GRAMPOZITIVNÍ TYČINKY A KOKY TVOŘÍCÍ ENDOSPORY

Transkript

1 GRAMPOZITIVNÍ TYČINKY A KOKY TVOŘÍCÍ ENDOSPORY Kmen: Firmicutes Třída: BACILLI G+ tyčinky a koky patřící do skupiny bakterií s nízkým obsahem G+C. Tyčinky mohou tvořit endospory, podle kterých můžeme usuzovat na jejich taxonomické zařazení. Endospory přežívají zahřátí na teplotu 80 C, dále přežívají v 95% etanolu po dobu 40 minut při pokojové teplotě. Řád: Bacillales Čeleď: BACILLACAE Většinu těchto baktérií představují grampozitivní pohyblivé tyčinky. Sporulace se považuje za speciální případ buněčného cyklu baktérií, při kterém vznikají uvnitř buněk endospory vysoce odolné proti účinkům fyzikálních a chemických vlivů. Klidový stav endospor umožňuje dlouhodobé přežívání v přírodě, což má zásadní význam pro ekologii sporulujících baktérií. Z medicínského hlediska se mikroorganismy této sekce dělí do dvou hlavních rodů: rodu Bacillus s aerobně spirálujícími bakteriemi a rodu Clostridium s anaerobně spirálujícími tyčinkami. Rod: Bacillus Buňky mají tvar rovných tyčinek (jedny z největších z baktérií vůbec), které mohou mít zaoblené nebo rovné konce. Jsou uspořádány ve dvojicích za sebou, velmi často tvoří dlouhé řetězce buněk. Při sporulaci se nemění tvar sporulující buňky (sporangia), přičemž spory bývají lokalizovány v různých částech sporania. Barví se grampozitivně pouze 1

2 v časných stadiích růstu, ale v místě přítomnosti endospory zůstávají nezbarveny. Mikroorganismy jsou aerobní nebo fakultativně anaerobní, většinou kataláza pozitivní a oxidáza variabilní. Sporulace bacilů probíhá za přístupu kyslíku. S výjimkou druhu B. anthracis jsou pohyblivé, rostou v širokém rozmezí teplot s různým optimem (psychrofilní, mezofilní i termofilní). Z více než 40 druhů je medicínsky nejzávažnější B. anthracis, patogen zvířat a člověka původce onemocnění tzv. antraxu. Další druhy bacilů se podílejí na kontaminaci potravin, krmiv a surovin živočišného původu. Významné jsou především enterotoxigenní kmeny B. cereus. Významnou skupinu představují i druhy patogenní pro hmyz jako například B. thuringiensis. Je velmi zajímavé, že Bacillus athracis je geneticky (podle chromozomální DNA) neodlišitelný od druhů B. thuringiensis a B. cereus. Oba prvně uvedené druhy zřejmě vznikly evolucí z druhu B. cereus. Vzhledem k vysoké rezistenci spor jsou bacily ubikvitárními mikroorganismy, se širokým spektrem habitatů. Za primární místo výskytu většiny bacilů se považuje půda. Více než 60 druhů se dělí do tří morfologických skupin. Pro veterinární medicíny je nejvýznamnější I. morfologická skupina, která zahrnuje druhy: B. antracis, B. cereus, B. subtilis,, B. lichneformis, B. mycoides a B. thuringiensis. Růstové vlastnosti. Velmi dobře rostou na běžných agarových půdách v aerobní atmosféře. Morfologie kolonií je značně rozmanitá. Časté jsou růstové fáze S a R, vyskytuje se i plazivý růst. Ke sporulaci bacilů na půdách in vitro dochází většinou snadno při aerobní respiraci. Bacillus anthracis Definice. Z hlediska původců onemocnění je tento druh dominantním v rodu. Je patogenní pro savce, u nichž vyvolává sněť slezinnou (antrax). Vyskytuje se jako saprofyt půdy v některých distriktech, kde byly kdysi ukládány kádavery zvířat uhynulých na antrax. Morfologie. Vegetativní formu tvoří relativně velká tyčinka (1,0-1,5 x 4,0 až 8,0 μm) s rovnými konci. Během infekce vznikají in vivo charakteristické dlouhé řetězce tyčinek. Pro virulentní kmeny je navíc charakteristické pouzdro dobře barvitelné metodou podle Giemsy nebo Olta. V preparátech ze tkání uhynulých zvířat se mohou uprostřed 2

3 bakteriálních buněk nalézat spory. Kultivace. B. anthracis velmi dobře roste na běžných živných půdách. Na krevním agaru vyrůstá po 24 hodinové inkubaci v drsných koloniích bílo-šedé barvy, s typickými kořenovitými okraji a průměrnou velikostí 3-4 mm. V okolí kolonií nevzniká hemolýza. Z hlediska plně virulentního kmene se však považuje za plnohodnotné médium pouze půda s vysokým obsahem nativních bílkovin, vyšší tenzí CO 2 a přídavkem NaHCO 3. Teprve na takové půdě tvoří pouzdra. Biochemické vlastnosti. K praktické identifikaci izolátů se využívají jen zřídka. Antigenní struktura. Povrchový somatický antigen tvoří polysacharid reagující specificky s antraxovým antisérem. Další antigen je součástí komplexu antraxového exotoxinu. Je jím faktor II, který má proteinovou povahu a vlastnosti protektivního antigenu. Toxiny a faktory virulence. Plně virulentní kmeny tvoří komplexní binární toxiny a pouzdro. Komplex antraxových toxinů obsahuje tři složky: faktor I (edematózní faktor) s vlastnostmi adenylát cyklázy, faktor II (protektivní antigen) tvořený proteinem, faktor III (letální faktor) je rovněž proteinové povahy. Tyto tři faktory se tvoří pouze při infekci in vivo v organismu hostitele. Podstatné je, že jednotlivé faktory nevyvolávají zmíněný edematózní nebo letální účinek samostatně. Tyto účinky se projeví pouze při působení některé z kombinací faktorů: I a II, II a III nebo I, II a III v nichž musí být vždy přítomen faktor II. Pak hovoříme o toxinech, které jsou svou povahou binární. Edematozní toxin tvoří kombinace I+II, letální toxin kombinace II+III. Tvorba tří výše uvedených faktorových složek toxinů je kódována dvěma plazmidy px01 a px02. Na plazmidu px01 jsou regulátorové geny taxa, kontrolující produkci toxinu acpa na tomtéž plazmidu a geny kotrolující syntézu pouzdra na plazmidu px02. Pro virulenci kmene B. anthracis je významná i hemopeptická aktivita. Z buněčných faktorů virulence je nejdůležitější pouzdro, které brání opsonizaci a fagocytóze a je odpovědné za invazivitu virulentních izolátů. Patogeneze. Po pohlcení makrofágy vyklíčí spory B. anthracis v jejich vesikulách odkud unikají do cytoplasmy již v podobě vegetativní buňky. Únik z vezikuly kóduje gen atxa lokalizovaný na toxickém plasmidu px01. 3

