Proteiny, peptidy a aminokyseliny

Transkript

1 Základy biochemie KB / B Proteiny, peptidy a aminokyseliny Inovace studia biochemie prostřednictvím elearningu Z / /0407 Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky.

2 Proteiny, peptidy a aminokyseliny: Předmět biochemie. Aminokyseliny a peptidy. Sekvencování peptidů a problematika peptidových syntéz. Přírodní peptidy: hormony, antibiotika, jedy, toxiny. Proteiny. Rozdělení proteinů. Purifikace proteinů. Elektroforéza proteinů. Metody stanovení molekulové hmotnosti proteinů. Strukturní typy proteinů. Určení třírozměrné struktury proteinů. Základy imunologie.

3 Úvod Biochemie popisuje struktury, organizaci a funkci živé hmoty na molekulární úrovni. Dělíme na tři základní oblasti: 1. Strukturní chemie složek živé hmoty a vztah mezi biologickou funkcí a chemickou strukturou. 2. Studium metabolismu sledy chemických reakcí probíhajících v živé hmotě. 3. Molekulární genetika uchovávání a přenos informací.

4 Kořeny biochemie F. Wöhler 1828 syntéza močoviny z anorganických látek Bratři Eduard a ans Buchnerové 1897 bezbuněčný extrakt z kvasinek katalyzuje fermentaci (reakce in vitro.). J. B. Sumner 1926 krystaluje enzym ureasu, protein z luštěniny anavalia ensiformis Současný rozvoj biologie buňky istorický pohled na úlohu deoxyribonukleové kyseliny (DA) v buňce bjev 1869 F. Miescher; 1953 James Watson a Francis rick struktura DA start molekulární biologie.

5 Biochemie jako disciplina a interdisciplinární věda Biochemie vychází z poznatků organické chemie a ostatních chemických oborů. Dále z poznatků medicíny, nauky o výživě, mikrobiologie, fyziologie, buněčné biologie, biofyziky a genetiky. o sama biochemie? Zaměřuje se na strukturu biomolekul a jejich reakce, na enzymy a biologickou katalýzu, na vysvětlení metabolických cest a jejich regulaci a na principy životních procesů, které mohou být vysvětleny chemickými zákony.

6 hemické prvky živé hmoty: První úroveň:,,, Druhá úroveň: a, K, Mg, a, l, S, P Třetí úroveň: o, u, Fe, Mn, Zn Čtvrtá úroveň: Al, As, B, Br, r, F, Ga, I, Mo, Se, Si, V Proč a ne Si??

7 Proteinogenní aminokyseliny

8 Základní struktura αaminokyselin. Proteinogenní aminokyseliny (20) dělíme podle charakteru vedlejšího řetězce R do tří skupin R 3

9 Tab. 1 1 Struktura, zkratky, výskyt v proteinech a pk hodnoty ionizovatelných skupin proteinogenních aminokyselin Aminokyseliny s nepolárním vedlejším řetězcem Strukturní vzorec a molekulová hmotnost Průměrný výskyt v proteinech (%) pk 1 pk 2 α 4 α 3 pk R vedlejší vedlejší řetězec řetězec Glycin Gly G 3 Molekulová hmotnost: 75,07 7,2 2,35 9,78 Alanin Ala A 3 3 Molekulová hmotnost: 89,09 7,8 2,35 9,87 Valin 3 Val V 3 3 Molekulová hmotnost: 117,15 6,6 2,29 9,74

10 Tab. 1 1 Struktura, zkratky, výskyt v proteinech a pk hodnoty ionizovatelných skupin proteinogenních aminokyselin Aminokyseliny s nepolárním vedlejším řetězcem Strukturní vzorec a molekulová hmotnost Průměrný výskyt v proteinech (%) pk 1 pk 2 α 4 α 3 pk R vedlejší vedlejší řetězec řetězec Leucin 3 Leu L 3 Molekulová hmotnost: 131, ,1 2,33 9,74 Isoleucin Ile I Molekulová hmotnost: 131,17 5,3 2,32 9,76 Methionin Met M 2 2 S 3 3 Molekulová hmotnost: 149,21 2,2 2,13 9,28

11 Tab. 1 1 Struktura, zkratky, výskyt v proteinech a pk hodnoty ionizovatelných skupin proteinogenních aminokyselin Aminokyseliny s nepolárním vedlejším řetězcem Strukturní vzorec a molekulová hmotnost Průměrný výskyt v proteinech (%) pk 1 pk 2 α 4 α 3 pk R vedlejší vedlejší řetězec řetězec Prolin Pro P 2 Molekulová hmotnost: 115, ,2 1,95 10,64 Fenylalanin Phe F 3 2 Molekulová hmotnost: 165,19 3,9 2,20 9,31 Tryptofan Trp W 3 2 Molekulová hmotnost: 204,22 1,4 2,46 9,41

12 Tab. 1 1 Struktura, zkratky, výskyt v proteinech a pk hodnoty ionizovatelných skupin proteinogenních aminokyselin Aminokyseliny s polárním vedlejším řetězcem bez náboje Strukturní vzorec a molekulová hmotnost Průměrný výskyt v proteinech (%) pk 1 α 4 pk 2 α 3 pk R vedlejší vedlejší řetězec řetězec Serin Ser S 3 2 Molekulová hmotnost: 105,09 6,8 2,19 9,21 Asparagin Asn Molekulová hmotnost: 132,12 4,3 2,14 8,72 Glutamin Gln Q Molekulová hmotnost: 146,15 4,3 2,17 9,13

13 Tab. 1 1 Struktura, zkratky, výskyt v proteinech a pk hodnoty ionizovatelných skupin proteinogenních aminokyselin Aminokyseliny s polárním vedlejším řetězcem bez náboje Strukturní vzorec a molekulová hmotnost Průměrný výskyt v proteinech (%) pk 1 α 4 pk 2 α 3 pk R vedlejší vedlejší řetězec řetězec Threonin Thr T Molekulová hmotnost: 133,15 5,9 2,09 9,10 Tyrosin Tyr 2 3,2 2,20 9,21 10,46 Y 3 Molekulová hmotnost: 197,23 (fenol) ystein ys 2 S 3 Molekulová hmotnost: 121,16 1,9 1,92 10,70 8,37 (sulfhydryl)

