Biochemie I. Aminokyseliny a peptidy

Transkript

1 Biochemie I Aminokyseliny a peptidy

2 Aminokyseliny a peptidy (vlastnosti, stanovení a reakce)

3 AMINOKYSELINY Když se řekne AK ( -COOH, -NH 2 nebo -NH-) prostorový vztah aminoskupiny a karboxylové skupiny: - (=2-), -(=3-)... -(= poslední) -alanin: H 3 N-CH 2 -CH 2 -COO - -aminobutyrát (GABA): H 3 N-CH 2 -CH 2 -CH 2 -COO -

4 AMINOKYSELINY -aminokyseliny: konfigurace (podle Fischera) COO - COO - D: H C L: C H R R Kódované aminokyseliny (20): -aminokyseliny (kromě prolinu NH 2 skupina zabudována do cyklu)). Alfa = aminoskupina na uhlíku, který nese karboxylovou skupinu.

5 AMINOKYSELINY L- -aminokyseliny: kódované (= proteinogenní, viz dále) nekódované: - odvozené od kódovaných aminokyselin -Tyr katecholaminy (dopamin, adrenalin, tyroxin...) -vzniklé modifikacemi bílkovin (posttranslační modifikace) - metabolické meziprodukty (ornithin, citrulin)

6 Kódované aminokyseliny: Polarita: N (nepolární), P (neutrální polární), K (kyselá) a Z (zásaditá). Esenciální: pro člověka Název / zkratka Vzorec Polarita Esenciální Glycin COO - Gly H C H N N Alanin COO - Ala N N H C CH 3 OO Valin C - CH 3 Val H C H C N E CH 3 Leucin COO - CH H 3 Leu H C CH 2 C N E CH 3

7 Kódované aminokyseliny: Polarita: N (nepolární), P (neutrální polární), K (kyselá) a Z (zásaditá). Esenciální: pro člověka Název / zkratka Vzorec Polarita Esenciální Isoleucin Ile Prolin Pro Fenylalanin Phe H COO - C HC CH 3 COO - CH H C 2 CH H 2 N 2 CH 2 COO - H C CH 2 CH 2 CH 3 N N N E N E Tyrosin Tyr C COO- H CH 2 OH P N Tryptofan Trp COO - H C CH 2 N H N E

8 Kódované aminokyseliny: Polarita: N (nepolární), P (neutrální polární), K (kyselá) a Z (zásaditá). Esenciální: pro člověka Název / zkratka Vzorec Polarita Esenciální Histidin His Z N Serin COO - NH CH H C CH 2 C NH CH COO - Ser H C CH 2 OH P N Threonin CH 3 H C CH Thr P E COO - COO - COO - OH Cystein Cys H C CH 2 SH P N Methionin H C CH 2 CH S CH Met 2 3 N E

9 Kódované aminokyseliny: Polarita: N (nepolární), P (neutrální polární), K (kyselá) a Z (zásaditá). Esenciální: pro člověka Název / zkratka Vzorec Polarita Esenciální Lysin H C CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 NH Lys 3 Z E COO - COO - Arginin NH 2 H C CH 2 CH 2 CH 2 HN C Arg Z N Asparagová kyselina Asp Glutamová kyselina Glu NH 2 COO - H C CH 2 COO - COO - H C CH 2 CH 2 COO - Asparagin H C CH 2 CONH 2 Asn P N COO - COO - Glutamin H C CH 2 CH 2 CONH 2 Gln P N K K N N

10 Naučit se AK včetně označení hmotnosti v Tab jsou uváděny o 18 nižší, tedy takové jaké jsou v bílkovinném řetězci

11 Rozdělení podle chemické povahy postranních řetězců Funkční skupiny: Alifatické Aromatické Hydroxylové Sulfhydrylové Kyselé Basické Polární Nepolární

12 Hydrofobní aminokyseliny

13 Polární aminokyseliny

14 Kyselé aminokyseliny

15 Bazické aminokyseliny

16 Větvené aminokyseliny leucin, valin, izoleucin energetické substráty nezbytné v těžkých stavech (sepse, polytraumata) součástí specializovaných roztoků aminokyselin

17 Kódované aminokyseliny: Jednopísmenkové zkratky Proč jsou v tabulce vzorce s náboji? obojetné ionty = amfionty COO - H C H celkový náboj amfiontu: součet všech nábojů (pro Gly v ph 7 = 2) volný náboj amfiontu: algebraický součet nábojů (pro Gly v ph 7 = 0)

18 Úvod do teorie elektrolytické disociace: kyselina: HA H A - např. CH 3 -COOH H CH 3 -COO - termodynamická disociační konstanta K a a H a. a HA A zdánlivá K A H HA A - přičemž K K a A H. HA A

19 Úvod do teorie elektrolytické disociace: báze: B H 2 O BH OH - např: CH 3 -NH 2 H 2 O CH 3 - OH - bazická zdánlivá disociačníkonstanta: ale: K w = [H ]. [OH - ] a tedy: [ OH ] po spojení: K B BH [H 2 O] zahrnu do konstanty a vypočtu 1/K B : K w B.[ H ].[ H 2O] K B BH K [ H ] OH - B.[ H 2O] w B][ H 1 K B BH.[ Kw] Kyselá disociační konstanta K A ionisované formy báze B (např. CH 3 - ) je tedy rovna: KW K A K B