4 Produkt genu taxa aktivuje transkribci genů pro projektivní antigen pag, edemový faktor cya a letální faktor lef. Mutanty kmenů atxa- jsou avirulentní pro myš jinak vysoce citlivou k infekci. Infekce vyvolaná B. anthracis může zůstat ohraničená jako například při kožním antraxu a nebo se může dále šířit do místních a regionální lymfatických uzlin, což vede k toxémii a bakteriémii. Pro biologický účinek binárních toxinů je základní vazba faktoru II (projektivního antigenu na membránu epiteliálních buněk. Na ten se potom váže jeden z dalších faktorů I nebo II. Letální toxin a edematozní faktor vyvolávají lokální nekrózu a rozsáhlý edém. Se zvyšováním produkce toxinů se zvětšuje rozsah nekrózy vedoucí až k orgánovém selhání. Hladina toxinů v krvi infikovaných zvířat je tak vysoká, že podání krevní plasmy z infikovaného jedince stačí k vyvolání letálního účinku u morčete po i.v. podání. Klíčovým znakem virulence kmenů je ovšem kapsula, která chrání vegetativní buňky před zničením v mikrofázích. Enzymy syntetizující kapsulu jsou kodovány geny CapA, B a C na plasmidu px02. Izoláty bez schopnosti tvořit kapsulu jsou primárně avirulentní a tvoří základ vakcín pro aktivní imunizaci zvířat a lidí. Patogenita. Nejvnímavější k infekci jsou býložravci: zejména skot, ovce, kozy a koně ale i volně žijící zvířata. Poměrně méně vnímavé je prase. Kočka a pes, jako masožravci patří k nejméně vnímavým živočichům, přesto se mohou infikovat za příznaků faryngitídy. Ptáci jsou vzhledem k teplotě svého těla téměř rezistentní, podobně jako studenokrevná zvířata. Z laboratorních zvířat jsou vnímavá morčata a myši, u kterých dochází k úhynu do 72 h. K infekci dochází obvykle perorálně krmivem kontaminovaným sporami, vyloučena není ani infekce aspirací. Po vyklíčení spor ve faryngu nebo předžaludku se vyvíjejí lokální nekrózy s výrazným edémem. Pomnožený původce rychle proniká lymfatickou cestou do krevního oběhu a lokalizuje se přímo v kapilárách. Produkovaný komplexní toxin zvyšuje vaskulární permeabilitu a tím dochází ke koncentraci krve a úniku tekutin do tkání. Postupně se rozvíjí septikémie končící letálně. Infikovaný jedinec vylučuje původce všemi exkrety i nesraženou tmavou krví vytékající z přirozených tělních otvoru. V této krvi, pokud je v kontaktu se vzdušným kyslíkem, dochází k masivní sporulaci. Spory zůstávají v prostředí životaschopné po desítky let. Charakter onemocnění člověka závisí na způsobu infekce. Perakutní průběh následuje po aspiraci spor a jejich průniku do dolních cest 4

5 dýchacích. Ve vyspělých zemích Evropy se antrax zvířat vyskytuje pouze sporadicky v souvislosti s importem surovin živočišného původu, zejména kůží obsahujících spory B. anthracis z jiných světadílů. Infekce zvířat. Sněť slezinná může probíhat perakutně (přežvýkavci), akutně až subakutní (přežvýkavci a koně), kdy končí letálně. U všežravců a masožravců probíhá subakutně až chronicky (prase a masožravci). Při perakutním průběhu skot a ovce náhle hynou s příznaky výtoku tmavé nedostatečně sražené krve z přirozených tělních otvorů. Častý je i septikemický průběh (1-3 dny) se všeobecnými příznaky, tympanií bachoru a edematózními otoky krku. Onemocnění koní se projevuje kolikovými bolestmi a otoky krku. Prasata onemocní za příznaků faryngytídy, objevit se může i kožní antrax na rypáku. Masožravci onemocní po konzumaci kontaminovaného masa za příznaků místního zánětu faryngu a regionálních mízních uzlin s výrazným otokem krku, který může vést k úhynu v důsledku asfyxie. Antrax člověka se vyskytuje po aspiraci spor nebo po perorálním podání kontaminované potraviny. Daleko nejčastější je však antrax kožní, související s infekcí oděrek. Existují tedy formy plicní, střevní, kožní ale i postižení CNS. B. anthracis byl považován za možnou biologickou zbraň již ve druhé světové válce. Vývoj těchto biologických zbraní byl ukončen mezinárodní úmluvou v 60. letech minulého století. Antrax se v nedávné době stal předmětem bioterorizmu v USA vzhledem k vysoké stabilitě spor a nízké infekční dávce pro člověka při snadném přenosu aerogenní cestou. Imunita. V začátcích přirozené infekce mají rozhodující vliv mechanismy buněčné imunity. Specifická humorální imunita se při perakutním nebo akutním průběhu infekce neuplatňuje. Účinná humorální imunita zvířat se zajišťuje vakcinací zdravých zvířat nebo podáním hyperimunního antiséra u zvířat podezřelých z infekce. Antibiotika. B. anthracis je velmi citlivý k účinkům penicilínu, i když existují také rezistentní kmeny. Pro léčbu člověka se používá ciprofloxacin. Biologické preparáty. Pro diagnostické účely se vyrábějí pozitivní precipitační sérum a extrakt sněti slezinné. Pro specifickou prevenci je k dispozici akapsulární živá vakcína proti sněti slezinné. Moderně 5

6 koncipované vakcíny, založené na principu chemovakcíny, využívají proteinový antigen adsorbovaný na nosič. K léčebným účelům se vyrábí sérum proti sněti slezinné. Historie přípravy vakcín byla velmi zajímavá. Pasteur zahřátím kmene odstranil plazmid kódující toxiny, čímž nedosáhl projektivního účinku. Toho dosáhl Sterne, který odstranil plazmid px02 (kódující kapsulu). Bakteriologická diagnostika. Využívá se přímý průkaz původce. Mikroskopickým vyšetřením otiskových preparátů tkání, roztěrů periferní krve a z uhynulých zvířat se prokáží řetězce tyčinek se zřetelnými pouzdry při barvení podle Olta. Jako zlatý standard se provádí průkaz izolací na krevním agaru. Při vyšetření kontaminovaného materiálu se původce izoluje na selektivní půdě nebo biologickým pokusem na myši, která hyne do 24 h. K průkazu lze dále použít řadu doplňujících testů včetně PCR. Bacillus cereus Definice. Je saprofytem půdy a vody, kde jeho spory dlouhodobě přežívají. Spory následně kontaminují suroviny živočišného původu a některé potraviny zejména mléko. Jako příležitostný patogen vyvolává v podobě toxinogenních kmenů průjmová onemocnění člověka a zvířat, z nichž nejznámější je intoxikace z potravin způsobená účinky enterotoxinů. Dále je příčinou infekcí ran a oka člověka a zvířat. Morfologie. Velké tyčinky mají zaoblené konce, často se nacházejí v řetězcích. Spory jsou oválného tvaru o velikosti 4 5 µm dlouhé a 1,0 1,5 µm široké a ve vegetativní buňce jsou uloženy subterminálně. Povrch spor je vysoce hydrofobní, což zvyšuje jejich adhezivní kapacitu. Navíc mají několik dlouhých apendages na povrchu (viditelné v elektronovém mikroskopu), které byly popsány jako faktory zvyšující adhezi například na povrchu oceli nebo skla. Na rozdíl od B. anthracis tento druh netvoří pouzdra in vivo. Růstové vlastnosti. Na krevním agaru se objevují velké kolonie (více než 5 mm v průměru) v růstové R-fázi, obklopené širokou zónou úplné hemolýzy a úzkou zónou neplné hemolýzy, kterou vytváří fosfolipáza C (lecitináza). 6