14 Tab. 1 1 Struktura, zkratky, výskyt v proteinech a pk hodnoty ionizovatelných skupin proteinogenních aminokyselin Aminokyseliny s polárním vedlejším řetězcem s nábojem (bazické) Strukturní vzorec a molekulová hmotnost Průměrný výskyt v proteinech (%) pk 1 α 4 pk 2 α 3 pk R vedlejší vedlejší řetězec řetězec Lysin Lys K Molekulová hmotnost: 147,19 5,9 2,16 9,06 10,54 (ε 3 ) Arginin Arg R Molekulová hmotnost: 175, ,1 1,82 8,99 12,48 (guanidium) istidin is 2 3 Molekulová hmotnost: 155,10 2,3 1,80 9,33 6,04 (imidazol)

15 Tab. 1 1 Struktura, zkratky, výskyt v proteinech a pk hodnoty ionizovatelných skupin proteinogenních aminokyselin Aminokyseliny s polárním vedlejším řetězcem s nábojem (kyselé) Strukturní vzorec a molekulová hmotnost Průměrný výskyt v proteinech (%) pk 1 α 4 pk 2 α 3 pk R vedlejší vedlejší řetězec řetězec Asparagová kyselina Asp D 2 3 Molekulová hmotnost: 133,10 5,3 1,99 9,90 3,90 (β ) Glutamová kyselina Glu E Molekulová hmotnost: 147,13 6,3 2,10 9,47 4,07 (γ )

16 Tvorba disulfidových vazeb oxidací S skupin vedlejších řetězců ys. 2 S S 2 ystein ystein 1/ S S 2 ystin

17 Třírozměrná struktura aminokyseliny s chirálním αuhlíkem. L a D izomer. Předmět a jeho obraz v zrcadle. Proteinogenní aminokyseliny mají konfiguraci L. R R α α 3 3 Lizomer Dizomer

18 ahningoldprelogův model absolutní konfigurace. Substituenty na αuhlíku se řadí podle klesající priority. Směr šipky proti směru hodinových ručiček značí S konfiguraci (sinister = doleva) R (3) (4) (1) α (2) 3

19 Skupiny dle klesající priority pro ahningoldprelogův model: S, R,, 3, 2, R,, 2, 6 5, 3, 3, 2,

20 Absolutní konfigurace LAsp a Lys: 3 2 LAspartát (S )Aspartát S Lystein S 2 2 (R )ystein

21 Absolutní konfigurace proteinogenních Laminokyselin: Gly (G) není chirální ys () je v absolutní konfiguraci R Ile (I) a Thr (T) mají dvě chirální centra. LIle (2S,3S)., existuji dva enantiomery diastereoizomerní k alloisoleucinu (2R,3S) LThr (2S,3R), existují dva enenatiomery, které jsou diastereoizomerní k allothreoninu (2R,3R). Všechny ostatní Laminokyseliny jsou S!!

22 ptická otáčivost aminokyselin Dalším důsledkem chirality aminokyselin je vlastnost jejich roztoků otáčet rovinu polarizovaného světla (kmitá v jedné rovině). točení ve směru hodinových ručiček: Značíme (d nebo ), proti směru hodinových ručiček: Značíme (l nebo ) ezaměňovat l a L, d a D!!! ěkteré Laminokyseliny otáčí doprava (např. LLeu)!! Měří se polarimetrem. Úhel otočenízávisína: délce optické dráhy (1 dm), vlnové délce polarizovaného světla (žlutá D čára sodíku 589,3 nm), koncentraci roztoku a teplotě.

23 Ionizační stavy aminokyselin jako funkce p: R R R Koncentrace bojetná forma bě skupiny protonizovány bě skupiny deprotonizovány p

24 Určení pk 1, pk 2 a pi alaninu. pi = pk 1 pk 2 / 2 (izoelektrický bod, pi = 6, 11 ) pk 2 8 p 6 pi 4 pk ,5 1,0 1,5 2,0 Disociované ionty/ molekula

25 Aromatické aminokyseliny absorbují světlo v UV oblasti: Fenylalanin (Phe, F) Tyrosin (Tyr, Y) Tryptofan (Trp, W)

26 Absorpční spektra a molární absorpční koeficienty Trp, Phe a Tyr: Trp ε Tyr Phe λ (nm)

27 Posttranslačně modifikované aminokyseliny: P Fosfoserin γ β 2 α γkarboxyglutamát ydroxyprolin ε 2 2 δ γ 2 2 3Methylhistidin β 2 α εacetyllysin

28 ěkteré fyziologicky významné sloučeniny odvozené od aminokyselin: α 2 β 2 3 γ 2 γaminomáselná kyselina 3 istamin Dopamin 2 2 (GABA) I I 2 I I Thyroxin 3

29 Peptidy 3 R 1 3 R 2 3 R 1 R 2 2 Peptidová vazba

30 Peptidová vazba mezi karboxylem jedné aminokyseliny α aminoskupinou další aminokyseliny. Peptidy do M r = 5500, resp. 5, 5 kd, výše proteiny. V biochemii se obvykle M r udává v jednotkách označených jako dalton = hmotnosti vodíku, zkratka d po Johnu Daltonovi ( ) Proteiny až daltonů, nebo 5, 5 kd až 220 kd.

31 Pentapeptid TyrGlyGlyPheLeu s označením konce Tyr a konce Leu: Tyr Gly Gly Phe Leu Aminoskupina konec Karboxyl konec

32 ázvosloví peptidů Dvě aminokyselinydipeptid, tři tripeptid. 1. Acylační od konce AGK = alanylglycyllysin 2. Triviální např. insulin, glukagon V peptidech mohou být i neproteinogenní aminokyseliny a konfiguračně D. Peptidy mohou být lineární nebo cyklické (cyklopeptidy).

33 Leu enkefalin opioidní peptid Sekvence pentapeptidu od konce: TyrGlyGlyPheLeu YGGFL Pentapeptid reverzní: LFGGY je neaktivní jako opioidní peptid vnímání bolesti.