20 KYSELÉ DISOCIAČNÍ KONSTANTY pk A SKUPIN VYSKYTUJÍCÍCH SE V BÍLKOVINÁCH -COOH, -COOH imidazolium -SH - fenol - guanidinium 2,5 4,0 6,0 8,3 9,5 10,1 10,5 12,5

21 Hodnoty pk A disociovatelných skupin v aminokyselinách a bílkovinách (25 o C) Funkční Aminokyselin Hodnoty pk A nalezené Hodnoty pk A skupina a ve volných nalezené aminokyselinách v bílkovinách -karboxylová C-koncová 1,7-2,6 1,8-3,6, - karboxylová Asp, Glu 3,86; 4,25 3,0-4,7 imidazolová His 6,0 5,6-7,0 -aminová N-koncová 8,8-10,7 7,9-10,6 -aminová Lys 10,53 9,4-11,0 sulfhydrylová Cys 8,33 8,3-8,6 fenolová Tyr 10,07 9,8-10,8 guanidylová Arg 12,48 11,6-12,6

22 TITRAČNÍ KŘIVKY SLABÝCH KYSELIN Mám roztok slabé kyseliny. Jak se bude měnit ph, když budu přidávat NaOH? K A H HA A - Na začátku: jen HA, množství A - odpovídá množství přidaného louhu. H K HA A - A převedeme na ph: (Hendersonova - Hasselbalchova rovnice) ph pk A log A HA

23 TITRAČNÍ KŘIVKY SLABÝCH KYSELIN

24 Titrační křivka glycinu

25 COO - OO - H C CH 2 CH 2 C COO - H C CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 COO - NH CH H C CH 2 C NH CH

26 Cystin = cystinylcystein

27 ph Titrační křivka cystindihydrochloridu [NaOH]/[cystin.2HCl]

28 ISOELEKTRICKÝ BOD DEFINICE: ph, při němž se amfiont nepohybuje ve stejnosměrném elektrickém poli (interakce s dalšími ionty, závisí na prostředí - pufr); označujeme pi Isoionický bod: ph, při němž je v destilované vodě volný náboj iontu nulový.

29 ISOELEKTRICKÝ BOD př.: Gly (titruji Gly.HCl) K COOH A1 COO - K A2 COO - H C H H C H H C H NH 2 Z = 1 (Gly 1 ) 0 (Gly ) -1 (Gly -1 ) ph pk A1 log [ Gly ] ph pk Gly A2 Gly log [ ] Gly 2 ph pk pk A1 A2 Gly log [ ] Gly Ale v ph = pi platí: [Gly 1 ] = [Gly -1 ] takže: pi ( pk pk ) / A1 A2 2

30 Více disociovatelných skupin: rozhodují ty, které "sousedí" s pi (nutno načrtnout titrační křivku) Pro polyionty (např. bílkoviny) tuto rovnici nelze použít (příliš mnoho pk A v okolí pi) Isoelektrické body kódovaných aminokyselin AK pi AK pi AK pi AK pi Gly 6,0 Ser 5,7 Phe 5,5 His 7,6 Ala 6,0 Thr 5,6 Tyr 5,7 Lys 9,6 Val 6,0 Cys 5,0 Trp 5,9 Arg 10,8 Leu 6,0 Met 5,7 Asn 5,4 Asp 3,0 Ile 6,0 Pro 6,4 Gln 5,6 Glu 3,2

31 absorbance OPTICKÉ VLASTNOSTI Absorpce UV záření: aromatické (především Tyr a Trp) u 280 nm Absorpční spektra 1: hovězího sérového albuminu (1 mg/ml), 2: lidského imunoglobulinu (1 mg/ml) a 3: DNA (0,1 mg/ml), optická délka kyvety 1 cm. Optická aktivita: konfigurace (nesouvisí přímo se smyslem rotace) 1,6 1,4 1, ,8 0,6 0,4 1 0, vlnová délka [nm]

32 Chemické reakce AK Stanovení AK (reakce aminoskupin): ninhydrin, Sangerovo činidlo, dansylchlorid

33 Chemické reakce AK Reakce postranních řetězců: modifikační reakce - různá specifita např. R2 R2 CO CO H C CH 2 OH I 2 H C CH 2 OH NH R1 NH R1 I značení bílkovin radioaktivním jodem R2 R2 CO CO H C C H 2 SH ICH 2 -CONH 2 H C C H 2 SCH 2 -CONH 2 HI NH NH R1 R1 blokování SH skupin (proti oxidaci a vzniku disulfidových můstků)

34 Chemické reakce AK Nejdůležitější reakce (hypothetická): vznik peptidové vazby H 3 N CH R1 COO - N CH COO - H N CH OO - 3 C NH CH C H 3 R2 R1 O R2