7 Faktory patogenity a virulence. Potenciálními faktory virulence jsou toxiny s biologickým účinkem na erytrocyty tzv. hemolyziny (cereolyzin O a cereolyzin AB) a fosfolipáza C. B. cereus tvoří dále různé exotoxiny, jejichž účinky se projevují ve střevě. Enterotoxiny. Až dosud bylo popsáno celkem 5 enterotoxinů a jeden ionoforům podobný emetický toxin. Zatímco průjmový enterotoxin je citlivý k běžně používaným teplotám a je ničen teplotami 56 C asi po pěti minutách, emetický toxin je velmi odolný k běžně používaným kulinářským teplotám a je spolehlivě ničen až teplotami 126 C po 90 minutách. Za příčinu průjmového syndromu člověka při otravách potravinami jsou považovány tyto enetrotoxiny: hemolytický enterotoxin (Hbl), nehemolytický enterotoxin (Nhe) a cytotoxin K (Cyt K). Hemolytický enterotoxin (Hbl) je třísložkový hemolyzin, který zahrnuje složky: B-vázající, L 1 a L 2 lytické s hemolytickou a cytotoxickou aktivitou. Tento toxin má také dermonekrotickou aktivitu a způsobuje poškození cévní permeability. Dále je příčinou hromadění tekutiny v závěsu střevních kliček ilea v biologickém pokusu na zvířeti. Hbl je proto považován za základní virulentní činitel průjmu způsobeného B. cereus. K vyvolání enterotoxické odpovědi stačí tak malé množství jakým je 5 mg. Patogeneze onemocnění. K intoxikaci dochází potravou nebo krmivem v nichž došlo k pomnožení toxinogenního kmene a tvorbě toxinů in vitro. Příčinou je klíčení spor v kontaminovaném jídle po jeho zahřátí a následném zchlazení. U člověka se odlišuje emetický syndrom s inkubační dobou od 6 do 12 h a mnohem častější průjmový syndrom s inkubační dobou h. po jídle. Antibiotika. Při dlouhodobějším podávání kontaminovaného krmiva se neobejdeme bez léčby Biologické preparáty. Většina probiotických preparátů používaných pro zvířata do roku 2000 byla stažena z trhu v zemích EU po té, co se u používaných kmenů prokázala přítomnost genů kódujících enterotoxiny. Bacillus subtilis Vyskytuje se v půdě a vodě. Jako potenciální patogen vyvolává sporadické 7

8 mastitidy skotu. Velmi snadno sporuluje. Na krevním agaru rostou kolonie v S-fázi, na vlhkém agaru se aktivně šíří. K určení druhu slouží podobně jako v případě B. cereus biochemická aktivita. Druhy patogenní pro hmyz Bacillus thuringiensis Je patogenní pro larvy hmyzu, které jsou citlivé vůči jeho letálnímu toxinu. Spory mikroba se v komerčně připravené formě užívají jako biologický insekticidní přípravek. Čeleď: PAENIBACILLACEAE Nová čeleď zahrnující řadu původních druhů z rodu Bacillus. Rod: Paenibacillus Paenibacillus larve Je původcem moru včelího plodu, který je jednou z hlavních příčin likvidace včelstev v současnosti u nás i v okolních státech. Třída: Clostridia Čeleď: CLOSTRIDIACEAE Rod: Clostridium Zahrnuje tyčinky s oblými konci, které jsou rovné nebo zahnuté, někdy s různým průměrem. Tvoří oválné nebo sférické spory, které obvykle 8

9 zvětšují šířku vegetativní buňky. Grampozitivně se barví především ve velmi mladých stadiích růstu. Většina druhů se řadí k obligátním anaerobům, některé však vykazují různou šíři tolerance ke kyslíku (C. perfringens). Cukry štěpí fermentativně, jsou obvykle kataláza negativní a pohyblivé. Rostou v poměrně širokém teplotním rozmezí s optimem 37 C. Habitat. Klostridia jsou ubikvitární mikroorganismy. Běžně se vyskytují v půdě, odpadních kalech, tlejícím organickém materiálu a produktech živočišného i rostlinného původu. Vyskytují se i jako saprofyti a komenzálové ve střevním ústrojí zvířat a člověka. Jen malá část z více než 90 druhů je pravými patogeny zvířat a člověka. Morfologie. Z klinických vzorků mívají klostridia tvar krátkých, silných nebo tenkých tyčinek až dlouhých vláken. In vitro se může velikost buněk měnit v závislosti na druhu média. Nález spor je charakteristický v otiskových preparátech z infikovaných tkání pocházejících z uhynulých zvířat. In vitro se spory klostridií zjišťují v kulturách získaných za anaerobních podmínek na sporulačních médiích. Kultivace. Medicínsky významná klostridia rostou na komplexních půdách pro anaeroby, jako je krevní agar s přídavkem cysteinu, vitamínu K a heminu. K produkci spor se užívají speciální půdy. Biochemická aktivita. Z biochemických vlastností má rozhodující význam proteolytická nebo sacharolytická aktivita, čehož se využívá k jejich rozdělení do tří skupin. Produktem metabolismu jsou biologicky vysoce účinné toxiny. Toxiny se určují biologickým pokusem na myši, popř. morčeti. Přitom je třeba mít na zřeteli, že některé klostridiální toxiny vznikají jako netoxické prototoxiny, které se musí v těle hostitele nejprve aktivovat proteolytickými enzymy (například trypsinem). Součástí přesné identifikace toxinů je jejich neutralizace typově homologními specifickými antiséry v biologickém pokuse na zvířeti. Clostridium botulinum Definice. Je původcem botulismu zvířat a člověka, který vzniká následkem intoxikace jeho toxiny s charakterem neurotoxinů. C. botulinum je půdní 9

10 saprofyt, který se množí v anaerobním prostředí mimo organismus zvířat, zejména v substrátech živočišného původu (kadaverech), ale i kalech. Důležité je fenotypové členění kmenů do toxinotypů A až G. Kultivace. Na obohaceném krevním agaru vyrůstá v koloniích velikosti 1,0-4,0 mm, které jsou ploché, s nepravidelnými okraji, obvykle obklopené zónou hemolýzy. Biochemické vlastnosti. Na základě metabolické aktivity se kmeny v rámci druhu rozdělují do čtyř skupin: I. Skupina - kmeny typu A a proteolytické kmeny typu B a F. II. Skupina - kmeny typu E a neproteolytické kmeny typu B a F. III. Skupina - kmeny typu C i a D. IV. Skupina proteolytické kmeny typu G. Antigenní struktura. Rozhodující význam mají antigeny, jejichž nositelem jsou produkované toxiny. Druh zahrnuje celkem 7 toxických typů (označených velkými písmeny A, B, C, D, E, F a G), které se odlišují na základě antigenní specifity. Neurotoxiny typů A, B, E a F jsou monospecifické vzhledem k možnosti jejich neutralizace pouze příslušným typovým antisérem. Částečně zkřížená neutralizace se vyskytuje mezi typy C a D. Toxiny a faktory virulence. Všechny produkované toxiny (A-G) mají vlastnosti neurotoxinů. Netvoří se obvykle v živém organismu, nýbrž ve tkáních uhynulých zvířat a ve vhodných substrátech mimo tělo. Typická je tvorba toxinů v kontaminovaných potravinách a surovinách živočišného původu. Neurotoxiny se uvolňují (podobně jako tetanospazmin C. tetani) při ruptuře nebo autolýze buněčné stěny, tedy v pozdní buněčné fázi růstu. Toxiny se tvoří v širokém rozmezí teplot (4-40 C) i hodnot ph (4,7-8,5). Neurotoxiny vznikající v přirozených podmínkách tvoří proteinový komplex, který obsahuje protein s toxickou aktivitou a netoxický protein. Proteinový komplex odpovídá za relativní toxicitu a patogenitu jednotlivých typů. Botulotoxiny jsou termolabilní, v přírodě až dosud nejúčinnější známé toxiny. Toxicita pro myš dosahuje 10 7 až 10 8 LD 50 v 1 mg proteinu. Z jednotlivých typů je nejtoxičtější typ A, kdežto typy E a F mají účinek snížený. In vitro se toxiny získávají v krystalické formě. Patogenita. K intoxikaci jsou vnímaví savci (s výjimkou některých šelem) a 10