34 Glutathion je tripeptid účastnící se oxidačně redukčních reakcí v metabolismu. Redukovaný glutathion odstraňuje kyslíkaté radikály (RS) S Glutathion (GS) (γglutamylcysteinylglycin) 2 1/ S S Glutathiondisulfid (GSSG)

35 Peptidový řetězec s vyznačením umístění vedlejších řetězců aminokyselin R 1 R 2 R 3 R 4 R 5

36 Délky vazeb peptidové vazby: Vazba (13, 2 nm) je delší než dvojná (12, 7 nm) a kratší než jednoduchá (14, 9 nm). Peptidová vazba nemá náboj. R α 1.51 A 1.32 A 1.00 A 1.45 A α 1.24 A R

37 Rezonanční struktury peptidové vazby, které jsou příčnou její planarity. Rezonanční struktury pepetidové vazby

38 Peptidové vazby leží v rovině. Vedlejší řetězce R (zelené) směřují nad nebo pod roviny peptidových vazeb. R α α R

39 Stereochemie peptidové vazby. Forma trans vysoce převažuje nad cis. Forma cis je stericky nevýhodná. Trans is

40 Prolin v peptidové vazbě může existovat v obou formách cis i trans. bě jsou prostorově shodně nevýhodné. Trans is

41 Rotační (torzní) úhly kolem vazeb v polypeptidu: φ (fí) je torzní úhel kolem vazby mez dusíkem a αuhlíkem, ψ (psí) je torzní úhel mezi αuhlíkem a uhlíkem karbonylu R R R φ ψ

42 Jak se měří torzní úhly? Pohled od dusíku k αuhlíku (φ), pohled od karbonylového uhlíku k αuhlíku (ψ) φ ψ φ = 80 ψ = 85

43 Ramachandranův diagramznázorňující hodnoty torzních úhlů (φ) a(ψ). Tmavě zelená pole jsou přípustné konformace. Struktura vpravo dole je nereálná ze sterických důvodů ψ φ (φ = 90,ψ = 90 ) ereálná

44 Stanovení primární struktury sekvence peptidů (sekvencování) Primární strukturou peptidů rozumíme pořadí aminokyselin v peptidovém řetězci. Čteme od konce. Taktika sekvencování (lineární peptidy): A) ddělení řetězců např. odstranění disulfidových vazeb. B) Štěpení peptidů chemickými a enzymovými metodami na kratší řetězce a jejich rozdělení. ) Vlastní sekvencování. D) Rekonstrukce peptidu z přesahujících fragmentů.

45 Taktika sekvenace peptidů Protein (dva různé polypeptidové řetězce spojené disulfidovými vazbami) S S Redukce disulfidové vazby a následné oddělení řetězců hemickými a enzymovými metodami se štěpí každý polypeptid na kratší peptidy Jinými chemickými a enzymovými metodami se štěpí každý polypeptid na jiné kratší peptidy Určí se sekvence každého peptidového fragmentu Určí se sekvence každého peptidového fragmentu TDI FYK SGE YFR Y KTDI F Y GVAGR GVAGRF RSGE K rekonstrukci každého polypeptidu se použijí soubory překrývajících se peptidových sekvencí GVAGRFYKTDI YFRSGE pakuje se fragmentace při zachování disulfidových vazeb za účelem identifikace ys sekvencí disulfidové vazby GVAGRFYKTDI S S YFRSGE

46 Redukce disulfidové vazby mezi polypeptidovými řetězci nebo uvnitř řetězce 2merkaptoethanolem 2 S S 2 2 S S S 2 S S ystin 2Merkaptoethanol ystein

47 Reakcí jodacetátu s volnou S skupinou na polypetidovém řetězci se zabráníjejíreoxidaci ys 2 S I 2 ys 2 S 2 I ystein Jodacetamid SKarboxymethylcystein (Mys)

48 Pro stanovení přesné pozice disulfidové vazby se používá diagonální elektroforéza při které se oxiduje disulfidová vazba permravenčí kyselinou 2 S S 2 ystin 2 Permravenčí kyselina S 3 S 3 2 ysteová kyselina

49 Diagonální elektroforéza (ELF). Po oxidaci peptidů se v druhém směru elektroforézy původní peptidy zastaví na diagonále, kdežto peptidy obsahující disulfidové vazby (jsou kyselejší) se objeví mimo diagonálu. ELF po působení permravenčí kyseliny R 2 S 3 R 2 S 3 Směr první ELF

50 Enzymové štěpení polypeptidů endopeptidasami: Endopeptidasy, proteinasy jsou hydrolytické enzymy štěpící specificky určité peptidové vazby. Trypsin štěpí na místě karboxylu Arg a Lys. hymotrypsin štěpí na místě karboxylu hydrofobních aminokyselin Phe, Tyr a Trp. Elastasa štěpí na místě karboxylu malých neutrálních aminokyselin Ala, Gly, Ser a Val. Ve všech případech se vazba neštěpí, pokud je následující aminokyselinou Pro. Všechny předchozí enzymy jsou z hovězího pankreatu. Endopeptisa V8 ze S. aureus je specifická na Glu. Štěpením polypeptidu různými enzymy získáme řadu peptidových fragmentů

51 Enzymové štěpení polypeptidového řetězce trypsinem na místě karboxylu Arg nebo Lys Lysin nebo Arginin R R Trypsin 3 Kterákoliv aminokyselina kromě Prolinu

52 Vznik různých fragmentů z polypeptidu enzymovým a chemickým štěpením peptidových vazeb. V tomto příkladu se získalo šest překrývajících se fragmentů Fragmenty Br Br Br Phe Trp Met Gly Ala Lys Leu Pro Met Asp Gly Arg ys Ala Gln Trypsin Trypsin Trypsinové fragmenty

53 Příklad chemického štěpení peptidové vazby. Bromkyan štěpí specificky na místě karboxylu Met 3 3 S Br Bromkyan S Br R R 3 S Peptidyl homoserinlakton R 2 R

54 Metody sekvenace peptidů. Původní Sangerova metoda založená na sekvenaci polypeptidu (insulin) od konce 2,4dinitrofluorbenzenem. evýhodou bylo, že se při stanovení jedné aminokyseliny se hydrolyzoval celý peptid R 1 R 1 F 2 F 2,4Dinitrofluorobenzen (DFB) DP Polypeptid