35 Chemické reakce AK

36 Chemické reakce AK

37 Nomenklatura peptidů N- konec (začátek), C-konec (konec) acylaminokyseliny, např. Gly.Ala.His = glycylalanylhistidin Pozor: Ala.Tyr Tyr.Ala O O H 3 N CH C CH 3 NH CH H 2 C OO - C H N CH C NH CH COO - 3 C H 2 CH 3 OH OH

38 PŘIROZENÉ PEPTIDY Zvláštnosti struktury: nekódované aminokyseliny (ornithin, -alanin...) často i D-aminokyseliny někdy i tzv. -peptidové vazby (Glu) cyklické struktury (laktamy, disulfidové vazby) větvené struktury blokování konců (pyroglutamát, glycinamid)

39 Biosynthesa meziprodukty odbourávání bílkovinných prekursorů synthesa pomocí speciálních enzymových reakcí (ne na ribosomech cestou protheosynthesy)

40 Skupiny přirozených peptidů di a tripeptidy (glutathation, umělý aspartám...) peptidové hormony (oxytocin, vasopresin...přechod k proteohormonům) neuromodulátory: enkefaliny (pentapeptidy), endorfiny (15-32 AK) peptidová antibiotika (mnoho nekódovaných AK) peptidové zoo- a fytotoxiny (hadi, štíři, apamin, falloidiny a amanitiny: Amanita phalloides) protaminy (malé bazické lineární peptidy, mlíčí ryb) polyaminokyseliny (buněčné stěny bakterií: poly- -L-Glu, poly- -D-Glu)

41 Skupiny přirozených peptidů

42 URČOVÁNÍ CELKOVÉHO AMINOKYSELINOVÉHO SLOŽENÍ AK 1 -AK 2 -AK 3...AK n kyselá nebo bazická hydrolysa AK 1 AK 2 AK 3... AK n (určit kvalitativní i kvantitativní jednotlivé aminokyseliny - chromatografické dělení)

43 URČOVÁNÍ SEKVENCE AMINOKYSELIN V ŘETĚZCI Edmanovo odbourávání

44 URČOVÁNÍ N-KONCOVÉ AMINOKYSELINY Sangerova reakce

45 URČOVÁNÍ N-KONCOVÉ AMINOKYSELINY Edmanovo odbourávání

46 SYNTHESA PEPTIDŮ in vitro a) aktivace (aktivní estery, anhydridy, azidy, karbodiimidová synthesa) b) blokování skupin, které nemají reagovat c) synthesa peptidové vazby d) odblokování Q HN O CH " CO-X OO - H 3 N CH " C H 3 N CH " C NH CH " COO - R1 R10 R2 R10 R1 R10 R2 R10 HX

47 Chromatografické metody pro separaci proteinů Gelová chromatografie Ionexová chromatografie Chromatografie s hydrofóbní interakcí Afinitní chromatografie

48 Ionexová chromatografie Určena pro separaci látek nesoucích kladný nebo záporný náboj Afinita iontů k ionexu závisí na velikosti náboje V případě proteinů hraje zásadní roli ph! Celulosové a dextranové ionexy

49 Ionexy Katexy záporný náboj vazba kationtů silné sulfo (S), sulfopropyl(sp) OSO 3 - slabé karboxy (C), karboxymethyl (CM) COO - Anexy kladný náboj vazba aniontů slabé diethylaminoethyl (DEAE) silné triethylaminoethyl (TEAE)

50 Ionexová chromatografie proteinů Náboj bílkoviny závisí na ph prostředí a isoelektrickém bodu bílkoviny ph < pi bílkovina nese kladný náboj separace na katexu ph > pi bílkovina nese záporný náboj separace na anexu ph = pi celkový náboj bílkoviny je nulový nelze provést ionexovou chromatografii

51 Ionexová chromatografie Nanášení vzorku nízká iontová síla Eluce gradientová Zvyšováním iontové síly Změnou ph Použití purifikace a zakoncentrování proteinu, výměna pufru

52 Typická ionexová chromatografie Loading ends, Low salt wash begins 1M Salt gradient Protein absorbance 0 Loading starts Peak of unbound protein Salt gradient begins I II III Salt gradient ends Eluted peaks of weakly bound (I), moderately bound (II) and tightly bound (III) proteins

53

54 Příklad 1 Roztok obsahující kyselinu asparagovou (pi = 2,98), glycin (pi = 5,97), threonin (pi = 6,53) a lysin (pi = 9,74) v citrátovém pufru ph 3,0 byl nanesen na sloupec Dowex-50 (katex). V jakém pořadí tyto aminokyseliny ze sloupce vytekly? COO - H C CH 2 COO - H COO - C H H COO - C CH CH COO - 3 OH H C CH 2 CH 2 CH 2 CH 2

55 Příklad 2 Na sloupec DEAE-celulosy (anex) byl nanesen vzorek obsahující sérový albumin, ureasu a chymotrypsinogen (isoelektrické body pi jsou 4,9; 5,4 a 9,5) v pufru ph 7,0. V jakém pořadí tyto aminokyseliny ze sloupce vytekly?