11 ptáci. Zvířata se infikují pozřením krmiva obsahujícího toxin. V trávicím ústrojí se toxin aktivuje působením proteolytických enzymů a pak se resorbuje do lymfy a krve, kterou se šíří do dalších orgánů. Napadá periferní nervové systémy, kde blokuje uvolnění acetylcholinu na presynaptických membránách cholinergních nervů. Vyvolává tak neuromuskulární paralýzu. Předpokládá se rovněž účinek na CNS, zejména gangliové buňky. Následkem ireverzibilního účinku botulotoxinů dochází k progresivním parézám motorického nervového systému. Infekce zvířat. Klinické příznaky botulismu se projevují především poruchami pohybu, neschopností polykat vodu a krmivo, parézami a paralýzami zadních a později i předních končetin, zástavem peristaltiky a úhynem. V našich podmínkách je aktuální botulismus v chovech masožravých kožešinových zvířat, kachen a bažantů. Drůbež ztrácí možnost pohybu, leží na hrudi s ochrnutými křídly a hlavou opřenou zobákem o zem. K úhynu dochází za příznaků ataxie. Imunita. Získaná imunita po vakcinaci toxoidem příslušného toxinotypu se zakládá na neutralizačním účinku specifických IgG krevním séru. Antibiotika. Mikroorganismus je citlivý na účinky penicilínu G a tetracyklínů. Vzhledem k účinkům toxinů nemá léčba antibiotiky smysl. Biologické preparáty. V rámci specifické prevence se vakcinují ohrožená zvířata. K tomu se užívá monovalentní nebo bivalentní toxoidová vakcína. Bakteriologická diagnostika. Zásadní význam má průkaz botulotoxinů biologickým pokusem, který zároveň slouží k určení příslušného toxinotypu ve vyšetřovaném materiále (krmivo, zvratky, obsah žaludku a střeva, tkáně parenchymatózních orgánů). Clostridium tetani Jako saprofyt se vyskytuje ubikvitárně v půdě a trávicím ústrojí člověka a zvířat, zejména koní. Spory dlouhodobě přežívají především v půdě. Je původcem onemocnění, které se označuje jako tetanus. U koní, skotu, ovcí a člověka se projevuje se zvýšenou motorickou dráždivostí a tonickými křečemi svalstva. Tetanus nejčastěji vzniká infekcí po předešlém poranění, kde dochází ke klíčení spor. 11

12 Morfologie. Buňky ve tvaru štíhlých tyčinek velikosti 1,5 x 2,0-18,0 μm se vyskytují jednotlivě nebo ve dvojicích. Grampozitivně se barví pouze v kulturách mladších 24 h. Kulaté spory uložené terminálně mění tvar sporangia na charakteristické plektridium. Kultivace. Na obohaceném krevním agaru vyrůstá po h inkubace při 38 C v koloniích velikosti 3,0-6,0 mm v průměru. Kolonie jsou průhledné, šedé barvy, s matným povrchem, nepravidelnými okraji, obvykle obklopené širokou zónou hemolýzy. Antigenní struktura. Na základě somatického O antigenu a rozdílných H antigenů se rozlišuje 10 sérovarů (I-X). Vlastnosti antigenů mají i solubilní toxiny, které jsou heterologní a antigenně jednotné. Toxiny a faktory virulence. C. tetani produkuje několik toxinů. Nejvýznamnější je tetanospasmin, který má účinky neurotropního toxinu a sám o sobě vyvolává klinické příznaky tetanu. Účinnost krystalického toxinu je podobná botulotoxinu. V 1 mg proteinu je obsaženo 1,6-4,8 x 10 7 LD 50 pro myš. Citlivost toxinu k proteolytickým enzymům podmiňuje jeho parenterální podání. Tetanospasmin se uvolňuje z buněk pomnožených v bujónových kulturách teprve v pozdějších stadiích růstu. Druhým toxinem je tetanolyzín. Je to oxigenlabilní hemolyzín, který vyvolává intravaskulární hemolýzu u králíků a změny EKG po experimentální aplikaci. Patogenita. K infekci jsou vnímaví především lichokopytníci, méně již přežvýkavci a prasata. Obecně vnímavější jsou mláďata. K infekci je vnímavý rovněž člověk. C. tetani nepatří k invazním mikrobům. V tkáních hostitele se pomnožuje v traumaticky poškozeném místě, kam proniká jako mikrob kontaminující ránu. Možný je i endogenní způsob infekce, který souvisí s poškozením střevní stěny. Lokálně uvolněný toxin se váže na motorická zakončení (myoneurální ploténky) periferních nervů. Prostřednictvím perineurální tkáně. postupuje dostředivě do prodloužené míchy. Při masívní tvorbě je možné i hematogenní šíření. Tetanospasmin, který se vyznačuje afinitou ke gangliosidu, se váže na motorické neurony v míše a prodloužené míše. Vyvolává blokádu neuromuskulární transmise potlačením centrálních inhibičních vlivů na nervové buňky. To vede ke zvýšené reflexní odpovědi na periferní podněty, tonickým křečím a tetanickým kontrakcím. Výskyt tetanu je ojedinělý, onemocnění nemá 12

13 nakažlivý charakter. Infekce zvířat. K hlavním klinickým příznakům tetanu patří ztuhnutí svalstva, trismus svalstva, opistotonus, vtažené břicho, dýchavičná stružka a mírně zdvižený ohon. Různou úroveň má zvýšená dráždivost zvířat. V akutních případech zvířata hynou po prvním dni. Nejvyšší letalita provází onemocnění ovcí, zvláště jehňat. Méně častá je u prasat a koní, nejnižší u skotu. Imunita. Aktivní i pasívní umělá imunita se zakládá na neutralizačním účinku specifických protilátek. Imunita po vakcinaci toxoidem je dlouhodobá. Antibiotika. Citlivost je dobrá především k betalaktamovým antibiotikům. Biologické preparáty. Polymerací tetanového toxinu účinkem formolu vzniká toxoid, používaný k vakcinaci. K terapeutickým účelům se vyrábí antitoxické koňské sérum. Bakteriologická diagnostika vychází z možnosti přímého průkazu původce mikroskopickým vyšetřením otiskových preparátů z poškozených tkání. Vysoce specifické je použití imunofluorescenční techniky. Možná je rovněž izolace původce kultivací po předešlém zahřátí vzorku (70 C po dobu 15 min). Nejvyšší hodnotu má průkaz toxinu biologickým pokusem. Během 1 až 3 dní po i. m. aplikaci myš vykazuje klinické příznaky tetanu. Clostridium chauvoei Je to saprofyt půdy. Jako obligátní patogen vyvolává sněť šelestivou přežvýkavců, která postihuje kosterní svalstvo a podkoží různých částí těla. Morfologie. Buňky se vyskytují v podobě velkých pleomorfních tyčinek 0,5 x 3,0-8,0 μm, jednotlivě nebo ve dvojicích. Spory se nacházejí subterminálně, pouzdro netvoří. Jsou pohyblivé. Kultivace. Od kolonií C. botulinum se liší granulárním povrchem. Antigenní struktura. Buněčná stěna obsahuje jednotný somatický antigen. Známé jsou i bičíkové antigeny. Toxiny a faktory virulence. Významná je tvorba nekrotizujícího toxinu, 13