55 Při použití dansyl chloridu (fluorescence) došlo k výraznému zvýšení citlivosti Sangerovy metody. Stanovuje se 1 nm.l 1 aminokyseliny. ( 3 ) 2 R 1 2 R 2 R 3 S l 5Dimethylamino1naftalensulfonylchlorid (Dansylchlorid) ( 3 ) 2 l Polypeptid 2 S R 1 R 2 R 3 ( 3 ) 2 Dansylpolypeptid 2 2 S R 1 Dansylaminokyselina (fluorecentní) R 2 R Volné aminokyseliny

56 Edmanova metoda sekvenace peptidu od konce: R 1 S 2 R 2 R 3 Fenylisothiokyanát (PIT) Polypeptid R 1 R 2 R 3 Polypeptid je navázán koncem na polymerní nosič. Postupně se oddělují fenylthiohydantoinové (PT) deriváty aminokyselin. Činidlem je fenylisothiokyanát (PIT). R 1 S Bezvodá F 3 S PT Polypeptid R 2 3 R 3 Původní polypeptid bez koncové aminokyseliny Derivát thialozinu R 1 S PTaminokyselina

57 Sestavení původního polypeptidu z fragmentů získaných enzymovou hydrolýzou: Původní polypeptid Trypsinové peptidy Trypsin Enzymová hydrolýza hymotrypsin hymotrypsinové peptidy Trp Gly Gly is Met Arg Leu Val Phe Ser Phe Thr Lys Asp Lys Glu Tyr ys Pro Ala Trp Lys Lys is Met Arg Trp Glu Tyr Gly Ile Arg Gly Ile Arg Ser Phe Leu Val Phe Asp Lys Thr Lys ys Pro Ala Trp Gly Ile Arg Ser Phe Trp Gly Leu Val Phe Glu Tyr Gly Ile Arg Thr Lys ys Pro Ala Trp is Met Arg Asp Lys Glu Tyr ys Pro Ala Trp Lys Gly Leu Val Phe Asp Lys Ser Phe Thr Lys Lys is Met Arg Trp LeuValPheAspLysGluTyrGlyIleArgSerPheThrLysysProAlaTrpLysisMetArgTrpGly

58 Proč sekvencujeme peptidy a proteiny? 1. Sekvence se porovnává se známými sekvencemi. Z analogie je možné usoudit např. na katalytický mechanismus enzymu nebo příslušnost nově získaného peptidu do určité rodiny peptidů. 2. Srovnávají se sekvence stejného polypeptidu z různých zdrojů a sleduje se evoluční mapa. 3. Sekvenční data se využívají jako podklad k syntéze protilátek a peptidů nebo proteinů s významným účinkem. 4. Aminokyselinová sekvence je podstatná pro tvorbu DA sond specifických pro geny kódující odpovídající proteiny. 5. Mnohé proteiny obsahují signální aminokyselinové sekvence sloužící k ke kontrole určitého procesu. Sekvence mohou např. obsahovat signál pro umístění proteinu v membráně.

59 Využití technologie rekombinantní DA k sekvenaci velkých proteinů. Řetězce DA jsou klonovány a poté sekvencovány. Sekvence nukleotidů udávají sekvenci aminokyselin v proteinu. evýhodou je, že nepostihuje posttranslační úpravy polypeptidů. Sekvence DA GGG TT TTG GGA GA GA GGA AG AT ATG GG GA Sekvence aminokyselin Gly Phe Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly Ala

60 Proč syntetizovat peptidy? 1. Syntetické peptidy slouží jako antigeny stimulující tvorbu specifických protilátek. 2. Syntetické peptidy mohou být využity k izolaci receptorů hormonů a jiných signálních molekul. Také jako afinanty při afinitní chromatografii. 3. Syntetické peptidy mohou být využity jako léky. apř. analog vasopresinu, hormonu stimulujícícm reabsorpci vody, 1desamino8Dargininvasopresin se odbourává pomaleji a slouží jako náhrada vasopresinu. 4. Peptidy mohou sloužit jako pomocná strukturu při studiu složitějších proteinů (třírozměrná struktura).

61 1. Aktivace karboxylu Taktika peptidových syntéz: 2. hránění skupin, které nevstupují do peptidové vazby Syntézy peptidů jsou zautomatizovány. První chráněná skupina se naváže koncem na makromolekulární pryskyřici a postupně se přidávají na konec dalšíchráněné aminokyseliny. Reakcí karboxylu a aminoskupiny s, dicyklohexylkarbodiimidem (D) za odštěpení vody a uvolnění, dicyklohexylmočoviny, se tvoří peptidová vazba. Skupiny, které nemají vstoupit do peptidové vazby se chrání činidly jako např. t butyloxykarbonyl, t Boc nebo benzyloxakarbonyl (dříve karbobenzoxy nebo karbobenzyloxy) symbol Z nebo bz. bě skupiny se po skončení syntézy lehce odštěpují.

62 Porovnání struktur přírodního a syntetického vasopresinu: 2 2 S S 3 Tyr Phe Glu Asp Pro 2 2 ys 1 ys Arg 8 Gly 9 8Argininvasopresin (antidiuretický hormon, AD) 2 2 S S Tyr Phe Glu Asp Pro 2 2 1Desamino8Dargininvasopresin (syntetický AD)

63 hránící a aktivační sloučeniny pro syntézu peptidů 3 3 R 3 tbutyloxykarbonylaminokyselina (tboc aminokyselina) Dicyklohexylkarbodiimid (D)

64 Vstup chráněné aminokyseliny (tboc) do peptidové vazby za účasti D tboc aminokyselina n1 D tboc R Aktivovaná aminokyselina R n 2 Polymer tboc R Dipeptid vázaný na polymer Aminokyselina n vázaná na polymer R n Dicyklohexylmočovina Polymer

65 elkový postup syntézy peptidu na polymerním nosiči. Syntéza peptidů v pevné fázi Merrifieldova metoda (SPPS). R n Polymer tboc l hráněná aminoskupina n Reaktivní polymer 1 Ukotvení Polymer R n tboc

