopauzální mezní hodnota pro zařazení do skupiny nízkým rizikem při 75% míře specifity je < 13,1%, postmenopauzální mezní hodnota pro zařazení do skupiny s nízkým rizikem při 75% míře specifity je < 27,7%. Epitelový ovariální Falešně negativní míra (FNR) Procento karcinomů ve skupině karcinom a s nízkým rizikem Falešně negativní karcinomy Karcinomy celkem FNR b Falešně negativní karcinomy Pravdivě pozitivní benigní % c Premenopauzální ,1% ,3% Postmenopauzální ,4% ,0% Všechny pacientky ,2% ,0% a Nádory s nízkým maligním potenciálem (LMP) nejsou zahrnuty; b FNR = Falešně negativní / (Pravdivě pozitivní + Falešně negativní); c Falešně negativní / (Pravdivě negativní + Falešně negativní) Nebyly žádné statisticky významné rozdíly citlivosti a specificity hodnoty ROMA s použitím hodnot ARCHITECT CA125 II, CanAg CA125 EIA nebo Lumipulse G CA125II k rozlišení mezi benigním onemocněním a epitelovým ovariálním karcinomem. S použitím kombinace zkoušky CanAg CA125 EIA + HE4 EIA byla citlivost pro zařazení pacientek s epitelovým ovariálním karcinomem stádia I až IV do skupiny s vysokým rizikem 93%. Pozitivní a negativní prediktivní hodnoty byly 57% a 97% v daném pořadí. S použitím kombinace zkoušky Lumipulse G CA125II + HE4 EIA byla citlivost pro zařazení pacientek s epitelovým ovariálním karcinomem stádia I až IV do skupiny s vysokým rizikem 93%. Pozitivní a negativní prediktivní hodnoty byly 58% a 97% v daném pořadí. FUNKČNÍ CHARAKTERISTIKY Přesnost Přesnost zkoušky HE4 je < 15% VK. Studie byla provedena podle pokynu Národního výboru pro klinické laboratorní normy (National Committee for Clinical Laboratory Standards - NCCLS) (CLSI) EP5-A2 (22). Panel čtyř vzorků sér byl analyzován za použití dvou výrobních šarží reagencií, ve dvou replikátech a dvakrát denně po dobu 20 dnů. Data z této studie jsou shrnuta níže.* 28

29 Vzorek Šarže reagencie Počet Střední konc. (pm) SD v průběhu (pm) VK v průběhu v% SD (pm) celková VK celkem v% ,3 0,81 1,6 2,34 4, ,0 0,69 1,4 2,17 4, ,3 1,81 2,4 2,96 3, ,4 1,73 2,4 4,70 6, ,68 2,2 12,0 4, ,21 2,2 12,8 5, ,22 1,5 14,5 3, ,71 2,3 21,6 5,6 *Reprezentativní data; výsledky v jednotlivých laboratořích se mohou od těchto dat lišit. Detekční limit Detekční limit zkoušky HE4 EIA je < 15 pm. Detekční limit (DL) odpovídá hornímu limitu 95% intervalu spolehlivosti a představuje nejnižší koncentraci antigenu HE4, kterou lze odlišit od nuly. Pro experimentální stanovení DL byl použit pokyn NCCLS EP17-A (23). Byla provedena studie, při které byly kalibrátor A (nula) HE4 a čtyři vzorky zdravých subjektů naředěné ředidlem vzorků na koncentraci 5 pm testovány ve 24 opakováních na jednu sérii ve 4 cyklech ve dvou různých dnech. Detekční limit byl vypočten následovně: DL (pm) = 5,0 pm x (1,65 x SD 0 + 1,65 x SD 5 ) / (OD 5 - OD 0 ) Detekční limit soupravy HE4 EIA byl vypočten na < 2,5 pm. Funkční citlivost Funkční citlivost zkoušky HE4 EIA je < 25 pm. Funkční citlivost se vyjadřuje jako koncentrace analytu, při které je VK 20 %. K navržení zkoušek pro stanovení funkční citlivosti byl použit pokyn NCCLS EP5-A2 (22). Byla provedena studie, ve které byl testován pětičlenný panel citlivosti v replikátech po 4 ve 2 cyklech ve dvaceti různých dnech se dvěma šaržemi reagencií. Funkční citlivost pro HE4 EIA byla stanovena na < 5 pm. Výtěžnost Střední výtěžnost zkoušky HE4 EIA je 100% ± 15%. Byla provedena studie, ve které byly k normálním vzorkům lidského krevního séra přidány naředěné vzorky pacientek se známými koncentracemi HE4. Koncentrace HE4 byla stanovena s použitím soupravy HE4 EIA a bylo vypočteno výsledné procento výtěžnosti. Reprezentativní data z této studie shrnuje následující tabulka*. 29