14 letálního pro myš, který se označuje jako alfatoxin. Další toxiny mají charakter enzymů. Patogenita. K infekci jsou vnímaví skot, ovce a někteří další přežvýkavci. Skot se obvykle infikuje perorálně krmivem nebo vodou. Původce vyvolává lokální infekci, která přetrvává jako latentní. Rozvoj infekce a vznik klinických příznaků souvisí s predispozičním poškozením tkáně a šířením původce do svaloviny. Toxiny a další látky vzniklé při rozpadu tkání odpovídají za degenerativní změny orgánů a srdečního svalu. U ovcí může dojít k exogenní infekci prostřednictvím kontaminace ran. Také v tomto případě dochází ke všeobecné toxikoinfekci s letálním koncem. Onemocnění se vyskytuje vzácně a nemá nakažlivý charakter. Infekce zvířat. Sněť šelestivá je charakteristická lokálním otokem s tvorbou plynu, především ve svalovině končetin, a horečkou dosahující 42 C. Po poklesu horečky zvířata hynou. Imunita. V obraně organismu mají význam pouze protilátky vzniklé po vakcinaci. Biologické preparáty. V ohrožených oblastech se zvířata vakcinují inaktivovaným bakterinem. Bakteriologická diagnostika. Původce se prokazuje přímo v otiskových preparátech ze svaloviny. Výhodné je použití imunofluorescenční techniky. Vzhledem k sepsi může být původce prokázán i v parenchymatózních orgánech. Kultivační vyšetření je úspěšné pouze při vyšetření čerstvých kadáverů. Původce se identifikuje na základě výsledků neutralizačních testů v biologickém pokusu. Clostridium septicum Jako saprofyt se vyskytuje v půdě a pravděpodobně ve střevním obsahu mnoha zvířat. Je původcem maligního edému (nepravé sněti šelestivé) zvířat a dále snětivého zánětu slezu ovcí. Morfologie. Buňky pocházející z bujónové kultury jsou rovné nebo zahnuté, velké 0,6-1,9 x 1,9-15 μm. Vyskytují se jednotlivě nebo v párech. Na rozdíl od dalších patogenních druhů tvoří dlouhá vlákna na povrchu 14

15 jater infikovaných zvířat. V mladých kulturách se barví grampozitivně. Barvení je nestejné, některé úseky jsou odbarvené. Spory jsou oválné, subterminální a rozšiřují buňku. Kultivace. V okolí kolonií na krevním agaru vzniká úplná hemolýza. Optimální teplota růstu se pohybuje při C, roste však i při 44 C. Toxiny a faktory virulence. Z několika produkovaných toxinů má největší význam oxigenstabilní hemolyzín s nekrotizujícími vlastnostmi, označovaný jako alfatoxin. Patogenita. K infekci jsou vnímavá teplokrevná zvířata, především kůň, ovce a skot. Méně vnímaví jsou prase a drůbež. Maligní edém vzniká jako následek infekce ran nebo metastaticky jako následek baktériemi po průniku z gastrointestinálního ústrojí. V postižených místech se rozvíjí zánětlivý edém. Při snětivém zánětu slezu dochází k infekci po penetraci původce abomasální stěnou. Postupně se rozvijí fatální bakteriémie. K infekci jsou vnímavá především jehňata a mladé ovce do 1 roku. Infekce zvířat. Maligní edém provází vznik zánětlivého otoku v místě poranění s tendencí rychlého šíření. Postupně se objevují celkové příznaky. Během 2-3 dní od počátku onemocnění postižené zvíře hyne. Snětivý zánět slezu ovcí probíhá perakutně. Jehňata hynou již několik hodin od vzniku prvních příznaků. Bakteriologická diagnostika. K rychlému průkazu původce se užívá imunofluorescenční vyšetření otiskových preparátů z tkání. Možný je rovněž průkaz toxinů v edematózní tkáni a jejich identifikace neutralizačním testem. Clostridium perfringens Definice. Je saprofytem a komenzálem, který se vyskytuje v půdě a střevním traktu člověka a zvířat a ve výkalech. Je patrně jedním z nejrozšířenějších anaerobních druhů bakterií. Optimální je růst v slabě alkalickém prostředí (ph 8,0), na rozdíl od ostatních klostridií je aerotolerantní. Jako potenciální patogen vyvolává plynatou sněť přežvýkavců po anaerobní traumatóze, u nás nejčastější jsou především enterotoxémie sajících mládat (selat, telat), provázené průjmy a někdy i 15

16 vysokou morbiditou. Morfologie. Buňky mají tvar rovných tyčinek o velikosti 0,6-2,4 x 1,3 až 19,0 μm, s hrubšími konci. Vyskytují se jednotlivě nebo v párech. Jsou grampozitivní a nepohyblivé. Na rozdíl od ostatních druhů klostridií sporulují jen výjimečně. Jestliže jsou spory přítomny, rozšiřují buňku. V hostitelské tkáni tvoří většina kmenů pouzdro polysacharidové povahy. Kultivace. Na krevním agaru vyrůstají v okrouhlých koloniích šedavé barvy, velikosti 2-5 mm v průměru. Druh a rozsah hemolýzy, vznikající kolem kolonií, záleží na druhu použité krve a typu C. perfringens. Na krevním agaru s ovčími erytrocyty vzniká zóna úplné hemolýzy vyvolaná thetatoxinem, která je obklopena vnější zónou neúplné hemolýzy způsobenou alfatoxinem (fosfolipázou C). Tento toxin se svými účinky podobá betatoxinu S. aureus. Optimální teplota růstu typů A, D a E dosahuje 45 C, u typů B a C 37 C i 45 C. Biochemické vlastnosti. Fermetuje řadu uhlohydrátů což se využívá v biochemických testech. Antigenní struktura. Na základě antigenní specifity letálních toxinů se dělí do 5 typů (A, B, C, D a E). Kromě toho obsahuje i na buňku vázané antigeny: somatický a kapsulární. Toxiny a faktory virulence. Pro určení druhu je významná tvorba lecitinázy (alfa toxinu), která se prokazuje u všech typů. Z řady produkovaných toxinů jsou významné především ty, které se označují jako "hlavní" tedy letální toxiny. Je to například toxin beta 1, charakteristický pro patogenní typ C. V současnosti se prokazuje také toxin beta 2, který se však nachází nejenom u kmenů typu C ale i některých kmenů typu A, kde je pravděpodobně odpovědný za jejich vyšší virulenci. K průkazu tvorby letálních toxinů se užívá letálně neutralizační test na myších a rovněž kožní neutralizační test na morčeti. Nověji se toxinotypizace provádí průkazem genů kodujících tvorbu toxinů, tedy cpb1 a cpb2 pro beta toxiny. Sekundární význam mají neletální toxiny. Patogeneze. K infekci dochází pozřením spor, které klíčí v prostředí tenkého střeva, kde se dokáží během několika hodin rychle množit. Toxiny zaplaví střevo a působí cytotoxicky na enterocyty za vniku nekróz nebo hemoragií. Onemocnění má akutnější průběh během 1-4. dne po narození 16