66 Polymer R n tboc 2 dstranění chránící skupiny pomocí F 3 Polymer R n 2

67 Polymer R n 2 3 Tvorba peptidové vazby s chráněnou aminokyselinou n1 D Polymer tboc R n1 R n

68 Polymer tboc R n1 R n Další odstranění chránících skupin a syntetické cykly 4 dštěpení peptidu pomocí F Polymer 2 R 1 R n1 R n

69 Přírodní peptidy Zvláštnosti struktury přírodních peptidů: obsahují i neproteinogenní aminokyseliny obsahují i Daminokyseliny isopetidové vazby (např. γkarboxyl Glu) cyklické struktury (laktamy, disulfidové vazby) větvené struktury blokování koncových aminokyselin (pyroglutamát, glycinamid) Skupiny přírodních peptidů di a tripeptidy (glutathion, sladidlo aspartam ) peptidové hormony (oxytocin, vasopresin, přechod k proteohormonům, insulin) neuromodulátory (endorfiny, 15 až 32 aminokyselin, enkefaliny, pentapeptidy) peptidové zoo a fytotoxiny ( hadi, štíři, včely apamin; falloidiny a amanitiny Amanitia phalloides ) protaminy krátké lineární peptidy, mlíčí ryb polyaminokyseliny (buněčné stěny baktérií, poly γlglu a polyγdglu)

70 3 Tyr Tyr ys S S Tyr ys Pro Gly Gly 3 xytocin Gly Gly 2 2 Ile Gln 2 S Glutathion (GS) (redukovaný) γglu ys Gly γglu S S ys Gly Glutathion (GSSG) (oxidovaný) 3 Asn Leu Gly 2 Phe Leucinenkefalin Phe Methioninenkefalin Leu Met 3 ys S S Pro Tyr ys 2 Phe Gln Asn Arg Gly 2 Vasopresin 2 3 Methylester LaspartylLfenylalaninu (Aspartám) terminální konec Gly Ile Val Phe Val Asn Glu Gln 5 Gln 5 is ys Leu ys S S ys S S Ala Ser Gly Ser 10 Val ys Ser 10 is Leu Val Leu Tyr 15 Gln Leu Glu Ala 15 Leu Tyr Glu Asn Leu Val Tyr S ys 20 ys S Asn Řetězec A 20 Gly Glu Arg Gly Phe 25 Phe Tyr Thr Pro Lys 30 Ala Řetězec B Insulin

71 PRTEIY BÍLKVIY Proteiny z řeckého proteos (prvotní, nejpodstatnější), bílkoviny z německého eiweisse vaječný bílek. Proteiny jsou univerzální makromolekuly živých systémů mající klíčové funkce v téměř všech biologických procesech. Klíčové vlastnosti proteinů: Proteiny jsou lineární polymery sestavené z monomerních jednotek aminokyselin. Proteiny obsahují řadu funkčních skupin. Proteiny mohou reagovat spolu vzájemně nebo s jinými biologickými makromolekulami za tvorby vyšších komplexních celků. ěkteré proteiny jsou silně rigidní, zatímco jiné vykazují omezenou flexibilitu.

72 Klasifikace a rozdělení proteinů Klasifikace proteinů podle funkce (specifické a obecné), chemického složení a tvaru. becné funkce proteinů: Zdroj energie a dusíku, účinné ústoje (krev, cytosol), významný příspěvek k udržení osmotického tlaku vně i uvnitř buněk. Specifické funkce proteinů (zvláštní tabulka). hemické složení: A) Jednoduché pouze polypeptidový řetězec B) Složené (polypeptidová část neproteinová část) Metaloproteiny obsahující kovový iont. Fosfoproteiny obsahující fosfáty. Glykoproteiny obsahující sacharidovou složku Lipoproteiny obsahující lipidovou složku ukleoproteiny obsahující nukleové kyseliny

73 Specifické funkce proteinů Typ proteinu Příklad Výskyt a funkce Katalytické (enzymy) Trypsin ydrolýza peptidové vazby Regulační (hormony) Insulin Stimulace metab. glukosy chranné Protilátky Vazba na cizorodé látky Skladovací Kasein Mléčný protein Transportní emoglobin Transport 2 krví Strukturní Kolagen Vláknité pojivové tkáně Kontraktilní Myosin, aktin Svalová vlákna Genetické funkční istony Asociace s DA (chromosomy) Toxické Ricin Toxický protein z Ricinus communis (skočec obecný)

74 Pokračování rozdělení proteinů Rozdělení proteinů podle tvaru molekul: Globulární tvar koule, obvykle ve vodě rozpustné Fibrilární ve tvaru vláken, ve vodě nerozpustné Membránové součást biologických membrán Další možnosti dělení proteinů podle lokalizace nebo dějů, ve kterých působí: Krevníproteiny Membránové receptory Elektrontransportní systémy (vnitřní membrána mitochondrií)

75 Purifikace proteinů Pro všechny studie proteinů musí být k dispozici čistý protein. Proto, abychom ho získali, musíme mít zdroj, kde je proteinu dostatečné množství a metodu pro jeho sledování během purifikace (čištění). Metody sledování purifikovaného proteinu jsou různé. Uvádím metodu, kdy má protein katalytickou funkci (enzym) a jeho koenzymem je nikotinamidadenindinukleotid (AD ), který po redukci na AD přechází na produkt identifikovatelný ve spektru UV vlnové délky 340nm. Dle rostoucí hodnoty aborbance posuzujeme aktivitu enzymu. Dalším důležitým údajem je obsah proteinů, který se během purifikace mění. Rozhodující pro úspěšný průběh purifikace je rostoucí hodnota specifické aktivity ( aktivita enzymu / obsah proteinů). Abychom získali proteiny z buněk v roztoku musíme biologický materiál homogenizovat rozdrtit buněčné membrány. Po homogenizaci obvykle následuje oddělení různých frakcí diferenciální centrifugací. Získáme sediment (u dna) a nad sedimentem supernatant.

76 Diferenční centrifugace po homogenizaci. Zvyšující se centrifugační síla (násobky g) umožňuje oddělení těžšího materiálu od lehčího, případně se oddělí pevné částice od rozpuštěných v roztoku. entrifugace při 500 x g po dobu 10 min Supernatant x g 20 min Sediment: jaderná frakce x g 60 min Sediment: mitochondrie ytosolární rozpustné proteiny Sediment: mikrosomy

77 Další metody purifikace proteinů Vysolování a dialýza. Mnohé proteiny jsou méně rozpustné v roztocích s vyšší koncentraci solí. Vysolování lze provádět frakčně např. síranem amonným různé koncentrace. Dialýza je proces při kterém se oddělují velké molekuly proteinů od malých molekul (např. solí) přes semipermeabilní membránu. Gelová chromatografie. Metoda slouží k oddělování velkých molekul od malých. Používají se kolony obsahující porézní kuličky o rozměrech 100 μm (0, 1 mm). bvykle nerozpustné, ale vysoce hydratované polysacharidy dextran, agarosa nebo polyakrylamid. apř. Sephadex, Sepharosa nebo Biogel. Malé molekuly vnikají do hydratovaných gelů a tím se zpožďují, kdežto velké molekuly prochází rychleji (nezpožďují se). Pořadí eluce molekul z gelu je : první velké, poté střední a nakonec malé molekuly. Používá se také k odsolování. hromatografie na iontoměničích. Proteiny se oddělují na základě náboje na jejich povrchu. Když má protein na povrchu kladný náboj při p 7, váže se na kolonu polymeru obsahujícího karboxylátové skupiny, zatímco protein s negativním nábojem se neváže. avázaný protein s kladným nábojem se uvolní přidáním chloridu sodného do ústoje, protože sodný iont kompetuje s kladným nábojem proteinu. Proteiny s kladným nábojem se váží na negativní náboj kolony (např. karboxymethylcelulosa). aopak proteiny se záporným nábojem se váží na pozitivní náboj např. diethylaminoethylcelulosu DEAE.

78 Dialýza Dializační sáček Koncentrovaný roztok Pufr (ústroj) Zahájení dialýzy V rovnováze

79 Gelová chromatografie na Sephadexu (polysacharid) Polymerní nosič (polysacharid) Směs proteinů Gel Malé molekuly vstupují do pórů polymerního nosiče Velké molekuly nevstupují do pórů polymerního nosiče Směr toku

80 hromatografie na iontoměničích katex karboxymethylcelulosa Karboxymethylová (M) skupina (ionizovaná forma) elulosa nebo agarosa elulosa nebo agarosa Diethylaminoethylová (DEAE) skupina (protonovaná forma)

81 Afinitní chromatografie Afinitní chromatografie spočívá ve vazbě proteinů na specifické chemické skupiny (afinanty). apř. enzym se může vázat na afinitní kolonu s navázaným kompetitivním inhibitorem. Směs proteinů se nanese na kolonu. ledaný enzym se naváže pevně na inhibitor. Všechny ostatní proteiny se vymyjí. Enzym se uvolní přidáním substrátu. Ze směsi proteinů se specificky zachytí pouze jeden druh. statní molekuly se nezachytí.

82 věření úspěšnosti purifikace. Elektroforéza. Gelová elektroforéza. Molekuly nesoucí náboj putují stejnosměrným elektrickým polem. Proces se nazývá elektroforéza. V biochemie můžeme takto dělit proteiny i nukleové kyseliny. Rychlost pohybu molekul v elektrickém poli závisí na síle el. pole (E), celkovém náboji molekuly (z) a frikčním koeficientu (f): v = E.z / f Proti elektrické síle E.z nesoucí molekulu s nábojem proti elektrodě s opačným nábojem působí viskozita jako projev interakce mezi putující molekulou a prostředím. Frikční koeficient f závisí na hmotnosti a tvaru molekuly a viskozitě prostředí (η ). Pro molekulu ve tvaru koule o poloměru r, platí: f = 6 π. η. r Elektroforéza se provádí na nosiči o konzistenci gelu nebo na papíře. Gel slouží současně jako molekulové síto.

83 Polyakrylamidová gelová elektroforéza (PAGE). Zesíťování akrylamidu (toxický). Akrylamid 2 2, Methylenbisakrylamid S Persíran 2 S 4 Síranový radikál (iniciátor polymerace)

84 Provedení PAGE. Vertikální (shora dolů), molekuly se pohybují směrem k anodě (). Velké molekuly se zpožďují, malé putují v čele. Směs makromolekul (proteinů) Směr elektroforézy Elektroforeza Porézní gel

85 Modifikace PAGE s SDS Modifikací je elektroforéza za podmínek denaturace SDSPAGE. Denaturačním činidlem je obvykle dodecylsíran sodný (SDS) aniontový detergent. SDS štěpí téměř všechny nekovalentní vazby v proteinech. Aniont SDS se váže na hlavní řetězec polypeptidu (jedna molekula SDS na dvě aminokyseliny). Komplex denaturovaného proteinu s SDS získá záporný náboj, který je úměrný molekulové hmotnosti proteinu. Kromě SDS se přidává merkaptoethanol nebo dithiothreitol k redukci disulfidových vazeb. Po proběhnutí elektroforézy se proteinové pásy vizualizují. ejčastěji se používá trifenylmethanové barvivo oomasie blue nebo barvení stříbrem. Pohyblivost většiny polypeptidů je za těchto podmínek je přímo úměrná logaritmu jejich molekulové hmotnosti. 3 S a Dodecylsíran sodný

86 Kvantifikace purifikačního protokolu fiktivní protein Stupeň elkové elková Specifická Výtěžek Stupeň proteiny aktivita aktivita purifikace (mg) (jednotky) (jednotky/mg) (%) omogenizace Vysolování hromatografie na iontoměniči Gelová filtrace Afinitní chrom

87 Idealizovaná PAGE purifikace fiktivního proteinu omogenát Frakční vysolování Iontoměničová chromatografie Molekulové síto (gelová filtrace) Afinitní chromatografie

88 Stanovení relativní molekulové hmotnosti proteinů 1. Pomocí SDSPAGE elektroforézy (objasněno) 2. Ultracentrifugace 3. motnostní spektrometrie

89 Ultracentrifugace entrifugace se používá k oddělení hrubých směsí buněčných komponent. Při kvantifikaci rychlosti pohybu molekul v roztoku v centrifugačním poli používáme sedimentační koeficient (s) dle rovnice: s = m(1 νρ)/f kde m je hmotnost částice, ν je parciální specifický objem (reciproká hodnota hustoty částice), ρ je hustota média, f frikční koeficient (závisí na tvaru molekuly) (1 νρ) vyjadřuje schopnost prostředí nadnášet částice Sedimentační koeficient se obvykle vyjadřuje v jednotkách: Svedberg (S); S = s. Čím je hodnota S nižší, tím pomaleji částice sedimentuje. a tomto principu je založena gradientová nebo jinak zonální centrifugace vedoucí k oddělení částic na základě hodnoty jejich sedimentačních koeficientů.