17 vzhledem k nízké produkci trypsinu. Po tomto období se forma onemocnění mění na subakutní a chronickou. Ke sporulaci dochází rovněž v anerobním prostředí střeva při ph vyšším než 6,6. Při sporulaci dochází také k uvolňování letálních toxinů z bakteriálních buněk. Spóry jsou potom masivně vylučovány výkaly, čímž dochází ke kontaminaci prostředí. Patogenita. K infekci jsou vnímavé různé druhy zvířat ale i člověk v závislosti na příslušném typu C. perfringens A až E. Průjmová onemocnění u mláďat savců vznikají krátce po narození, jako důsledek kolonizace tenkého střeva patogenními typy s produkcí letálních toxinů ve střevě při sporulaci. K infekci je vnímavá rovněž hrabavá drůbež. V chovech brojlerů se onemocnění vyvíjí v podobě nekrotické enteritídy, která je příčinou chronických průjmů a vysokých ztrát úhynem. Plynatá sněť, vzniklá ve svalovině následkem kontaminace rány například fekáliemi, se rozvíjí podobně jako infekce vyvolané C. septicum. Galaktogenní cestou se infikuje i mléčná žláza, ve které vzniká nekrotický zánět. Infekce zvířat. Enterotoxémie probíhají jako perakutní a akutní onemocnění s fatálním koncem během několika dní, zejména v případě infekcí typem C u selat a telat. Infekce typem A nají vysokou morbiditu s nízkou mortalitou. Infekce se může rozšířit v chovu v důsledku kolonizace matek uvedenými kmeny. Ojediněle se vyskytující plynatá sněť má podobný průběh jako při onemocnění vyvolaných C. septicum. Antibiotika. Původce je citlivý na penicilinová antibiotika a makrolidy. Biologické preparáty. Účinné jsou toxoidové vakcíny proti typu C. Bakteriologická diagnostika. Přímý průkaz původce je založen na kultivačním vyšetření, které potvrdí masivní nález v postižené tkáni nebo střevním obsahu. Typizace probíhá s použitím PCR při detekci genů kódujících letální toxiny a toxin alfa. C. difficile Vyskytuje se ve střevě člověka a zvířat. Po té co byly toxinogenní kmeny popsány jako původci enterokolitíd člověka, byly prokázány v podobné souvislosti případy kolitíd u hříbat a novorozených selat. K onemocnění 17

18 dochází v souvislosti s dysmikrobií a přemnožením C. difficile, které jsou způsobeny různými faktory, zejména některými skupinami antibiotik a nebo u novorozených jedinců s nedostatečnou kolonizací. Faktory patogenity a virulence. Patogenní kmeny se vyznačují tvorbou některého z toxinů, které se označují písmeny jako A a B. Toxin A je charakterizován jako enterotoxin a toxin B má cytotoxické účinky. Oba mají letální účinky. Toxiny jsou produkovány samostatně a méně často v kombinaci. Nepatogenní kmeny tyto toxiny netvoří a běžně se vyskytují ve střevě. U patogenních kmenů se prokazuje produkce kapsulky a pili. Patogeneze. U zvířat není ještě přesně objasněna, ale má se za to, že k infekci patogenními kmeny a jejich následnému přemnožení dochází v enzooticky zamořeném prostředí stájí. Působením některého z toxinů dochází ke vzniku akutní kolitídy. Toxiny jsou přítomny ve vysoké koncentraci v obsahu tlustého střeva stejně jako produkující klon. Patogenita. Citlivá jsou především mláďata. V USA je v současné době neonatální průjem selat vyvolaný toxinogenními kmeny C. difficile dominantní problém na porodnách. U nás jsou zaznamenány rovněž první případy této dosud neznámé nemoci selat, které se vyznačují akutním nehemoragickým spíše vodnatým průjmem. Časté je rovněž onemocnění hříbat intenzivních chovech, kde dochází k hemoragickým průjmům. Popsány byly rovněž nosokomiální případy výskytu chronických průjmů u psů. Diagnostika. Ve výkalech zvířat i člověka se prokazuje přítomnost některého ze dvou toxinů pomocí imunochromatografické metody. Kultivace nemá smysl s ohledem na běžnou přítomnost nepatogenních kmenů ve střevě. 18

19 PRAVIDELNÉ NESPORULUJÍCÍ GRAMPOZI- TIVNÍ TYČINKY Řád: Lactobacillales Čeleď: LACTOBACILLACEAE Rod: Lactobacillus Definice. Mají tvar pravidelných tyčinek, jejichž velikost se mění od dlouhých až ke krátkým buňkám. Vyskytují se v palisádách nebo v krátkých řetězcích. Barví se grampozitivně. Pouzdro a endospory netvoří. Jsou fakultativně anaerobní občas mikroaerofilní, s fermentativním metabolismem. Nejméně polovinu konečných produktů metabolismu uhlíku tvoří kyselina mléčná. Netvoří katalázu ani cytochromy. Jsou většinou nepohyblivé. Optimální teplota růstu se pohybuje v rozmezí C. Laktobacily rostou pouze na komplexních médiích se všemi výživnými substráty, včetně derivátů nukleových kyselin. Optimální hodnota ph půdy potřebná pro růst dosahuje rozpětí 5,5-6,2. Růst na povrchu tuhých médií podporuje anaerobní atmosféra nebo redukce tenze kyslíku a přídavek 5-10 % CO 2. Biochemická aktivita. Na základě produktů fermentace cukrů se laktobacily dělí do tří skupin: I. skupina - Laktobacily homofermentativní (jediným produktem je kyselina mléčná): L. delbrueckii a jeho poddruhy lactis, bulgaricus, L. helveticus jsou druhy vyskytující se v mléku a mléčných výrobcích L. acidophilus se vyskytuje ve velké koncentraci v obsahu střeva a na sliznicích zažívacího traktu a vaginy II. skupina - Laktobacily fakultativně heterofermentattivní (produktem je kyselina mléčná nebo směs kys. mléčné, octové, mravenčí a etanolu): L. casei, L. plantarum 19

20 III. skupina - Laktobacily obligátně heterofermentativní: L. kefir, L. fermentum se vyskytují v mléku, mléčných výrobcích a fermetovaných rostliných produktech Význam pro hostitele. Laktobacily se obecně považují za apatogenní baktérie. Laktobacily jsou jednou z významných součásti mikroflóry tenkého a tlustého střeva zvířat a člověka. Jsou zastoupeny i v mikroflóře bachoru. Vyskytují se také na sliznici dutiny ústní a vagíny. Mimořádný význam mají pro potravinářskou mikrobiologii vzhledem ke svému výskytu v mléku a mlékárenských výrobcích, masu a masných výrobcích. Užívají se rovněž při zpracování rostlinných materiálů, jako jsou mléčné kvašení siláží a výroba fermentovaných nápojů, zejména vín, moštů a piva. Čeleď: LISTERIACEAE Rod: Listeria Definice. Listerie jsou pravidelné rovné tyčinky, které netvoří pouzdro ani spory a nejsou acidorezistentní. Pozitivní je výsledek katalázového testu. Jsou pohyblivé pouze při teplotách do 30 C. Rostou velmi dobře v širokém teplotním rozmezí 25 až 37 C a pomalu při 4 C. Listerie se vyskytují na rostlinách i v půdě a následně v organismu zvířat, zejména v trávícím traktu. Pro zvířata jsou patogenní druhy L. monocytogenes a L. ivanovii, nepatogenní je druh L. innocua. Morfologie. Zahrnuje pravidelné, krátké tyčinky velikosti 0,4-0,5 x 0,5-2,0 μm. V preparátech se vyskytují samostatně nebo ve dvojicích svírajících ostrý úhel, především pak v uskupeních připomínajících palisády. Ve starších kulturách nebo v kulturách rostoucích v R-fázi se nacházejí vlákna dlouhá 6-20 μm. Buňky v čerstvých kulturách se barví grampozitivně. Listeria monocytogenes Definice. Je saprofyt a epifyt sliznic střevního ústrojí člověka a zvířat. Vyskytuje se v půdě a na rostlinách. Jako potenciální patogen 20

21 se vyznačuje fakultativně intracelulárním parazitizmem. Vyvolává listeriózu zvířat a člověka, která se považuje za zoonózu, vzhledem k přenosu původce potravinami živočišného původu (sýry, tepelně neupravené masné výrobky) na člověka. Kultivace. Roste velmi dobře na krevním nebo tryptózovém agaru. Po 24 h inkubace při 37 C vytváří okrouhlé kolonie modrošedé barvy, velikosti 1,0 až 2,0 mm v průměru. Na krevním agaru vyvolává částečnou lýzu erytrocytů, která nepřesahuje okraje kolonií a prokáže se pouze po odstranění kolonií. K průkazu hemolytické aktivity kmenů L. monocytogenes slouží také CAMP-test buď v klasickém provedení s kmenem S. aureus, nebo v novější modifikaci s EQUI-faktorem Rhodococcus equi. Pro izolaci L. monocytogenes z klinického materiálu se používá metoda selektivního pomnožení a selektivní izolace. Biochemické vlastnosti. Významné jsou zejména schopnosti fermentace cukrů. Antigenní struktura. Základ tvoří, podobně jako u rodu Salmonella, somatické O antigeny a bičíkové H antigeny. Každý ze sérovarů tvoří mozaika jednotlivých O a H faktorových antigenů. Faktorové O antigeny se značí římskými číslicemi I až IX a faktorové H antigeny malými písmeny abecedy (a-e). Nejčastěji izolovanými kmeny druhu L. monocytogenes jsou sérovary 1/2a a 4b. Faktory virulence. Genetické studie prokázaly význam několika chromozomálních genů kódujících schopnost invadovat a přežívat v hostitelských buňkách. Byla prokázána schopnost množení virulentních bakterií v cytoplasmě a jejich následného únik z napadené buňky do sousedních. Jako hlavní faktory faktory odpovídající za patogenitu se jeví membranolytické enzymy s hemolytickou aktivitou, různé fosfolipázy C, ale především hemolyzín (listeriolyzin O). Tento je produkovaný kmeny L. monocytogenes a nikoliv nepatogenními druhy. Patogenita. Spektrum vnímavých hostitelských druhů zvířat je velmi široké, jsou to domácí i volně žijící zvířata. Z hospodářských zvířat jsou vnímavé především ovce, skot, prase a kur domácí. Ke vzniku infekce dochází nejčastěji perorální cestou kontaminovaným krmivem ve kterém došlo k pomnožení L. monocytogenes. Následně dochází k infekci 21

22 enterocytů tenkého střeva napadení neaktivovaných makrofágů v nichž se tento fakultativně intracelulární parazit množí. Vstupní branou může být i sliznice spojivky a urogenitálního ústrojí. Onemocnění vzniká v souvislosti se snížením rezistence nebo fyziologickou zátěží, jako je gravidita. Z místa infekce původce proniká po fagocytóze neaktivovanými makrofágy nichž přežívá. Vyznačuje se tropizmem k lymfatickým tkáním, kam proniká lymfatickými a krevními cestami. Po replikaci v těchto orgánech, zejména v játrech a slezině proniká hematogenní cestou do mozku a pohlavních orgánů a placenty v době březosti. V době gravidity dochází k infekci plodu a abortům. L. monocytogenes infikuje také plodové vody. Jejich aspirací může dojít ke generalizovanému onemocnění novorozených zvířat, které se projeví akutním onemocněním a úhynem krátce po porodu. Listeriózní zvířata vylučují původce z těla exkrety a sekrety včetně mléka. Podobně je tomu i v případech bezsymptomatického nosičství L. monocytogenes v trávicím ústrojí ovcí, skotu a prasat, které se objevuje nejčastěji koncem zimy a na jaře. Infekce zvířat. Listerióza ovcí a skotu se nejčastěji klinicky manifestuje aborty a encefalitidami dospělých jedinců a septikémií mláďat. Onemocnění s příznaky postižení CNS probíhá perakutně s častým úhynem. K abortům březích samic dochází ve druhé polovině gravidity. Cerebrální forma listeriózy příležitostně postihuje také prasata, koně a masožravce. Listerióza drůbeže probíhá akutně až perakutně, s vysokou letalitou. Listerióza se v našich chovech vyskytuje sporadicky ve formě enzootie. Listerióza člověka nemá s výjimkou abortů typické klinické projevy, ročně u nás vážně onemocní asi 10 lidí. Imunita. Mechanismus humorální imunity nemá význam v obraně proti infekci, podílí se však na stimulaci buněčné imunitní odpovědi. V časném stadiu infekce jsou baktérie fagocytovány především neutrofily. Volné neaktivované makrogáfy infiltrují až po 48 h. Při šíření lymfatickou nebo krevní cestou jsou listérie likvidovány aktivovanými makrofágy v jednotlivých orgánech. Mediátory uvolňované z T lymfocytů zvyšují infiltraci ložiska monocyty a makrofágy a současně se rozvíjí i buněčná přecitlivělost. V konečném stadiu je L. monocytogenes eliminována z organismu aktivovanými makrofágy. Antibiotika a chemoterapeutika. Baktericidního účinku penicilínu či 22

23 ampicilínu in vivo lze dosáhnout pouze kombinací s aminoglykosidy. Kmeny jsou málo citlivé k účinkům tetracyklinu. Přirozeně rezistentní jsou k účinkům cefalospirů 3. generace. Biologické preparáty. Vakcíny komerčně vyráběné nejsou k dispozici pro nízkou účinnost. Listeria ivanovii Vyskytuje se jako saprofyt a epifyt v trávicím ústrojí ovcí a dalších hospodářských i volně žijících zvířat. Je původcem listeriózy ovcí. Růstové vlastnosti. Kolonie vyrůstající na krevním agaru jsou obklopeny dvěma koncentrickými zónami hemolýzy, z nichž vnitřní je úplná a vnější pouze částečná. Pro kmeny L. ivanovii je charakteristická synergická hemolytická reakce s EQUI-faktorem ve dvojitém CAMP-testu. Všechny kmeny se řadí specificky k sérovaru 5. Mikrob je experimentálně patogenní pro myš. V přirozených podmínkách se izoluje z listeriózních ovcí. Výskyt L. ivanovii v porovnání s druhem L. monocytogenes je ojedinělý. Bakteriologická diagnostika. Listeriózu lze spolehlivě stanovit pouze přímým průkazem původce. Kultivace je spolehlivá zejména při vyšetření sekčního materiálu z případů septikémií a abortů, méně již při cerebrálních formách onemocnění, a proto je nezbytné souběžné histologické vyšetření mozku. Zvýšené účinnosti se dosahuje použitím selektivních postupů izolace s předpomnožením. Získané kmeny se identifikují na základě výsledků dvojitého CAMP-testu, biochemické aktivity. Listeria innocua Je nepatogenním druhem neschopným intracelulární infekce, který se však vyskytuje v podobném prostředí (půda, rostliny, střevo zvířat a člověka) jako L. monocytogenes. Postrádá však ve svém chromozomálním geonomu hlavní geny odpovědné za schopnost intracelulárního parazitizmu typické pro patogenní druhy. 23