90 Ultracentrifugace 2 Relativní molekulová hmotnost proteinů může být stanovena přímo z tzv. sedimentační rovnováhy při které se částice centrifugují nízkou rychlostí, tak, že sedimentace je v rovnováze s difůzí. Metoda je poměrně přesná a na rozdíl od SDSPAGE nedenaturační při zachování kvartérní struktury. odnoty S (Svedberg = s) a molekulové hmotnosti některých proteinů Protein odnota S Molekulová hmotnost ytochrom c 1, Myoglobin 1, Trypsin 2, Malátdehydrogenasa 5, Laktátdehydrogenasa 7,

91 MALDITF MS (Matrix Assisted Laser Desorption/IonizationTimeof FlightMass Spectrometry) Princip metody: Proteinový vzorek je smíchán s matricí tvorba krystalů Krystaly vystaveny laserovému paprsku vznik jednou nabitých iontů proteinu Ionty analyzovány v analyzátoru doby letu (t (m/z) 1/2 ) MATRIE PR MALDI organické látky zajišťující ionizaci látek akyano4hydroxyskoøicová kyselina 2,5dihydroxybenzoová kyselina

92 MALDITF MS (Matrix Assisted Laser Desorption/IonizationTimeof FlightMass Spectrometry) Intens. [a.u.] ovězí sérový albumin 4000 Mr= m/z

93 Strukturní typy proteinů 1. Primární struktura = sekvence aminokyselin (shodné s peptidy). 2. Periodické sekundární struktury: αhelix a beta skládaný list, otočky a smyčky. 3. Terciární struktura. 4. Kvartérní struktura. Ad 2. Pauling Linus a orey Robert postulovali v roce 1951 dvě periodické struktury αhelix a beta skládaný list. Později byly objeveny další, sice neperiodické, ale všeobecně se vyskytující beta otočka a omega smyčka.

94 Periodické sekundární struktury. harakteristika αhelikální struktury elikální struktura šroubovice udržovaná vodíkovými vazbami. Jeden závit tvoří 3, 6 aminokyselinových zbytků a obsahuje 13 atomů, počínaje kyslíkem po vodík vodíkové vazby. Proto označení: 3, 6 13 helix. Každý aminokyselinový zbytek reprezentuje 0, 15 nm. elková délka závitu je 0, 15 x 3, 6 = 0, 54 nm. Vedlejší skupiny aminokyselin (R) směřují ven ze šroubovice. Každý peptidový karbonyl je vázán vodíkovou vazbou na vzdálenou skupinu řetězce (i 4). Všechny vodíkové vazby jsou paralelní s osou šroubovice. αhelix takto definovaná má: φ = 60 ψ v rozmezí 45 až 50 Peptidová vazba je vzhledem k polarizaci skupin a dipól. Dipólem je také celý peptid s pozitivním nábojem na konci a negativním na konci. Při pohledu shora na šroubovici je směr vinutí shodný se směrem chodu hodinových ručiček αhelix pravotočivá.

95 Schematické znázornění αhelixu

96 Vodíkové vazby v αhelixu. Skupina nté aminokyseliny tvoří vodíkovou vazbu s skupinou aminokyseliny n 4. R i R i1 R i2 R i4 R i3 R i5

97 A)Stužkové znázornění s αuhlíky a vedlejšími skupinami aminokyselin. B) Boční kuličkový model znázorňuje vodíkové vazby. ) Pohled shora. D) Kalotový model.

98 Znázornění αhelikální struktury. Konkrétní protein je tvořen svazkem αhelixů.

99 harakteristika βskládaného listu Struktura dostala název podle pořadí ve kterém byla popsána. Stericky jsou obě formy beta listu daleko volnější. Vzdálenost mezi sousedními aminokyselinami je 3, 5 Å, zatímco u helixu jen 1, 5Å. Vedlejší řetězce sousedních aminokyselin směřují na opačné strany. Beta list je tvořen spojením dvou nebo více beta řetězců vodíkovými vazbami. Sousední řetězce mohou jít proti sobě antiparalelní, nebo souběžně paralelní. V případě antiparalelního beta listu jsou a skupiny každé aminokyseliny spojeny vodíkovou vazbou s a skupinami partnerského řetězce. V paralelní struktuře je skupina každé aminokyseliny vázána na skupinu aminokyseliny sousedního řetězce, zatímco skupina je vázána vodíkovou vazbou s skupinou aminokyseliny o dvě aminokyseliny dále.

100 Struktura beta listu. Vedlejší skupiny (zelené) sousedních aminokyselin směřují na opačnou stranu.

101 Antiparalelní beta list

102 Paralelní beta list

103 Schematický model beta listu (stužkový)

104 Proteiny obsahují zpětné kličky (beta kličky nebo vlásenkové ohyby). bvykle je skupina ité aminokyseliny vázána vodíkovou vazbou s aminokyselinou i 3. azývají se také omega smyčka.

105 Terciární struktura Třírozměrná struktura, obvykle funkčního proteinu. Složena z domén αhelikální, beta listu a smyček. apř. myoglobin obsahuje neproteinovou složku hem (prosthetická skupina). Více než 70 % hlavního řetězce myoglobinu je složeno z 8 α helixů a zbytek tvoří smyčky mezi helixy.

106 Kvarterní struktura Kvarterní struktura vzniká sdružením polypeptidových řetězců (obvykle kvarterních struktur) do multipodjednotkové struktury. Mohou tak vznikat dimery, tetramery atd. Podjednotky mohou být shodné homomery nebo různé heteromery. Příkladem je hemoglobin, který má kvarterní strukturu složenou ze čtyř podjednotek. Dvou α a dvou β. emoglobin existuje jako a 2 b 2 teramer. Tvorba kvarterní struktury hemoglobinu má význam a funkci při přenosu kyslíku z plic do tkání. Později porovnáme rozdíl mezi přenosovou schopností svalového myoglobinu a krevního hemoglobinu.

107 Tetramer α 2 β 2 lidského hemoglobinu. Dvě identické podjednotky α (červeně) a dvě identické podjednotky β (žlutě). Molekula obsahu čtyři skupiny hemu.

108 Principy určení třírozměrné struktury proteinů pomocí MR spektroskopie a rentgenové krystalografie. ukleární magnetická resonanční spektroskopie určuje strukturu proteinů v roztoku. utné jsou koncentrované roztoky proteinů (např. 1 mm, nebo 15 mg.ml 1 pro 15 kd protein). Princip: Technika je založena na skutečnosti, že jádra určitých atomů vykazují magnetické vlastnosti, spin. bvykle se měří protonová spektra nebo spektra 13. Spiny těchto atomových jader jsou ovlivňovány okolím. Provedení a interpretace výsledků je velmi složité a přístrojově náročné. (1 Å = 10 8 m) Rentgenostrukturní analýza (krystalografie) vyžaduje monokrystalu, zdroj rentgenových paprsků a detektor. protein v podobě A) Krystalovat proteiny je velmi náročná a složitá záležitost. apř. myoglobin krystaluje z roztoku 3 M síranu amonného. B) Zdroj rentgenového paprsku o vlnové délce 1, 54 Å se získá působením rychlých elektronů na měděnou destičku. ) Paprsek procházející rotujícím krystalem vytváří difrakční obrazec, který se zachytí detektorem. Z hustoty a intenzity difrakčních stop se sestavuje obrazec třírozměrné struktury proteinu. Do současnosti je známa struktura více jak proteinů. Koordináty struktur se shromažďují v Protein Data Bank (

109 Krystaly myoglobinu

110 Rentgenový difrakční snímek krystalu myoglobinu

111 Část mapy elektronové hustoty myoglobinu hem Získáno rentgenostrukturní analýzou

112 Základní pojmy imunologie Imunologické metody slouží k purifikaci proteinů, jejich lokalizaci v buňce a kvantifikaci. Imunologie je založena na tvorbě protilátky proti specifickému proteinu. Protilátka (také imunoglobulin, Ig) je protein syntetizovaný živočichy jako odezva na přítomnost cizí látky zvané antigen. Tento proces slouží jako obrana živočichů před infekcí. Protilátky vyvolávají tvorbu specifických antigenů. Antigeny mohou být proteiny, polysacharidy a nukleové kyseliny. Protilátka rozpoznává specifické skupiny aminokyselin na velké molekule antigenu. Toto místo se nazývá antigenní determinant nebo epitop. Malé cizí molekuly jako syntetické peptidy mohou také vyvolávat tvorbu protilátek. azývají se hapteny.

113 Struktura protilátky IgG se skládá ze čtyř řetězců. Dvou těžkých (heavy, ) a dvou lehkých (light, L) spojených disulfidovými vazbami. Těžké a lehké řetězce tvoří doménu, kterámána koncích vazebnámísta pro antigen. Vazebné místo antigenu Vazebné místo antigenu S S S S Lehký řetězec (L) S S Těžký řetězec ()

114 Polyklonální a monoklonální protilátky. Většina antigenů má více epitopů. Polyklonální protilátky jsou proto heterogenní směsí protilátek, kde je každá specifická na různé epitopy antigenu. Monoklonální protilátky jsou všechny identické produkované klony jednotných protilátky produkujících buněk. Rozpoznávají jeden epitop. Polyklonální protilátky Monoklonální protilátky

115 Využití tvorby protilátek ke kvantifikaci proteinů na bázi testů ELISA (EnzymeLinked ImmunoSorbent Assay) A) epřímá ELISA se využívá k detekci přítomnosti protilátek (např. k detekci infekce IV). Princip: Antigen (virový protein) se naváže na stěny zkumavky. Pacientovo sérum obsahující protilátky se nechá navázat na antigen. Přidají se specifické protilátky (živočišné) proti lidským protilátkám obsahující navázaný enzym (křenová peroxidasa). akonec se přidá substrát enzymu a vyvolá se barevná reakce. B) Sendvičová ELISA umožňuje jak detekci, tak kvantifikaci antigenu. Princip: a stěny zkumavky se naváže protilátka. Po přídavku krevního séra obsahujícího antigen. Antigen se naváže na protilátku. Přidáme druhou protilátku proti antigenu na které je navázán enzym (obvykle křenová peroxidasa). Po přídavku substrátu se objeví zbarvení úměrné množství přítomného antigenu.

116 EPŘÍMÁ ELISA E E S S Promytí Promytí Promytí E E Antigenem pokrytá kádina SEDVIČVÁ ELISA Specifická protilátka se váže na antigen Enzymem označená protilátka se váže na specifickou protilátku Po přídavku substrátu dochází k enzymové reakci za vzniku barevného produktu; rychlost tvorby barevného produktu je úměrná množství přítomné specifické protilátky E E E E Promytí Promytí Promytí S S Monoklonální protilátkou pokrytá kádina Antigen se váže na protilátku Druhá enzymem označená monoklonální protilátka se váže na imobilizovaný antigen Po přídavku substrátu dochází k enzymové reakci za vzniku barevného produktu; rychlost tvorby barevného produktu je úměrná množství přítomného antigenu

117 Metoda Western blotting umožňuje detekovat malá množství proteinů gelovou elektroforézou. Po elektroforéze se zkopírují proteiny na list polymeru, kde reagují s radioaktivní protilátkou. Pás odpovídající proteinu na který se navázala protilátka se objeví na autoradiogramu. Protein reagující s protilátkou Proteinový band detekovaný specifickou protilátkou Přenos proteinů Přídavek radioaktivně značené specifické protilátky Překrytí fotografickým filmem Promývání do odstranění nenavázanené protilátky Exponování a vyvíjení SDSpolyakrylamidový gel Polymerní list Polymerní list je vystaven protilátce Autoradiogram