24 Rod: Brotchorix Jde o pravidelné tyčinky vyskytující se, jednotlivě, krátkých řetízcích a ve dlouhých vláknech z řetízků. Brotchorix thermosphacta Je jednou z častých příčin kažení masa a masných výrobků dokonce ve vakuovém balení při chladničkové teplotě. Čeleď: ERYSYPELOTHRICHACEAE Rod: Erysipelothrix Definice. Zahrnuje rovné nebo mírně zahnuté tyčinky s tendencí tvorby dlouhých vláken. Barví se grampozitivně, netvoří pouzdra ani endospory. Baktérie jsou fakultativně anaerobní, se slabou fermentační aktivitou. Negativní jsou výsledky katalázového a oxidázového testu. Jsou nepohyblivé, rostou v rozmezí teplot od 5 do 42 C, s optimem C. Erysipelothrix rhusiopathiae Definice. Je saprofytem a epifytem tkání tonzil a střeva zdravých prasat. Vzhledem k výskytu v podestýlce a půdě se řadí k ubikvitárním mikroorganismům. Jako potenciální patogen vyvolává červenku prasat. Morfologie. V růstové S-fázi a v otiskových preparátech z akutních infekcí se mikroorganismus vyskytuje ve formě krátkých, štíhlých tyčinek velikosti 0,2 až 0,4 x 0,8-2,5 μm. Buňky v otiskových preparátech z chronických infekcí a kultur rostoucích v R-fázích mají tvar krátkých tyčinek, uspořádaných v řetězcích, nebo i dlouhých vláken, jejichž délka dosahuje 60 μm. Kultivace. E. rhusiopathiae roste velmi dobře na živných půdách s přídavkem krevního séra nebo glukózy. Po 24 h inkubace vyrůstá na krevním agaru v drobných koloniích velikosti 0,3-1,0 mm v průměru. 24

25 V jejich okolí vzniká pouze zóna částečné alfahemolýzy. K izolaci z kontaminovaného materiálu se používá selektivní pomnožení a selektivní izolace. Biochemické vlastnosti. Významné jsou negativní výsledky proteolytických a oxidoredukčních testů. Antigenní struktura. V buněčné stěně se nacházejí termolabilní druhově specifické a termostabilní typově specifické precipitační antigeny, které se označují arabskými číslicemi. Toxiny a faktory virulence. Toxiny nejsou dosud známy. Za faktory virulence se považují především typové antigeny. Kmeny s největší virulencí se řadí k sérovaru 1, zatímco kmeny sérovaru 2 se izolují z chronických infekcí. Kmeny dalších více než 20 sérovarů nejsou pro prasata etiologicky významné. S virulencí kmenů pravděpodobně souvisí i tvorba hyaluronidázy a neuraminidázy. Patogenita. K infekci je vnímavé především prase domácí, dále ovce, pes, kůň a drůbež. Prase se infikuje perorálně kontaminovaným krmivem, možný je ji endogenní původ. Onemocnění vzniká v souvislosti s oslabením obranyschopnosti hostitele a působením predispozičních faktorů. Akutní infekční fáze se rozvíjí jako bakteriémie s lokalizací původce na endoteliálních buňkách cév, která vede k poruchám srážení krve a k tvorbě trombů. Následuje nekróza postižených cév s vylučováním fibrinu v cévách odumřelých orgánových systémů se současnou kolonizací kloubů. Zde se infekce lokalizuje po překonání akutní bakteriemické fáze. Perzistence původce vyvolává exsudativní, proliferativní a degenerativní změny v kloubech. Infekce zvířat. Červenka prasat probíhá ve třech klinických formách: septikemické, kopřivkovité a chronické. Septikemická forma má akutní průběh a na rozdíl od ostatních končí většinou úhynem. Kopřivkovitá forma se vyznačuje výskytem načervenalých útvarů ve tvaru připomínajících diamant nebo kosočtverec. Chronická forma probíhá jako endokarditida nebo artritida. Pro červenku prasat je charakteristická sezónnost výskytu v červenci a srpnu. Většinou má charakter stacionární nákazy. V současnosti se zjišťuje stále častěji v různých chovech u neočkovaných prasat. Onemocnění hrabavé drůbeže zejména krůt probíhá 25

26 akutně ve formě sepse a vyznačuje se vysokou mortalitou. Imunita. Ve 2. týdnu po přirozené infekci je možno v krevním séru prasat prokázat protilátky proti původci i proti neuraminidáze. Přetrvávání vysokých titrů protilátek souvisí s perzistencí původce v kloubech. Antibiotika a chemoterapeutika. Mikroorganismus je velmi citlivý k účinkům penicilínu, erytromycinu a tetracyklínu. Je rezistentní proti aminoglykosidům s výjimkou gentamicinu. Biologické preparáty. K profylaktickým účelům se používají avirulentní živé vakcíny, připravené z atenuovaných kmenů, nebo inaktivované adsorbátové vakcíny. Bakteriologická diagnostika. Charakteristické příznaky kopřivkovité kožní formy červenky prasat umožňují klinickou diagnózu. V ostatních případech se diagnóza zakládá na přímém průkazu původce mikroskopickým a kultivačním vyšetřením, které je obtížné při chronických formách postihujících klouby. Určení izolovaných kmenů vychází z jejich fyziologických a biochemických vlastností. Možná je i nepřímá diagnostika pomocí specifických protilátek u nevakcinovaných zvířat. 26

27 NEPRAVIDELNĚ NESPORULUJÍCÍ GRAM- POZITIVNÍ TYČINKY Čeleď: CORYNEBACTERIACEAE Rod: Corynebacterium Buňky jsou ve tvaru rovných nebo mírně zahnutých štíhlých tyčinek se zúženými nebo ztluštělými konci, které připomínají kyjovité formy. Jsou obvykle uspořádány do dvojic svírajících tupý úhel nebo do palisád. Barví se grampozitivně. Zbarvení některých buněk není homogenní následkem tvorby metachromatických granulí. Netvoří endospory ani pouzdra a nejsou odolné proti účinku kyselin. Jsou fakultativně anaerobní, některé aerobní. Většina kmenů tvoří kyselinu z glukózy. Jsou kataláza pozitivní a nepohyblivé. Optimální teplota růstu se pohybuje v rozmezí 30 až 37 C. Rod zahrnuje především druhy patogenní pro člověka a zvířata. Corynebacterium pseudotuberculosis Definice. Je saprofytem sliznic gastrointestinálního ústrojí ovcí, koz, skotu a koní. Jako potenciální patogen vyvolává kaseózní lymfadenitidy a pneumonie ovcí a koz a ulcerativní lymfangoitidy koní a skotu. Morfologie. Buňky jsou ve tvaru krátkých nepravidelných tyčinek s průměrnou velikostí 0,5-0,6 x 1,0-3,0 μm. Ve starších kulturách se vyskytují kokovité útvary. Kultivace. Podobně jako jiné korynebaktérie vyžaduje přídavek krve nebo séra v kultivačním médiu. Na krevním agaru vyrůstá po 24 h inkubace v šedožlutých koloniích s matným povrchem, o velikosti 0,5 mm v průměru. Další inkubací se kolonie do 48 h zvětší. V jejich okolí vzniká úzká zóna (většinou neúplné hemolýzy), která se může prosvětlit při expozici v různých teplotách. Pro selektivní izolaci se užívá agar s teluričitanem draselným. 27